摘  要：本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及紅麻VIGS沉默體系，特別是指紅麻硫氧還蛋白類似蛋白基因HcTrx及其重組載體在VIGS沉默體系中的應(yīng)用。其堿基序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明首次對紅麻葉綠體中的硫氧還蛋白類似蛋白（Thioredoxinlike protein,Trx）基因進行了克隆和亞細胞定位分析；構(gòu)建了紅麻HcTrx基因沉默體系，該體系具有快速、高通量、效果好以及易于操作的特點；本發(fā)明所述的HcTrx基因及沉默體系有效的降低了紅麻HcTrx基因的表達水平，葉綠素合成受到影響，導(dǎo)致花斑表型，能夠作為VIGS沉默體系在紅麻應(yīng)用中的報告基因。

權(quán)力要求書

1.紅麻硫氧還蛋白類似蛋白基因HcTrx，其堿基序列如SEQ ID No.1所示。

2.權(quán)利要求1所述的基因HcTrx表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.權(quán)利要求1所述的基因HcTrx作為紅麻報告基因中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用是通過構(gòu)建基因HcTrx的重組載體侵染紅麻植株實現(xiàn)的。

5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于：所述重組載體為病毒載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于：所述病毒載體為煙草脆裂病毒。

7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟為：

（1）克隆紅麻Trx基因的全長，構(gòu)建重組質(zhì)粒Blunt-HcTrx；

（2）以步驟（1）的重組質(zhì)粒Blunt-HcTrx為模板，以特異性片段的引物對為引物進行擴增，回收目的片段，將目的片段連接到pTRV2載體上，構(gòu)建pTRV2-HcTrx重組質(zhì)粒；

（3）將含pTRV2-HcTrx重組質(zhì)粒的菌液與pTRV1輔助載體的菌液等比例混合后注射至紅麻葉片，暗培養(yǎng)后正常培養(yǎng)得花斑型植株。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟（2）中特異性片段的序列如SEQID No.3所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟（3）中注射至紅麻葉片的浸潤面積＞75%整個葉片的面積。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟（3）中暗培養(yǎng)的時間為35-37小時。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及紅麻VIGS沉默體系，特別是指紅麻硫氧還蛋白類似蛋白基因HcTrx及其重組載體在VIGS沉默體系中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

紅麻（Hibiscus cannabinus L.）是一種重要的纖維作物，已有4000多年的栽培歷史，現(xiàn)已在20多個國家進行商業(yè)化種植，其總產(chǎn)量的95%以上主要來自中國、印度和泰國。紅麻纖維具有柔軟、韌度大、吸濕性好以及可降解等優(yōu)勢，其多功能用途包括制作紙張、建筑材料、麻紡產(chǎn)業(yè)、環(huán)境友好吸附材料、生物復(fù)合材料等產(chǎn)品，市場前景廣闊，被視為21世紀(jì)極具發(fā)展?jié)摿Φ淖魑锖臀磥砼勺魑?。因此，為保障紅麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展亟需加強紅麻種質(zhì)資源創(chuàng)新研究，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的紅麻新品種。

利用基因工程手段是獲得紅麻新種質(zhì)的有效途經(jīng)，但目前由于缺乏有效的紅麻遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系方法，極大的限制了對紅麻內(nèi)源性功能基因的深入研究和應(yīng)用。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virusinduced gene silencing，VIGS）技術(shù)是研究植物基因功能的一種快速而有效的方法，不需要遺傳轉(zhuǎn)化，具有周期短、成本低、操作簡單和沉默效率高等優(yōu)勢，廣泛的應(yīng)用于植物生長發(fā)育、抗病抗逆、代謝調(diào)控等相關(guān)基因的功能鑒定。目前VIGS技術(shù)已經(jīng)在煙草、擬南芥、小麥、水稻、玉米、番茄等多種植物研究中取得了成功。

專利202010073462.1公開了一種紅麻HcPDS基因VIGS沉默體系，該體系通過構(gòu)建含有HcPDS基因特異性片段的pTRV2病毒沉默表達載體，該載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅麻，誘導(dǎo)紅麻內(nèi)源HcPDS基因發(fā)生沉默，有效降低了紅麻HcPDS基因的表達水平，導(dǎo)致白化表型。該體系的轉(zhuǎn)化模式為通過侵泡法將紅麻種子在混合菌液中浸泡24h，然后進行種植，所得的植株出現(xiàn)白化表型；這種模式的周期較長，延長了試驗周期，為了進一步摸索獲得較短時間就能出現(xiàn)表型差異的方法以及進一步發(fā)現(xiàn)新的報告基因，本課題進行了深入的摸索。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種紅麻硫氧還蛋白類似蛋白基因HcTrx及其重組載體在VIGS沉默體系中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：紅麻硫氧還蛋白類似蛋白基因HcTrx，其堿基序列如SEQIDNo.1所示。

上述的基因HcTrx表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

上述的基因HcTrx作為紅麻報告基因中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述應(yīng)用是通過構(gòu)建基因HcTrx的重組載體侵染紅麻植株實現(xiàn)的。

優(yōu)選的，所述重組載體為病毒載體。

優(yōu)選的，所述病毒載體為煙草脆裂病毒。

上述的應(yīng)用，實驗步驟為：（1）克隆紅麻HcTrx基因的全長，構(gòu)建重組質(zhì)粒BluntHcTrx；（2）以步驟（1）的重組質(zhì)粒BluntHcTrx為模板，以特異性片段的引物對為引物進行擴增，回收目的片段，將目的片段連接到pTRV2載體上，構(gòu)建pTRV2HcTrx重組質(zhì)粒；（3）將含pTRV2HcTrx重組質(zhì)粒的菌液與pTRV1輔助載體的菌液等比例混合后注射至紅麻葉片，暗培養(yǎng)后正常培養(yǎng)得花斑型植株。

所述步驟（2）中特異性片段的序列如SEQIDNo.3所示。

所述步驟（3）中注射至紅麻葉片的浸潤面積＞75%整個葉片的面積。進一步，所述步驟（3）中暗培養(yǎng)的時間為3537小時。

本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明從紅麻中克隆獲得了一個硫氧還蛋白類似蛋白（Thioredoxinlikeprotein，Trx）基因，該基因定位于葉綠體中，位于葉綠體中的Trx蛋白所對應(yīng)的編碼基因發(fā)生突變或沉默后，突變體有明顯的花斑表型，是易于識別的標(biāo)記性狀，可以作為VIGS體系應(yīng)用的報告基因。

2、本申請構(gòu)建了攜帶HcTrx序列的煙草脆裂病毒（tobaccorattlevirus,TRV）重組載體，通過葉片注射法侵染紅麻后，誘導(dǎo)HcTrx基因發(fā)生沉默，沉默后植株中HcTrx基因的表達量顯著下降，出現(xiàn)典型的花斑表型。本發(fā)明構(gòu)建的攜帶HcTrx序列的TRV重組載體可以作為紅麻VIGS技術(shù)體系中的陽性對照，并探索和優(yōu)化了紅麻的VIGS技術(shù)體系，為VIGS技術(shù)在紅麻中的應(yīng)用奠定了堅實的理論和實踐基礎(chǔ)，也為硫氧還蛋白類似蛋白Trxlike，以及VIGS技術(shù)體系在其他作物中的應(yīng)用提供了借鑒。

3、本發(fā)明首次對紅麻葉綠體中的硫氧還蛋白類似蛋白（Thioredoxinlikeprotein,Trx）基因進行了克隆和亞細胞定位分析；構(gòu)建了紅麻HcTrx基因沉默體系，該體系具有快速、高通量、效果好以及易于操作的特點；本發(fā)明所述的HcTrx基因及沉默體系有效的降低了紅麻HcTrx基因的表達水平，葉綠素合成受到影響，導(dǎo)致花斑表型，能夠作為VIGS沉默體系在紅麻應(yīng)用中的報告基因。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例11、紅麻HcTrx基因的克隆提取紅麻品種福紅992幼苗根系的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA第一鏈，20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)本實驗室對紅麻轉(zhuǎn)錄組的高通量測序結(jié)果，設(shè)計用于擴增紅麻HcTrx基因序列的引物HcTrxF和HcTrxR，采用高保真酶PfuDNApolymerase，以cDNA為模板擴增紅麻Trx基因序列（結(jié)果如圖1所示）。擴增體系為：cDNA1μL，HcTrxF和HcTrxR各1μL(10μM)，10×Pfubuffer2.5μL，dNTPMix2μL(2.5mM),PfuDNApolymerase0.5μL(2.5U)，ddH2O補足至25μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；30個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠純化回收試劑盒純化后連接到pEASYBlunt克隆載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，然后涂布在含有Kan（100mg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)8~12h，挑選陽性克隆測序，獲得含硫氧還蛋白類似蛋白HcTrx基因序列的重組菌BluntHcTrx。

紅麻HcTrx蛋白的亞細胞定位（1）pBI121HcTrx瞬時表達載體的構(gòu)建以重組菌BluntHcTrx菌液為模板，根據(jù)瞬時表達載體pBI121的多克隆位點序列信息，結(jié)合ClonExpressII技術(shù)設(shè)計用于擴增HcTrx基因瞬時表達的引物pBIHcTrxF和pBIHcTrxR。擴增體系為：BluntHcTrx菌液1μL，HcTrxF和HcTrxR各1μL(10μM)，10×Pfubuffer2.5μL，dNTPMix2μL(2.5mM),PfuDNApolymerase0.5μL(2.5U)，ddH2O補足至25μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；30個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠純化回收試劑盒純化后連接到經(jīng)過XholI線性化處理的pBI121載體上。連接體系為：pBI121載體線性化質(zhì)粒270ng，插入片段24ng，5×CEIIBuffer2μL，ExnaseII1μL，ddH2O補足至10μL。連接條件為：37℃反應(yīng)10min,降至4℃后立即置于冰上冷卻。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，然后涂布在含有Kan（100mg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)8~12h，挑選陽性克隆測序，獲得重組菌pBI121HcTrx。[0028]（2）煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)化在含有蛭石的基質(zhì)中播種煙草種子若干，培養(yǎng)一個月后待其生長出6~8片葉片后即可注射。提取重組菌pBI121HcTrx的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，然后涂布在含有Kan（100mg/mL）、Rif（50mg/mL）及Str（25mg/mL）的LB平板上，28℃倒置培養(yǎng)2d。以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌落為模板，用基因特異引物對pBIHcTrxF和pBIHcTrxR進行PCR擴增檢測。挑取含有pBI121HcTrx質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于100mL的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，200rpm培養(yǎng)至OD為0.6~0.8。4000rpm，離心4min收集菌體，用含10mMMgCl2和120μMAS的LB液體懸浮液重懸菌體，OD調(diào)至0.6。挑選生長狀況良好的煙草葉片，用去針頭的1mL注射器從煙草葉片下表皮進行注射，并對注射區(qū)域做好標(biāo)記，將注射完成的煙草植株暗培養(yǎng)24h后，取標(biāo)記處的葉片制作成玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果如圖2所示，HcTrx:GFP發(fā)出的綠色熒光與葉綠體本身發(fā)出的紅色熒光重疊，這表明紅麻中的HcTrx是一個葉綠體定位蛋白，說明紅麻HcTrx基因在葉綠體上發(fā)揮作用。[0029]、VIGS載體構(gòu)建及侵染（1）攜帶HcTrx序列的TRV重組載體的構(gòu)建以重組菌BluntHcTrx菌液為模板，根據(jù)pTRV2載體的多克隆位點序列信息，結(jié)合ClonExpressII技術(shù)要求，使用TheSGNVIGSTool在線軟件(https://vigs.solgenomics.net/)設(shè)計用于擴增HcTrx基因CDS結(jié)構(gòu)域上的276bp特異性片段（序列如SEQIDNo.3所示）的引物pTRV2HcTrxF和pTRV2HcTrxR。擴增體系為：BluntHcTrx菌液1μL，pTRV2HcTrxF和pTRV2HcTrxR各1μL(10μM)，10×Pfubuffer2.5μL，dNTPMix2μL(2.5mM),PfuDNApolymerase0.5μL(2.5U)，ddH2O補足至25μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；30個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠純化回收試劑盒純化后連接到經(jīng)過EcoRI線性化處理的pTRV2載體上。連接體系為：pTRV2載體線性化質(zhì)粒220ng，插入片段11ng，5×CEIIBuffer2μL，ExnaseII1μL，ddH2O補足至10μL。連接條件為：37℃反應(yīng)10min,降至4℃后立即置于冰上冷卻。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，然后涂布在含有Kan（100mg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)8~12h，挑選陽性克隆測序，獲得重組質(zhì)粒pTRV2HcTrx。

引物序列如下表所示

（2）紅麻植株培養(yǎng)挑取籽粒飽滿的紅麻品種福紅992種子，先用3%的H2O2溶液消毒10min，再用無菌蒸餾水中沖洗4~5次后，室溫下在無菌水中浸泡1h，然后均勻地擺放在鋪有3層吸水紙的發(fā)芽盒（27cm×18cm×9cm）中，置于光照培養(yǎng)箱中（光/暗周期為14/10h，晝夜溫度28/26℃，相對濕度60/100，光照強度300μM/(m2·s)）培養(yǎng)7天后，選取長勢一致的幼苗移栽至含1/4Hoagland培養(yǎng)液的育苗盤中進行水培，待其長至第一片真葉展開時方可注射，每兩天更換一次培養(yǎng)液。

（3）VIGS侵染分別提取重組菌pTRV2HcTrx、載體pTRV2和輔助載體pTRV1的質(zhì)粒（如圖3所示）轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV301感受態(tài)細胞，然后涂布在含有Kan（100mg/mL）、Rif（50mg/mL）及Str（25mg/mL）的LB平板上，28℃倒置培養(yǎng)2d后。以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌落為模板，分別用pTRV2HcTrxF和pTRV2HcTrxR、pTRV2F和pTRV2R、pTRV1F和pTRV1R擴增引物對進行PCR擴增檢測。挑取含pTRV2HcTrx、pTRV2和pTRV1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落分別接種于100mL的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，200rpm培養(yǎng)至OD為0.8~1.0。4000rpm，離心10min收集菌體，用含10mMMgCl2、200μMAS和10mMMES無菌ddH2O2懸浮液重懸菌體，OD調(diào)至1.0；將攜帶pTRV1載體的菌液重懸液分別與攜帶pTRV2載體的菌液重懸液與攜帶重組質(zhì)粒pTRV2HcTrx的菌液重懸液按照體積比1:1混合制成2種混合菌液，混合菌液于室溫下避光靜置孵育3h后，用于注射紅麻葉片。用去針頭的1mL注射器從紅麻的子葉下表皮進行注射，浸潤面積占整個葉片面積的75%以上為宜，注射完成的紅麻植株暗培養(yǎng)36h，之后在正常條件下培養(yǎng)（流程示意圖如圖4所示）。

（4）浸染后HcTrx基因表達量檢測待葉片出現(xiàn)花斑表型后（一般在注射完后10天左右），分單株提取紅麻葉片總RNA，以Actin為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量（qRTPCR）法檢測HcTrx基因在對照（注射pTRV2空載體菌液）和沉默（注射重組病毒載體pTRV2HcTrx菌液）植株中表達情況，結(jié)果如圖5所示，由圖5可知HcTrx在干涉植株中的表達量顯著下降，證明基因沉默成功。內(nèi)參基因引物為ActinF和ActinR，HcTrx基因引物YGHcTrxF和YGHcTrxR。

實施效果分析本發(fā)明首次對紅麻葉綠體中的硫氧還蛋白類似蛋白（Thioredoxinlikeprotein,Trx）基因進行了克隆和亞細胞定位分析；構(gòu)建了紅麻HcTrx基因沉默體系，該體系具有快速、高通量、效果好以及易于操作的特點；本發(fā)明所述的HcTrx基因及沉默體系有效的降低了紅麻HcTrx基因的表達水平，葉綠素合成受到影響，導(dǎo)致花斑表型，能夠作為VIGS沉默體系在紅麻應(yīng)用中的報告基因。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為紅麻HcTrx基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。M，DL2000DNAMarker；泳道1、2，HcTrx基因。

圖2為紅麻HcTrx的亞細胞定位。

圖3為構(gòu)建重組病毒載體pTRV2HcTrx、空載體pTRV2和輔助載體pTRV1農(nóng)桿菌菌落PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。M，DL2000DNAMarker；泳道13，重組病毒載體pTRV2HcTrx農(nóng)桿菌單克隆；泳道46，空載體pTRV2農(nóng)桿菌單克??；泳道79，輔助載體pTRV1農(nóng)桿菌單克隆。

圖4為葉背注射法進行VIGS浸染過程及紅麻新葉花斑表型形態(tài)示意圖。

圖5為實時熒光定量（qRTPCR）檢測紅麻HcTrx基因的沉默效果。TRV:00，空載體pTRV2對照植株；TRV:HcTrx1~10，重組病毒載體pTRV2HcTrx沉默植株。

摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：陳鵬，唐美瓊，李增強，岳嬌，曹珊，羅登杰，王財金，申請?zhí)?/font>：202210176786.7，申請日：2022.02.25