摘 要：目的:優(yōu)化羅布麻沖劑的水提工藝并確定其參數(shù)。方法:以金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮含量以及出膏率為評價指標(biāo)，采用高效液相色譜法和紫外分光光度計法測定指標(biāo)含量，AHP－CRITIC混合加權(quán)法確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，設(shè)計L9(34)正交試驗篩選羅布麻葉沖劑的水提工藝中提取次數(shù)、提取時間和加水倍量，并進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果:AHP－CRITIC混合加權(quán)法確定金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮的含量以及出膏率的權(quán)重分別為0.4768，0.4346和0.0886，篩選的提取工藝為羅布麻葉加10倍量水、加熱回流3次，每次0.5h。3次驗證試驗結(jié)果顯示，金絲桃苷的提取率為90.29%，總黃酮的含量為105.84mg/g，出膏率為29.87%，綜合評分為98.44(RSD=1.86%，n=3)。結(jié)論:優(yōu)選的羅布麻沖劑水提工藝重復(fù)性好、穩(wěn)定可行，可為羅布麻沖劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
關(guān)鍵詞：羅布麻沖劑；提取工藝；正交試驗；AHP－CRITIC1
羅布麻葉系夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉，具有平肝安神、清熱利水之功效，用于肝陽眩暈、心悸、失眠等［1］，是單方制劑羅布麻沖劑的處方藥材。羅布麻葉臨床上常用治療高血壓，其特點是降血壓平穩(wěn)和不良反應(yīng)小?，F(xiàn)代研究［2－3］發(fā)現(xiàn)，羅布麻葉中主要含黃酮類、有機酸類、鞣質(zhì)、糖類、氨基酸類和礦物質(zhì)元素等化學(xué)成分，其中黃酮類單體化合物金絲桃苷是《中國藥典》2020年版一部中羅布麻葉的含量測定指標(biāo)；羅布麻葉提取物具有降血壓、降血脂、增加冠狀動脈流量等藥理作用；羅布麻葉中的總黃酮類成分，如槲皮素、異槲皮苷等，可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝抑制CRP和TGF－β1因子的表達(dá)發(fā)揮抗血壓作用，也能減輕高血脂導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷和改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平實現(xiàn)對血脂代謝的調(diào)節(jié)。查閱文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)采用層次分析法(analytic hierarchy process，AHP)、指標(biāo)重復(fù)性相關(guān)法(criteria importance through inter－criteria cor-relation，CRITIC)及AHP－CRITIC混合加權(quán)法結(jié)合正交試驗優(yōu)選羅布麻沖劑的水提工藝的研究。故本研究以金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮的含量與出膏率作為評價指標(biāo)，采用多指標(biāo)權(quán)重分析法對實驗結(jié)果進(jìn)行綜合評定，SPSS20.0軟件對綜合評分進(jìn)行方差分析篩選科學(xué)合理的權(quán)重系數(shù)；結(jié)合正交試驗法對羅布麻葉的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定羅布麻沖劑的最佳水提取工藝參數(shù)，旨在為羅布麻葉沖劑新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定、可行的生產(chǎn)工藝提供實驗依據(jù)。
1儀器與材料
1.1儀器
Agilent－1260高效液相色譜儀(四元泵、DAD檢測器、OpenLAB色譜工作站、美國安捷倫)；UV－765紫外可見分光光度計(上海精科)；BP211D型十萬分之一(梅特勒－托利多)，BS110S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯)；Water Purifier超純水機(四川沃特爾)。
1.2材料
羅布麻藥材由廣西南藥藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)新疆藥物研究所何江研究員鑒定，符合2020年版《中國藥典》相關(guān)項下要求。金絲桃苷對照品(批號:111521－201507)，蘆丁對照品(批號:100080－200707)，均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇、色譜乙腈(美國Fisher)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
2方法與結(jié)果
2.1實驗方法
稱取藥材10g，按照正交試驗表所設(shè)計的條件，加水回流提取并過濾，合并濾液，放置至室溫，加水定容至1000mL，備用。
2.2金絲桃苷含量測定方法
2.2.1金絲桃苷對照品溶液的制備
取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含467.86μg的溶液，即得儲備液。再精密量取儲備液1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再精密量取5mL，置10mL量瓶中，制成每1mL含23.3929μg的溶液，即得。
2.2.2供試品溶液的制備
精密稱取羅布麻葉藥材10g，加10倍量水回流提取3次，每次30min；合并濾液，放置室溫，定容至1000mL，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.2.3色譜條件的確定
本實驗的色譜條件參照《中國藥典》2020年版一部羅布麻葉藥材中的含量測定方法。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent Extend－C18250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈－0.2%磷酸溶液(15∶85)為流動相；檢測波長為256nm。柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，理論板數(shù)應(yīng)不低于6000。HPLC圖譜如圖1所示。
2.2.4金絲桃苷線性關(guān)系考察
分別精密吸取“2.2.1”項下的對照品儲備液溶液0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL，加甲醇分別稀釋至10mL，分別精密吸取稀釋液10μL，按“2.2.3”項下色譜條件下進(jìn)樣，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:金絲桃苷Y=28.522X－16.46(R=0.9997)。結(jié)果表明，金絲桃苷在4.68～93.57μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2.5精密度實驗
精密吸取同一濃度的金絲桃苷對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，記錄峰面積，計算RSD值。結(jié)果金絲桃苷峰面積RSD為0.89%。表明精密度良好。
2.6確定權(quán)重系數(shù)
2.2.6重復(fù)性實驗
按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液6份，每次進(jìn)樣10μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的含量，RSD值為1.35%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.2.7穩(wěn)定性實驗
精密吸取同一供試品溶液，室溫下分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h進(jìn)樣，每次10μL，記錄峰面積，計算金絲桃苷含量，結(jié)果金絲桃苷RSD為1.75%。
2.2.8加樣回收率
精密稱取已知含量的羅布麻葉樣品6份，每份5g。精密加入與羅布麻藥材中近似等量的金絲桃苷對照品溶液。按“2.2.2”項下的方法處理樣品，按含量測定方法測定含量。計算出金絲桃苷回收率為98.94%，RSD為2.88%(n=6)。
2.3總黃酮含量測定方法［4］
2.3.1蘆丁對照品溶液的制備
取蘆丁對照品20mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取5mL置50mL量瓶中，加甲醇置刻度，搖勻，即得(每1mL含200μg的溶液)。
2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
分別精密吸取蘆丁對照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL與8mL，分別置25mL量瓶，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外分光光度法(通則0401)，在503nm處測定吸光度(A)。以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到線性回歸方程A=13.134C+0.0364(r=0.9995)，表明蘆丁濃度在6.5～51.9μg/mL與吸光度的線性關(guān)系良好。
2.3.3精密度實驗
精密吸取同一濃度的蘆丁對照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立項下操作，加入顯色劑顯色后，測定吸光度；連續(xù)6次，計算RSD值為0.31%。表明精密度良好。
2.3.4重復(fù)性實驗
按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液6份，加入顯色劑顯色后，測定吸光度，計算總黃酮含量的RSD值為1.44%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.5穩(wěn)定性實驗
精密吸取同一供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立項下操作，顯色后，分別在0min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min測定其吸光度。計算總黃酮含量的RSD值3.81%。表明供試品溶液在80min內(nèi)穩(wěn)定良好。
2.3.6加樣回收率
精密稱取已知含量的羅布麻葉樣品6份，每份5g。精密加入與羅布麻藥材中近似等量的蘆丁對照品溶液。按“2.2.2”項下的方法處理樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立項下操作，加入顯色劑顯色后，測定吸光度。計算出蘆丁回收率為96.74%，RSD為2.86%(n=6)。
2.3.7樣品測定
精密吸取“2.1”項下藥液5mL置10mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，得供試品溶液，分別吸取各供試品溶液1mL于25mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外分光光度法(通則0401)，在503nm處測定吸光度(A)。計算樣品中總黃酮含量。
2.4出膏率測定
精密吸取“2.1”項下靜置過夜后的供試品溶液25.0mL，置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥5h，取出，置干燥器中冷卻0.5h，精密稱定重量，根據(jù)公式:出膏率=干膏質(zhì)量×40/藥材質(zhì)量×100%，計算出膏率。2.5正交試驗優(yōu)化提取工藝單因素實驗確定了各因素各水平的用量范圍，在此基礎(chǔ)上，以提取次數(shù)、提取時間和加水倍量為因素分配各水平。因素水平安排見表1，結(jié)果見表2。
表1 因素水平表
表2 L9(34)正交試驗表及結(jié)果
2.6確定權(quán)重系數(shù)
2.6.1AHP法［5］確定權(quán)重系數(shù)
根據(jù)中藥中有效成分含量的高低和藥理作用的強弱，本研究將金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮含量和出膏率3個指標(biāo)給予主觀量化，并確定各個指標(biāo)的優(yōu)先順序為金絲桃苷=總黃酮＞出膏率。根據(jù)此順序，采用SPSS20.0軟件構(gòu)建各指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，給予各項指標(biāo)的相對評分(表3)，并對矩陣進(jìn)行歸一化處理，計算出權(quán)重系數(shù)分別為0.4286、0.4286、0.1429，最大特征根為3.000，一致性指標(biāo)(CI)為0.000；由矩陣階數(shù)為3得到隨機一致性指標(biāo)(RI)為0.520，一致性比率(CR)為0.000(＜0.1)，即指標(biāo)優(yōu)化比較矩陣通過一致性檢驗，表明各評價指標(biāo)權(quán)重系數(shù)合理有效。
表3 指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣表
2.6.2CRITIC法［6］確定權(quán)重系數(shù)
CRITIC方法是一種客觀的權(quán)重賦值方法，以評價指標(biāo)間的對比強度及沖突性作為基礎(chǔ)，通過計算標(biāo)準(zhǔn)差將對比強度及沖突性體現(xiàn)出來的計算方法，可客觀反映各評價指標(biāo)的權(quán)重值。標(biāo)準(zhǔn)差來表示對比強度，其值越小，權(quán)重越??；相關(guān)系數(shù)表示沖突性，相關(guān)系數(shù)越大，權(quán)重越大。中藥化學(xué)成分種類繁多，各成分對總體藥效的貢獻(xiàn)大小不同。故本研究通過CRITIC法確定羅布麻沖劑中金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮的含量和出膏率的權(quán)重。對表2中正交實驗結(jié)果數(shù)據(jù)通過公式，即［指標(biāo)成分值=(實測值－最小值)/(最大值－最小值)×100］，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理以消除單位量綱。SPSS20.0軟件得到各評價指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣A，由矩陣計算對比強度即指標(biāo)內(nèi)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差(σj)、沖突性(Rj)、綜合權(quán)重(Cj)與權(quán)重(Wj)，計算結(jié)果見表4。表4表明，CRITIC法計算得到的金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮含量和出膏率的權(quán)重系數(shù)分別為0.4050，0.3692和0.2258。
表4 相關(guān)計算數(shù)據(jù)表
2.6.3AHP－CRITIC混合加權(quán)法確定權(quán)重系數(shù)
AHP方法將評價指標(biāo)依據(jù)主觀判斷進(jìn)行兩兩比較的優(yōu)先信息給予量化，得到主觀權(quán)重系數(shù)；體現(xiàn)了中藥中指標(biāo)成分在藥效方面的差異。CRITIC法考慮到了指標(biāo)內(nèi)的變化程度和兩個指標(biāo)間的一致性對賦權(quán)結(jié)果的影響，使評價結(jié)果更加科學(xué)合理。綜合二者的優(yōu)點，根據(jù)公式ω綜合ij=ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij(式中，ωAHPij表示AHP法計算的權(quán)重系數(shù)，ωCRITICij表示CRITIC法計算的權(quán)重系數(shù)，i表示第i個因素，j表示第j個樣本)計算綜合權(quán)重，得到金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮含量和出膏率3項指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.4768，0.4346和0.0886。
2.7綜合評價結(jié)果比較
分別用AHP法、CRITIC法及AHP－CRITIC混合加權(quán)法得到的權(quán)重對試驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分，結(jié)果見表5，采用SPSS20.0軟件對3種權(quán)重法得到的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩兩之間差異不明顯，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，三者相關(guān)性顯著(P＜0.01)，即3種賦權(quán)法得到的綜合評分結(jié)果具有一致性。但采用spss20.0軟件對權(quán)重系數(shù)分析，AHP法與CRITIC法的相關(guān)系數(shù)為0.982，兩者相關(guān)性不顯著(P=0.121＞0.05)，即二者相關(guān)性沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明這兩種方法所反映的信息不具有疊加性。對比而言，AHP－CRITIC混合加權(quán)方法兼顧主客觀兩方面，反映的信息比單一方法更全面、更科學(xué)、更合理、更符合實際。
表5 3種賦權(quán)法綜合評分結(jié)果
2.8正交試驗結(jié)果分析
采用AHP－CRITIC混合加權(quán)法確定的各指標(biāo)權(quán)重對正交試驗實驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分，優(yōu)選最佳水提取工藝。
采用SPSS20.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行分析，表6直觀分析數(shù)據(jù)表明，各因素對金絲桃苷轉(zhuǎn)移率、總黃酮含量和出膏率的綜合評分的影響為A＞B＞C，表7方差分析結(jié)果顯示，因素A提取次數(shù)對實驗結(jié)果具有顯著性影響(P＜0.05)，因素B提取時間和因素C加水倍量無顯著性影響(P＞0.05)，結(jié)合大工業(yè)生產(chǎn)成本，得最佳工藝參數(shù)為A3B1C1，即10倍量水，加熱回流3次，每次0.5h。
表6 直觀分析表
表7 方差分析表
F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00
2.9工藝驗證
稱取3份藥材，按照之前篩選出的最佳提取工藝分別進(jìn)行回流提取，檢測回流提取液中金絲桃苷轉(zhuǎn)移率和總黃酮含量以及出膏率。結(jié)果見表8。
表8 水提取驗證實驗結(jié)果統(tǒng)計表
由表8可知，3個指標(biāo)的綜合評分RSD值小于2.0%，表明所優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可行，可用于羅布麻沖劑的水提工藝研究。
3討論
現(xiàn)代藥理學(xué)研究［2］表明，羅布麻葉對預(yù)防和治療高血壓和高血脂有較好療效，而黃酮類成分是其發(fā)揮此類作用的主要成分，黃酮類化合物金絲桃苷是羅布麻葉的質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，采用《中國藥典》收載的羅布麻葉中金絲桃苷含量測定的方法，金絲桃苷主峰與其后一個較大的雜質(zhì)峰不易分開，根據(jù)文獻(xiàn)得知該雜質(zhì)峰為與金絲桃苷的結(jié)構(gòu)相似的黃酮類化合物———異槲皮苷［7］，故我們在后期的研究中優(yōu)化了流動相的比例，使之達(dá)到較好的分離。
本研究測定了羅布麻水提溶液中總黃酮的含量，比色法檢測總黃酮含量的方法有亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉絡(luò)合比色法、AlCl3比色法等［8］；首先采用AlCl3比色法在415nm處測定，發(fā)現(xiàn)羅布麻水提溶液用AlCl3－CH3COOK處理后在415nm處沒有吸收峰。采用亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉絡(luò)合比色法時，蘆丁(對照品)和樣品溶液在503nm處均有吸收峰，且有文獻(xiàn)研究證實［9－10］。故本研究中羅布麻葉總黃酮的含量測定采用亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉絡(luò)合比色法。
目前中藥提取工藝常用多指標(biāo)權(quán)重綜合評分法，權(quán)重系數(shù)的建立是多指標(biāo)評價中主要考慮的問題。權(quán)重的確定方法有為主觀賦權(quán)方法和客觀賦權(quán)方法兩種；主觀賦權(quán)方法主觀性較強，對實驗的影響因素不能更全面、更客觀的評價；例如專家打分法和AHP法。客觀權(quán)重系數(shù)是指經(jīng)過對實際發(fā)生的資料進(jìn)行整理、計算和分析而得出的權(quán)重系數(shù)，例如主成分分析法、CRITIC法等［11－12］。本實驗采用主觀權(quán)重系數(shù)確定方法———層次分析法得到的權(quán)重為0.4286、0.4286、0.1429，客觀賦權(quán)方法(CRITIC法)確定的權(quán)重為0.4050、0.3692、0.2258，AHP－CRITIC混合加權(quán)法得到的權(quán)重為0.4768，0.4346和0.0886。利用SPSS20.0軟件對三種權(quán)重系數(shù)和各權(quán)重確定的綜合評分分別進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)單一的AHP或CRITIC賦權(quán)方法得到的權(quán)重系數(shù)過于片面。故本實驗綜合兩種賦權(quán)方法的優(yōu)點，采用AHP－CRITIC混合加權(quán)法；不僅體現(xiàn)了經(jīng)驗主觀信息，也顯現(xiàn)出客觀數(shù)據(jù)信息，相比于單一的賦權(quán)法更能全面科學(xué)的體現(xiàn)穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)信息。
通過正交實驗優(yōu)化羅布麻沖劑的水提工藝參數(shù)，采用SPSS20.0軟件對正交試驗綜合評分的結(jié)果進(jìn)行直觀和方差分析，得到最佳工藝為:10倍量水、加熱回流3次、每次0.5h。驗證實驗結(jié)果說明優(yōu)化工藝合理、穩(wěn)定可行、重復(fù)性良好。為羅布麻沖劑的成型工藝和工業(yè)化大生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持，實際應(yīng)用價值較大。
致謝:感謝新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所科教科何承輝老師為本實驗提供指導(dǎo)。
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文章摘自：王芳芳，帕依曼·亥米提，倪爽爽，王新春，何承輝.多指標(biāo)權(quán)重分析法結(jié)合正交試驗優(yōu)選羅布麻沖劑的水提工藝[J].中國民族民間醫(yī)藥，2022，31(21):35-40.
