摘 要：工業(yè)大麻的生長(zhǎng)和發(fā)育情況對(duì)藥用成分的含量、纖維品質(zhì)和產(chǎn)量均有較大的影響。隨著數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法、數(shù)量遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到工業(yè)大麻的生長(zhǎng)發(fā)育研究中，可以在分子水平上明確不同品種的遺傳背景、變異規(guī)律、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控因素等，從而加快對(duì)工業(yè)大麻各種性狀的研究進(jìn)程。本研究全面介紹了分子標(biāo)記技術(shù)在工業(yè)大麻研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀、全基因組關(guān)聯(lián)分析、特異性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)等研究工作，簡(jiǎn)要講述了分子標(biāo)記輔助選擇的優(yōu)越性，探討了分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展方向和潛力，為工業(yè)大麻種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：工業(yè)大麻；分子標(biāo)記；全基因組關(guān)聯(lián)分析；特異性標(biāo)記
大麻(Cannabis sativa L.)是大麻屬一年生直立草本植物，雌雄異株，按THC的含量分為藥用型、中間型和纖維型(工業(yè)大麻)，具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。工業(yè)大麻中所含有的CBD具有抗炎、殺菌、鎮(zhèn)痛、減輕精神疾病、抗氧化等功效，可用于治療焦慮和睡眠障礙、止痛消炎、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤和保護(hù)血管等方面疾病(寧康等,2020)；除此以外，工業(yè)大麻的纖維是各種植物纖維中最細(xì)軟的一種，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)具有吸濕排汗、阻擋紫外線輻射、避免靜電、耐熱、抗霉殺菌等功能；工業(yè)大麻籽油富含不飽和脂肪酸和植物甾醇，可以降低膽固醇、抗氧化、清除人體內(nèi)自由基等功效，屬于高利用價(jià)值的功能性油脂(盧延旭等,2007)。
工業(yè)大麻的農(nóng)藝性狀(即纖維含量,植株性別等)、品種類型均為目前工業(yè)大麻育種和法醫(yī)學(xué)研究的主要方向，為了研究結(jié)果更加精準(zhǔn)、快速，隨著多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法、數(shù)量遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到工業(yè)大麻研究中，并且不斷更新?lián)Q代保障研究更加深入。迄今為止，研究方向主要有品種類型鑒定、遺傳多樣性分析、性別鑒定、種質(zhì)資源鑒定、全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)以及特異性標(biāo)記開(kāi)發(fā)等，本綜述將對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)在工業(yè)大麻研究中的應(yīng)用和發(fā)展前景進(jìn)行介紹。
1分子標(biāo)記技術(shù)在工業(yè)大麻中的應(yīng)用進(jìn)展
分子標(biāo)記技術(shù)種類繁多，在工業(yè)大麻研究中的應(yīng)用主要有以下幾種：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(restriction fragment length polymorphism,RFLP)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù)(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD )和序列特征化擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記技術(shù)(sequence characterized amplified region,SCAR)，簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記技術(shù)(simple sequence repeat, SSR)、短串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記技術(shù)(short tandem repeats,STR)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)標(biāo)記技術(shù)(inter-simple sequence repeat,ISSR)，以及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(amplified fragment length polymorphism,AFLP)。
1.1RFLP分子標(biāo)記
RFLP是第一個(gè)被應(yīng)用于遺傳研究的DNA分子標(biāo)記，其原理是利用限制性內(nèi)切酶酶解后，得到差異性片段與發(fā)生形態(tài)分離的數(shù)據(jù)相結(jié)合，進(jìn)而構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，使間接選擇簡(jiǎn)單易行。RFLP標(biāo)記在生物體內(nèi)廣泛存在，且數(shù)目無(wú)限可覆蓋整個(gè)基因組、結(jié)果穩(wěn)定可靠。RFLP主要應(yīng)用于構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位、遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)鑒定和遺傳背景分析，在工業(yè)大麻的研究中重要用來(lái)進(jìn)行藥用型品種的鑒定。
Cirovic等(2017)使用RFLP方法，對(duì)20種藥用大麻樣品和3種工業(yè)大麻樣品進(jìn)行了THCA(tetrahydrocannabinolic acid)合成酶基因活性的分析，發(fā)現(xiàn)藥用大麻樣品均為活性拷貝，其中16種為雜合子，工業(yè)大麻品種均為純合的非活性拷貝，據(jù)此建立了一個(gè)快速而準(zhǔn)確的大麻樣品法醫(yī)學(xué)分析算法，可解答分析樣品是否能夠產(chǎn)生濃度高于0.3%的THC (Δ-9-tetrahidrocanabinol)的問(wèn)題。但在RFLP的操作過(guò)程中，對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求較高，且須使用放射性同位素進(jìn)行分子雜交、酶切等，步驟較為繁瑣。
1.2RAPD和SCAR分子標(biāo)記
RAPD標(biāo)記技術(shù)是通過(guò)分析遺傳物質(zhì)DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的多態(tài)性來(lái)確定生物體內(nèi)在基因排布與外在性狀表現(xiàn)規(guī)律的技術(shù)。在植物學(xué)研究中，RAPD標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)用于遺傳資源保存和分類、遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、品種純度鑒定和雜交育種、突變檢測(cè)、基因標(biāo)記和基因組比較等。其所用引物無(wú)種屬限制、不需要探針，操作簡(jiǎn)便。RAPD標(biāo)記技術(shù)在大麻研究中較多的應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性、品種鑒定和產(chǎn)地溯源、遺傳變異分析、性別鑒定和SCAR標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面。
湯志成等(2013)通過(guò)RAPD技術(shù)對(duì)12份野生型和4份栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，將16份種質(zhì)資源分成3個(gè)類群，與表型聚類結(jié)果相同；篩選出14條引物可以擴(kuò)增出79條多態(tài)性條帶，表明我國(guó)野生大麻遺傳變異較復(fù)雜。陳璇等(2015)對(duì)云南5個(gè)工業(yè)大麻品種進(jìn)行RAPD和ISSR分子標(biāo)記鑒定，共得到多態(tài)性位點(diǎn)64個(gè)，品種間遺傳相似系數(shù)為0.8749-0.9255，即5個(gè)品種間遺傳多樣性較小，可為育種群體的選擇提供依據(jù)。黃艷梅等(2013)對(duì)國(guó)內(nèi)4省6地100株工業(yè)大麻樣品進(jìn)行RAPD和ISSR引物擴(kuò)增，所得到的多態(tài)性條帶所占比率分別為51.9%和57.9%，結(jié)果可用來(lái)鑒定大麻種類和產(chǎn)地溯源。姜穎等(2017)對(duì)經(jīng)過(guò)化學(xué)誘變和物理誘變的工業(yè)大麻材料進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果顯示Co60-γ誘變劑量在100-150 Gy之間、2% EMS誘變劑處理6 h的條件下后代發(fā)生突變幾率較高。
由于RAPD標(biāo)記技術(shù)利用單條引物擴(kuò)增多個(gè)基因位點(diǎn)導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，可將具有多態(tài)性的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，設(shè)計(jì)一對(duì)稍長(zhǎng)且互補(bǔ)的的引物將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。陳其軍等(2001)用30個(gè)RAPD引物對(duì)10株工業(yè)大麻雌株和10株雄株進(jìn)行分析，最后篩選出1個(gè)與性別相關(guān)的特異性引物，并通過(guò)片段克隆和序列分析將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。李仕金等(2012)選用200條RAPD引物在云麻1號(hào)中擴(kuò)增出一條大麻雄性相關(guān)的特異性條帶，并將該條RAPD引物轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記。趙銘森等(2019)通過(guò)3個(gè)已有的工業(yè)大麻雄性相關(guān)標(biāo)記開(kāi)發(fā)出6個(gè)SCAR標(biāo)記，其中1個(gè)標(biāo)記MADC2-8在123份已知性別的工業(yè)大麻樣本材料群體中進(jìn)行驗(yàn)證，準(zhǔn)確性達(dá)98.34%。姜穎等(2019)通過(guò)RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)一個(gè)工業(yè)大麻品種的雌雄株進(jìn)行引物篩選，獲得1條與雄性相關(guān)的特異性條帶，以此設(shè)計(jì)2個(gè)SCAR標(biāo)記引物，可對(duì)苗期性別未知的植株進(jìn)行預(yù)測(cè)應(yīng)用。趙艷紅等(2021)在560對(duì)相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)標(biāo)記引物中篩選出24對(duì)雌雄差異相關(guān)引物，其中發(fā)現(xiàn)1個(gè)引物擴(kuò)增出1條雄性相關(guān)的特異性條帶，將該引物作為基礎(chǔ)，向兩端延伸2-3個(gè)堿基，獲得了一個(gè)新的與雄性相關(guān)的SCAR標(biāo)記。
1.3SSR和ISSR分子標(biāo)記
簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)和短串聯(lián)重復(fù)(STR)是一類由幾個(gè)堿基組成的基因序列串聯(lián)重復(fù)而形成的DNA序列，SSR標(biāo)記技術(shù)就是以這些長(zhǎng)度不同的片段在不同材料中的表現(xiàn)形式為基礎(chǔ)，研究其與表型之間的關(guān)系。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、高度重復(fù)性、高度多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)大麻研究中通常用來(lái)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、群體遺傳多樣性分析和遺傳學(xué)研究、系譜分析和作為法醫(yī)鑒定工具。此外，為突破SSR標(biāo)記的一些限制性因素，將SSR序列兩端隨機(jī)添加2-4個(gè)核苷酸，形成簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)(ISSR)，ISSR的引物設(shè)計(jì)相對(duì)SSR則較為簡(jiǎn)單且更具專一性，在應(yīng)用方面更是兼具RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)。
信朋飛等(2014)通過(guò)NCBI中大麻EST數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)49對(duì)SSR引物，篩選出29對(duì)多態(tài)性引物，并選擇其中的7對(duì)引物對(duì)所研究的24份材料構(gòu)建了SSR指紋圖譜。張慶瀅等(2017)通過(guò)篩選出的9條ISSR引物對(duì)96個(gè)遼寧科爾沁沙地野生大麻自然群居個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，最終確定樣本量在多于25個(gè)時(shí)可以較好代表該群體的遺傳多樣性水平。Marcello等(2021)從41個(gè)nSSR(nuclear SSR)標(biāo)記中篩選出20個(gè)高度多態(tài)性和鑒別位點(diǎn)，對(duì)11個(gè)工業(yè)大麻品種的104個(gè)個(gè)體進(jìn)行了測(cè)試。選擇的標(biāo)記能夠成功地評(píng)估品種內(nèi)部和品種間的純合性、遺傳一致性和遺傳變異?；谛詣e表現(xiàn)(雌雄異株和雌雄同株)和地理起源，群體結(jié)構(gòu)分析確定了八個(gè)遺傳類群。張慶瀅等(2018)利用篩選出的19對(duì)EST-SSR引物構(gòu)建了30個(gè)工業(yè)大麻品種的指紋圖譜，這30個(gè)大麻品種包含22份野生型和8份栽培品種，共檢測(cè)到235個(gè)等位變異，被分成南、北兩個(gè)類群顯示出地域性分布，但親緣關(guān)系比較相近。Dufresnes(2017)利用13個(gè)STRs標(biāo)記將1324個(gè)樣本分為24個(gè)工業(yè)大麻品種和15個(gè)藥用型品種，可用于法醫(yī)學(xué)鑒定。
1.4AFLP分子標(biāo)記
AFLP是通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA后，所得片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)多態(tài)性的一種DNA指紋分析技術(shù)，兼具RFLP標(biāo)記的可靠性和高效性的同時(shí)，更加快速、靈敏、穩(wěn)定。目前，AFLP標(biāo)記技術(shù)主要在工業(yè)大麻的遺傳多樣性分析、品種分類和產(chǎn)地溯源、性別鑒定方面應(yīng)用較多。
胡尊紅等(2012)利用AFLP進(jìn)行的工業(yè)大麻品種多樣性分析表明，云南地區(qū)的群體遺傳多樣性水平較高，其次是黑龍江群體；四川和廣西群體遺傳一致程度最高；云南、貴州和四川群體一致程度趨于中間水平；甘肅和山西群體一致度最低，表明工業(yè)大麻遺傳變異較大。呂佳淑等(2010)選用64對(duì)AFLP引物對(duì)10個(gè)品種雌雄株混合的群體進(jìn)行篩選，在引物E-ACT/M-CTA擴(kuò)增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)一條與工業(yè)大麻雄性植株相關(guān)的特異性條帶，可用于早期性別鑒定。郭麗等(2015)選用AFLP技術(shù)對(duì)11個(gè)品種雌雄株混合的群體進(jìn)行篩選，共得到6對(duì)多態(tài)性引物，并在引物E-ACA/M-CTG擴(kuò)增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)一雄性相關(guān)特異性條帶，可用于早期性別鑒定。
2工業(yè)大麻全基因組關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用進(jìn)展
GWAS是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，在研究群體中利用一定數(shù)量的分子標(biāo)記進(jìn)行全基因組水平上的多態(tài)性分析，再與表型數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行研究的一種方法。GWAS的優(yōu)勢(shì)在于所用群體為富含基因資源的自然群體，分辨率高，研究周期短。隨著研究深入細(xì)化，GWAS在大麻中的應(yīng)用除了進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，還用于重要農(nóng)藝性狀相關(guān)位點(diǎn)和候選基因的挖掘，如CBD和THC合成途徑、性別發(fā)育、纖維素品質(zhì)等相關(guān)基因的挖掘研究。
陳璇等(2018)對(duì)野生型和栽培型工業(yè)大麻進(jìn)行全基因組測(cè)序，檢測(cè)到226萬(wàn)多個(gè)SNP位點(diǎn)，這兩個(gè)品種的雜合度分別為0.12%和0.11%，二等位多態(tài)性SNP分為4種類型，親本純合、雜合類型SNP分別占46.32%、53.47%，因此以當(dāng)前狀態(tài)下兩種類型品種即可構(gòu)建遺傳分離群體。
Van等(2011)對(duì)藥用大麻基因組DNA和RNA進(jìn)行測(cè)序，報(bào)告了一個(gè)534 Mb的單倍體基因組序列草圖和一個(gè)30000個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄組。通過(guò)對(duì)藥用型和工業(yè)用大麻品種轉(zhuǎn)錄組的比較發(fā)現(xiàn)，藥用型大麻表達(dá)更多的編碼大麻素和前體蛋白的基因，藥用型大麻轉(zhuǎn)錄組中只有四氫大麻酸合成酶，而工業(yè)用大麻中的四氫大麻酸合成酶被大麻二酚酸合成酶取代了，以此表明THC是在藥用型大麻中生成的，而不是在工業(yè)大麻中。Gao等(2018)采用RNA-seq 技術(shù)，研究了工業(yè)大麻在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組變化。共鑒定出差異表達(dá)基因1292個(gè)，其中上調(diào)基因409個(gè)(31.66%)，下調(diào)基因883個(gè)(68.34%)，并用qRT-PCR方法對(duì)12個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了驗(yàn)證，GO和KEGG分析顯示NAC、B3、過(guò)氧化物酶、膨脹素和肌醇加氧酶等可能在抗旱中起重要作用，11個(gè)KEGG途徑受到顯著影響，其中影響最大的是含有15個(gè)差異表達(dá)基因的植物激素/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在干旱和ABA誘導(dǎo)條件下，脫落酸途徑相關(guān)基因的表達(dá)模式相似，說(shuō)明脫落酸在抗旱脅迫中起重要作用。Kaitlin等(2019)通過(guò)藥用大麻和工業(yè)大麻雜交得到的物理和遺傳圖譜地圖顯示，大麻素生物合成基因通常是不連鎖的，但是芳香烯基轉(zhuǎn)移酶(ap)為T(mén)HCA和CBDA合成酶提供底物，與已知的大麻素含量標(biāo)記緊密連鎖。Zhang等(2018)利用大麻基因組和轉(zhuǎn)錄組鑒定了不同大麻品種LBD基因家族，并分析其表達(dá)模式。結(jié)果顯示，大麻L(zhǎng)BD包含32個(gè)成員，分為兩大類，七個(gè)亞科，不均勻的分布在10條染色體上。該基因的上游啟動(dòng)子區(qū)含有多種與植物激素和環(huán)境因子有關(guān)的順式作用元件，不同品種(低四氫大麻酚、高大麻二醇)的莖、葉和花中的順式作用元件表達(dá)模式不同。Lbd基因家族成員主要表達(dá)在兩個(gè)品種的花和莖中，成員在葉片中表達(dá)極少，這些基因可能參與大麻的生長(zhǎng)和發(fā)育，并影響大麻素的生物合成。Ren等(2021)使用110個(gè)來(lái)自世界各地的大麻材料進(jìn)行全基因組重測(cè)序，證明了現(xiàn)在所有的工業(yè)型和藥用品種都是從一個(gè)祖先的基因庫(kù)中分離出來(lái)的，這個(gè)基因庫(kù)目前以中國(guó)的野生品種和地方品種為代表，分析了與工業(yè)型和藥用品種鑒別相關(guān)的候選基因，包括分枝模式和纖維素/木質(zhì)素生物合成，發(fā)現(xiàn)在選擇增加纖維產(chǎn)量或精神活性的過(guò)程中，參與大麻素合成的基因功能喪失。
Petit等(2020)采用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法，對(duì)大麻開(kāi)花時(shí)間和性別決定的遺傳建成進(jìn)行研究。使用SNP標(biāo)記對(duì)123份大麻材料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)8個(gè)QTLs，其中6個(gè)與開(kāi)花時(shí)間相關(guān)、兩個(gè)2個(gè)與性別相關(guān)。這些QTLs覆蓋了基因組區(qū)域，預(yù)測(cè)有33個(gè)轉(zhuǎn)錄本參與開(kāi)花和性別決定。在開(kāi)花時(shí)間性狀的QTLs中發(fā)現(xiàn)了與光感知和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，以及調(diào)控開(kāi)花的轉(zhuǎn)錄因子。在性別決定的QTLs中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)植物激素(特別是生長(zhǎng)素和赤霉酸)平衡的基因。同年，Petit等(2020)利用相同的群體材料，研究了與纖維品質(zhì)相關(guān)的7個(gè)細(xì)胞壁性狀和韌皮纖維性狀的遺傳基礎(chǔ)。使用RAD-seq對(duì)大麻纖維板進(jìn)行基因分型，SNP標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，對(duì)不同纖維品質(zhì)性狀的16個(gè)QTL進(jìn)行了定位，包括葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖、木質(zhì)素和韌皮纖維含量，以及12個(gè)候選基因，它們可能參與了單糖、多糖和木質(zhì)素的生物合成和修飾，在大麻纖維品質(zhì)的決定中起著重要作用。Hua等(2022)在工業(yè)大麻全基因組水平鑒定了WRKY基因家族中39個(gè)CasWRKYs，分析了它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體位置、順式作用元件、基因結(jié)構(gòu)、保守序列和表達(dá)模式。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析，將CasWRKY蛋白分為3個(gè)群和7個(gè)亞群，CasWRKY啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控因子含有多種順式調(diào)控元件，其中P-box順式調(diào)控元件的頻率較高，說(shuō)明CasWRKY對(duì)赤霉素的調(diào)控具有一定的反應(yīng)性。又通過(guò)RNA-seq和qRT-PCR表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，13個(gè)CasWRKY基因?qū)A3脅迫作出反應(yīng)，影響纖維發(fā)育，并在莖生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
3大麻特異性標(biāo)記開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展
針對(duì)特定的研究需要，學(xué)者們根據(jù)相應(yīng)的基因組區(qū)域或者CBD和THC相關(guān)基因序列，開(kāi)發(fā)出一系列特異性標(biāo)記用來(lái)鑒定群體特征和CBD及THC的合成規(guī)律，這些標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和使用成本比較低廉，且檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速、靶向性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好。
Zhang等(2018)在葉綠體5個(gè)高頻突變區(qū)間，開(kāi)發(fā)了5個(gè)特異性標(biāo)記，對(duì)52份大麻樣品(25個(gè)野生種群和27個(gè)栽培種群)中的645個(gè)個(gè)體進(jìn)行了單倍群的鑒定，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)單倍群具有明顯的高、中、低緯度梯度分布格局，首次揭示了低緯度單倍群是最早的分支，這意味著大麻可能起源于低緯度地區(qū)。
陳璇等(2016)根據(jù)THCAS和CBDAS基因多態(tài)性，設(shè)計(jì)了一個(gè)共顯性復(fù)合PCR分子標(biāo)記，通過(guò)對(duì)我國(guó)不同來(lái)源地的23份大麻種質(zhì)資源共69個(gè)單株材料中THC和CBD含量特征及其關(guān)鍵合成酶基因多態(tài)性進(jìn)行分析，鑒定了我國(guó)大麻種質(zhì)資源的大麻素化學(xué)型及基因型。Garfinkel(2021)利用兩個(gè)雜交群體，一個(gè)是CBGA優(yōu)勢(shì)品種與THCA優(yōu)勢(shì)品種之間的雜交群體，另一個(gè)是CBGA優(yōu)勢(shì)品種與CBDA優(yōu)勢(shì)品種之間的雜交群體，進(jìn)行THCA合成酶基因的等位基因分析，最終發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP可能使合成酶無(wú)法將CBGA轉(zhuǎn)換為T(mén)HCA，從而導(dǎo)致CBGA的積累。Flavia等(2021)對(duì)一組基因型代表所有歐洲大麻化學(xué)類型的品種，開(kāi)發(fā)高度特異性的引物以精確區(qū)分不同的大麻素合酶基因，除了作為檢測(cè)基因組水平上CBCAS存在的標(biāo)記，還可以分析大麻的轉(zhuǎn)錄譜。研究表明，雖然THCAS和CBDAS的高轉(zhuǎn)錄水平清楚地反映了植物的化學(xué)表型，但CBCAS在所有基因型中的低但穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄水平表明這些基因是活躍的，可能對(duì)最終的大麻素含量有貢獻(xiàn)。
4展望
隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷優(yōu)化、改良、創(chuàng)新，其解決科學(xué)問(wèn)題的所屬領(lǐng)域也不斷擴(kuò)大、加深。由最開(kāi)始的構(gòu)建遺傳連鎖圖譜到鑒別品種類型、測(cè)定品系純度，再到種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、農(nóng)藝表型相關(guān)的候選基因挖掘、各種代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)分析等，分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用使育種家多年以來(lái)繁瑣的育種工作日益便捷。
在工業(yè)大麻研究中，研究學(xué)者比較關(guān)注的三個(gè)領(lǐng)域分別為法醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和遺傳育種學(xué)，即品種類型(藥用型和工業(yè)用型)、藥用成分含量、植株性別決定因素以及纖維素的品質(zhì)和含量。通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，一些與農(nóng)藝表型和生理生化特征相關(guān)的特異性標(biāo)記和候選基因相繼被發(fā)掘，為不同領(lǐng)域的鑒別和分析工作奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，此外，候選基因的發(fā)掘不僅可以在分子水平闡明各種代謝途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、拓展野生品種和栽培品種的遺傳基礎(chǔ)，還可以突破現(xiàn)有種質(zhì)資源瓶頸、使工業(yè)大麻種質(zhì)創(chuàng)新成為可能。
參考文獻(xiàn)
[1]Chen Q.J.,Han Y.Z.,Fu Y.F.,Zhao D.G.,Guo F.L.,Meng F.J.,and Liu W.P.,2001,RAPD and SCAR molecular markers of sexuality in the dioecious speciesCannabis sativa L.,Zhiwu Shengli Xuebao (Acta Phytophysiologica Sinica),27(2):173-178.(陳其軍,韓玉珍,傅永福,趙德剛,國(guó)鳳利,孟繁靜,劉衛(wèi)平,2001,大麻性別的RAPD和SCAR分子標(biāo)記,植物生理學(xué)報(bào),27(2):173-178.)
[2]Chen X.,Guo R.,Wan R.X.,Xu Y.P.,Zhang Q.Y.,Guo M.B.,Guo H.Y.,and Yang M.,2015,Genetic structure of five dioecious industrial hemp varieties in Yunnan,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),13(9):2069-2075.(陳璇,郭蓉,萬(wàn)睿璇,許艷萍,張慶瀅,郭孟璧,郭鴻彥,楊明,2015,云南省5個(gè)雌雄異株工業(yè)大麻群體遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià),分子植物育種,13(9):2069-2075.)
[3]Chen X.,Guo R.,Wang L.,Liu Y.H.,Guo M.B.,Xu Y.P.,Guo H.Y.,Yang M.,and Zhang Q.Y.,2018,SNP Analysis of wild and cultivated cannabis based on whole genome re-sequencing,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),16(3):893-897.(陳璇,郭蓉,王璐,柳延虎,郭孟璧,許艷萍,郭鴻彥,楊明,張慶瀅,2018,基于全基因組重測(cè)序的野生型大麻和栽培型大麻的多態(tài)性SNP分析,分子植物育種,16(3):893-897.)
[4]Chen X.,Xu Y.P.,Zhang Q.Y.,Guo M.B.,Guo R.,Yang M.,and Guo H.Y.,2016,Identification and assessment of chemotype and genotype of cannabinoids in Cannabis sativa L., Zhiwu Yichuan Ziyuan Xuebao (Journal of Plant Genetic Resources),17(5):920-928.(陳璇,許艷萍,張慶瀅,郭孟璧,郭蓉,楊明,郭鴻彥,2016, 大麻種質(zhì)資源中大麻素化學(xué)型及基因型鑒定與評(píng)價(jià),植物遺傳資源學(xué)報(bào),17(5):920-928.)
[5]Cirovic N.,Kecmanovic M.,Keckarevic D.,and Keckarevic M.M.,2017,Differentiation of Cannabis subspecies by THCA synthase gene analysis using RFLP,Journal of Forensic and Legal Medicine,51:81-84.
[6]Dufresnes C.,Jan C.,Bienert F.,Goudet J.,and Fumagalli L.,2017,Broad-scale genetic diversity of cannabis for forensic applications,PLoS One,12(1):e0170522.
[7]Flavia F.,Roberta P.,Massimo M.,Cinzia C.,Vincenzo C.,Laura B.,Anna M.,Ilaria A.,Nicola P.,Giuseppe C.,Giuseppe M.,2021,Analysis of sequence variability and transcriptional profile of cannabinoid synthase genes in Cannabis sativa L.chemotypes with a focus on cannabichromenic acid synthase,Plants, 10(9):1857.
[8]Gao C.S.,Cheng C.H.,Zhao L.N.,Yu Y.T.,Tang Q.,Xin P.F.,Liu T.M.,Yan Z.,Guo Y.,and Zang G.G.,2018,Genome-wide expression profiles of hemp (Cannabis sativa L.)in response to drought stress,Int.J.Genomics,2018:3057272.
[9]Garfinkel A.R.,Otten M.,and Crawford S.,2021,SNP in potentially defunct tetrahydrocannabinolic acid synthase is a marker for cannabigerolic acid dominance inCannabis sativa L.,Genes (Basel),12(2):228.
[10]Guo L.,Zhang H.J.,Wang M.Z.,Che Y.,Liu D.Q.,Chen J.S.,Liu D.F.,Yu J.D.,and Wu Y.K.,2015,Screening and identification of AFLP markers linked to male gene inCannabis sativa L.,Zhongguo Maye Kexue(Plant Fiber Sciences in China),37(1):5-8.(郭麗,張海軍,王明澤,車野,劉德泉,陳井生,劉德福,于吉東,吳耀坤,2015,大麻雄性基因連鎖AFLP分子標(biāo)記的篩選及鑒定,中國(guó)麻業(yè)科學(xué),37(1):5-8.)
[11]Hu Z.H.,Guo H.Y.,Hu X.L.,Chen X.,Liu X.Y.,Guo M.B.,Zhang Q.Y.,Xu Y.P.,Guo L.F.,and Yang M.,2012,Genetic diversity ofCannabis sativa L.based on AFLP analysis,Zhiwu Yichuan Ziyuan Xuebao (Journal of Plant Genetic Resources),13(4):555-561.(胡尊紅,郭鴻彥,胡學(xué)禮,陳璇,劉旭云,郭孟壁,張慶瀅,許艷萍,郭麗芬,楊明,2012,大麻品種遺傳多樣性的AFLP分析,植物遺傳資源學(xué)報(bào),13(4):555-561.)
[12]Hua W.W.,Chen S.Y.,Sylvain N.,Liu T.,Qi J.M.,and Zhang L.W.,2022,Genome-wide identification and expression analysis response to GA3 stresses of WRKY gene family in seed hemp (Cannabis sativa L),Gene,822:146290.
[13]Huang Y.M.,Yang Z.J.,Li N.,Zhang Y.,Zhang X.N.,Chang H.L.,Yang C.G.,and Pei L.,2013, Investigation of genetic diversity of hemp cultivars using RAPD and ISSR molecular markers,Zhongguo Fayixue Zazhi (Chin.J.Forensic Med.),28(2):100-103.(黃艷梅,楊志軍,李娜,張穎,張新寧,常海嶺,楊晨光,裴黎,2013,RAPD和ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)大麻的遺傳多樣性初探,中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,28(2):100-103.)
[14]Jiang Y.,Feng N.J.,Wang X.N.,Han X.C.,Han C.W.,Zhao Y.,Cao K.,Sun Y.F.,and Li Z.W.,2019,Screening and identification of male-specific RAPD and SCAR markers inCannabis sativa L.(Industrial Hemp),Zuowu Zazhi (Crops),(3):66-72.(姜穎,馮乃杰,王曉楠,韓喜財(cái),韓承偉,趙越,曹焜,孫宇峰,李振偉,2019,工業(yè)大麻雄性相關(guān)RAPD和SCAR標(biāo)記的篩選與鑒定,作物雜志,(3):66-72.)
[15]Jiang Y.,Zhang L.N.,Pan D.M.,Han C.W.,Wang X.N.,Cao K., Han X.C.,and Sun Y.F.,2017,RAPD analysis on mutagenic materials of industrial hemp (Cannabis sativa L.),Guangdong Nongye Kexue (Guangdong Agricultural Sciences),44(9):25-30.(姜穎,張麗娜,潘冬梅,韓承偉,王曉楠,曹焜,韓喜財(cái),孫宇峰,2017,RAPD分子標(biāo)記對(duì)工業(yè)大麻誘變材料的分析,廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),44(9):25-30.)
[16]Kaitlin U.L.,Jake M.S.,Mitchell J.S.,Hardik S.,Navdeep G.,Larry H.,Gintaras D.,Robert S.,Timothy R.H.,Jonathan E.P.,and Harm V.B.,2019,A physical and genetic map of Cannabis sativa identifies extensive rearrangements at the THC/CBD acid synthase loci,Genome Res.,29(1):146-156.
[17]Li S.J.,Xin P.R.,Guo H.Y.,and Yang M.,2012,Study of male-specific RAPD and SCAR marker inCannabis sativa L.,Guangdong Nongye Kexue (Guangdong Agricultural Sciences),39(24):151-154.(李仕金,辛培堯,郭鴻彥,楊明,2012,大麻雄性相關(guān)RAPD和SCAR標(biāo)記的研究,廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),39(24):151-154.)
[18]Lu Y.X.,Dong P.,Cui X.G.,Guo J.S.,and Wang Y.,2007,An approach for the analysis of pham acodynamic interactions and the simulation of combined response,Zhongguo Yaolixue Tongbao (Chinese Pharmacological Bulletin),23(8):1112-1114.(盧延旭,董鵬,崔曉光,郭建書(shū),汪巖,2007,工業(yè)大麻與毒品大麻的區(qū)別及其可利用價(jià)值,中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),23(8):1112-1114.)
[19]Lü J.S.,Zhao L.N.,Zang G.G,Cheng C.H.,Tang Q.,Li Y.J.,Yang M., and Guo H.Y.,2010,Screening of the AFLP markers linked to the sex locus of Cannabis sativa,Hunan Nongye Daxue Xuebao (Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences)),36(2):123-127.(呂佳淑,趙立寧,臧鞏固,程超華,唐晴,李育君,楊明,郭鴻彥,2010,大麻性別相關(guān)AFLP分子標(biāo)記篩選,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),36(2):123-127.)
[20]Marcello B.,Fabio P.,Alessandro V.,Francesco S.,Gio B.S.,Marco G.,and Gianni B., 2021,Developing and testing molecular markers inCannabis sativa(Hemp) for their use in variety and dioecy assessments,Plants(Basel),10(10):2174.
[21]Ning K.,Dong L.L.,Li M.Z.,Zhao Q.H.,Chen H.,Wang L.,and Chen S.L.,2020,Application and development of non-psychoactive medicinal cannabis,Zhongguo Shiyanfangjixue Zazhi(Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae),26(8):228-240.(寧康,董林林,李孟芝,趙慶賀,陳華,王磊,陳士林,2020,非精神活性藥用大麻的應(yīng)用及開(kāi)發(fā),中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,26(8):228-240.)
[22]Petit J.,Salentijn E.M.J,Paulo M.J.,Denneboom C.,Van Loo E.N.,and Trindade L.M.,2020,Elucidating the genetic architecture of fiber quality in Hemp (Cannabis sativa L.)using a genome-wide association study,Front.Genet.,11:566314.
[23]Petit J.,Salentijn E.M.J.,Paulo M.J.,Denneboom C.,and Trindade L.M.,2020,Genetic architecture of flowering time and sex determination in hemp (Cannabis sativa L.):a genome-wide association study,Front Plant Science,11:569958.
[24]Ren G.P.,Zhang X.,Li Y.,Kate R.,Kate Ridout L.S.,Yang Y.Z,Liu A.,Gudasalamani R.,Muhammad A.N.,Abdul S.M.,Nicolas S.,and Luca F.,2021,Large-scale whole-genome resequencing unravels the domestication history ofCannabis sativa,Science Advance,7(29):2286.
[25]Tang Z.C,Chen X.,Zhang Q.Y.,Guo H.Y.,and Yang M.,2013,Genetic diversity analysis of wild cannabis in China based on morphological characters and RAPD markers,Xibu Linye Kexue (Journal of West China Forestry Science)42(3):61-66.(湯志成,陳璇,張慶瀅,郭鴻彥,楊明,2013,野生大麻種質(zhì)資源表型及其RAPD遺傳多樣性分析.西部林業(yè)科學(xué),42(3):61-66.)
[26]Van B.H.,Stout J.M.,Cote A.G.,Tallon C.M.,Sharpe A.G.,Hughes T.R.,and Page J.E.,2011,The draft genome and transcriptome ofCannabis sativa,Genome Biol.,12(10):R102.
[27]Xin P.F.,Zang G.G.,Zhao L.N.,Gao C.S.,Cheng C.H.,and Tang Q.,2014,Development of SSR markers and construction of fingerprint for Cannabis(Cannabis sativa L.),Zhongguo Maye Kexue(Plant Fiber Sciences in China),36(4):174-182.(信朋飛,臧鞏固,趙立寧,高春生,程超華,唐蜻,2014,大麻SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及指紋圖譜的構(gòu)建,中國(guó)麻業(yè)科學(xué),36(4):174-182.)
[28]Zhang Q.,Chen X.,Guo H.,Trindade L.M,Salentijn E..M.J,Guo R.,Guo M.,Xu Y.,and Yang M.,2018,Latitudinal Adaptation and Genetic Insights Into the Origins of Cannabis sativa L.,Front Plant Science,9:1876.
[29]Zhang Q.Y.,Guo R.,Chen X.,Xu Y.P.,Guo M.B.,Guo H.Y.,and Yang M.,2017,Sampling strategy for genetic diversity ISSR analysis of wild Cannabis sativa L.population,Nanfang Nongye Xuebao(Journal of Southern Agriculture),48(6):973-978.(張慶瀅,郭蓉,陳璇,許艷萍,郭孟璧,郭鴻彥,楊明,2017,野生大麻居群遺傳多樣性ISSR分析的取樣策略,南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),48(6):973-978.)
[30]Zhang Q.Y.,Guo R.,Xu Y.P.,Guo M.B.,Yang M.Guo H.Y.,and Chen X.,2018,Construction of EST-SSR fingerprinting for 22 wild hemp(Cannabis sativa L.)germplasms and 8 representative varieties,Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding),16(2):493-501.(張慶瀅,郭蓉,許艷萍,郭孟璧,楊明,郭鴻彥,陳璇,2018,22份大麻野生資源與8份栽培品種EST-SSR指紋圖譜構(gòu)建,分子植物育種,16(2):493-501.)
[31]Zhao M.S.,Fang S.S.,Chen Y.Y.,Kang H.M.,Gao J.H.,Chen S.Y.,Yang X.,Feng X.P.,and Zhang L.W.,2019,Evaluation of markers linked to sex-specific and development of SCAR makers in seed hemp (Cannabis sativa L.),Redai Zuowu Xuebao(Chinese Journal of Tropical Crops),40(10):2076-2082.(趙銘森,方書(shū)生,陳瑤,康紅梅,高金虎,陳思遠(yuǎn),楊昕,馮旭平,張立武,2019,籽用大麻性別連鎖標(biāo)記的驗(yàn)證及SCAR標(biāo)記開(kāi)發(fā),熱帶作物學(xué)報(bào),40(10):2076-2082.)
文章摘自：趙曦,王玉杰,王家有,李曉娟,冷春旭,趙偉,王貴江,胡少新,張利國(guó),王珣.分子標(biāo)記技術(shù)在工業(yè)大麻研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J/OL].分子植物育種:1-7[2022-07-08].http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220602.1555.008.html
