摘  要：【背景】麻類生物脫膠與化學(xué)法脫膠相比具有環(huán)保優(yōu)勢(shì)?！灸康摹繛楂@得用于漢麻生物脫膠的高效果膠酶菌株?！痉椒ā渴褂靡怨z為唯一碳源的培養(yǎng)基，采用平板稀釋法進(jìn)行菌株篩選，通過生理生化實(shí)驗(yàn)和 16S rRNA 基因序列比對(duì)鑒定目標(biāo)菌株。采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件，并驗(yàn)證該條件下漢麻生物脫膠效果?！窘Y(jié)果】獲得一株具備高活性的果膠酶

菌株，歸類為果膠桿菌 WNH(Pectobacterium aroidearum WNH)。在培養(yǎng)溫度 27 °C、轉(zhuǎn)速為160 r/min、接種量 10%、初始 pH=7 的條件下培養(yǎng) 16 h 后，果膠桿菌 WNH 的粗酶液果膠酶活力達(dá) 155.03 U/mL。按上述條件對(duì)漢麻韌皮進(jìn)行二次脫膠處理，處理后脫膠率為 27.18%，較對(duì)照組提高了 6.93%?！窘Y(jié)論】果膠桿菌 WNH 具備漢麻生物脫膠的潛力。

關(guān)鍵詞：果膠桿菌；果膠酶；漢麻；纖維；生物脫膠

 

漢麻纖維是一種優(yōu)秀的紡織原材料，具有抗紫外線、吸濕散熱、透氣性能良好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于紡織纖維和新型復(fù)合材料等領(lǐng)域，具有很大的應(yīng)用潛力。漢麻纖維主要位于漢麻莖稈的韌皮部，分為初生纖維和次生纖維，其中初生纖維長度為 20−50 mm，次生纖維長度約 2 mm[1]。初生纖維與次生纖維的長度差異主要受纖維細(xì)胞細(xì)胞壁上糖種類不同影響，這種長度差異也導(dǎo)致漢麻纖維的脫膠采取的是適度脫膠而非全脫膠[2]。傳統(tǒng)的天然漚麻法勞動(dòng)力需求大，脫膠過程控制難度大；化學(xué)法脫膠膠質(zhì)去除率高，但容易損傷纖維質(zhì)量且能耗高、環(huán)境污染大[3]。微生物法脫膠作為一種新興的漢麻纖維預(yù)處理技術(shù)，利用微生物分泌的果膠酶、木聚糖酶[4]等膠質(zhì)降解酶在溫和的反應(yīng)條件下，能以較低的能量消耗、較輕微的環(huán)境污染實(shí)現(xiàn)漢麻纖維的適度脫膠，并保證脫膠后纖維的長度與質(zhì)量。

微生物法脫膠通常分為兩種，一是直接施用脫膠微生物進(jìn)行脫膠，以“膠養(yǎng)菌，菌產(chǎn)酶，酶脫膠”的方式實(shí)現(xiàn)漢麻纖維的脫膠；二是收集并純化脫膠微生物分泌的果膠酶等膠質(zhì)分解酶，在適當(dāng)?shù)拿阜磻?yīng)條件下完成脫膠，這兩類脫膠方式的關(guān)鍵均是高效脫膠微生物的作用[5]，優(yōu)質(zhì)的菌種資源該脫膠方法能取得進(jìn)一步發(fā)展的基石。研究者們嘗試從土壤等樣本中分離功能細(xì)菌，已獲得具備生物脫膠能力的菌株主要有芽孢桿菌屬、果膠桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、白腐真菌[6−11]等。Cheng等人[12]在土壤樣品中分離出一株蘇云金芽孢桿菌，果膠酶活力達(dá) 98.2 U/mL，脫膠后纖維殘膠率為8.32%。Guo[13]等對(duì)芽孢桿菌 Y1 的產(chǎn)果膠酶性能進(jìn)行優(yōu)化，使多聚半乳糖醛酸酶酶活力提高 3.44 倍，脫膠時(shí)間縮短 12 h。Nadezhda 等[14]通過在 M63 甘油培養(yǎng)基中添加多聚半乳糖醛酸和馬鈴薯提取物進(jìn)行誘導(dǎo)，使黑腐果膠桿菌 SCRI1043 的果膠酶活性提高 64.8 倍，為 194.4 U/mL。果膠酶是漢麻生物脫膠中的關(guān)鍵酶類[15]，Maisuria 等[16]對(duì)果膠桿菌亞種 BR1 分泌的果膠酶性質(zhì)進(jìn)行分析，該酶能在50−70 °C、pH 為 8.0 的條件下，保持酶活力的穩(wěn)定，表明該菌具備應(yīng)用于纖維脫膠的潛力。通過篩選高效果膠酶菌株，并優(yōu)化菌株產(chǎn)果膠酶能力是改善漢麻生物脫膠效果、縮短脫膠時(shí)間的有效途徑。本研究擬從雨露漚麻及原位土壤混合樣品中篩選獲得高效的果膠酶菌株，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化菌株產(chǎn)果膠酶能力，改善其漢麻生物脫膠效果，以期為漢麻生物脫膠提供一定的資源儲(chǔ)備。

1材料與方法

1.1材料

微生物分離樣品來自黑龍江省大慶市東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)，為天然環(huán)境下漚制 15−20 d 的雨露漚麻及原位土壤混合樣品；漢麻韌皮同樣來自于東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)，通過手工剝制獲得的晾干麻束。漢麻品種為“火麻一號(hào)”。

果膠無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基[17](PMAS)，PMAS 液體培養(yǎng)基不添加瓊脂。

主要試劑和儀器：生物掃描電鏡(SEM)，Hitachi 日立；測(cè)序儀，PCR 儀，ABI；細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化；雙束紫外分光光度計(jì)，北京普析；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信；冷凍離心機(jī)，Eppendorf。

1.2方法

1.2.1菌株的分離純化

稱取 5 g 采集的雨露漚麻樣品，加入 100 mL 的無菌生理鹽水，30 °C、120 r/min 振蕩培養(yǎng) 30 min，取上清液進(jìn)行后續(xù)處理。將上清液按梯度稀釋法稀釋，獲得濃度梯度為 1×10−3、1×10−4、1×10−5 三個(gè)梯度的稀釋液，吸取 100 μL 稀釋液，涂布于 PMAS 固體培養(yǎng)基上，于 33 °C 恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，每個(gè)稀釋梯度重復(fù)三次。連續(xù)分離純化 5−6 代后，觀察菌落生長情況，將形狀穩(wěn)定的單菌落轉(zhuǎn)移至 PMAS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在此后將培養(yǎng)好的菌液通過甘油法保藏。

1.2.2產(chǎn)果膠酶能力細(xì)菌的篩選

初篩：將分離平板中獲得的單菌落接入鑒定用平板，33 °C 靜置培養(yǎng) 24 h 后，使用 7 g/L 剛果紅溶液進(jìn)行染色，染色持續(xù) 20 min，然后用 1 mol/L 氯化鈉溶液進(jìn)行沖洗，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈。若出現(xiàn)透明圈，則測(cè)量和計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值，即圈徑比，選取菌落直徑較大，圈徑比較大的細(xì)菌作為目標(biāo)菌株，以用于復(fù)篩。

復(fù)篩：將初篩得到的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取培養(yǎng) 24 h 后的發(fā)酵液，經(jīng) 4 °C、10 000 r/min 離心 5 min，獲得上清液。取離心后的上清液進(jìn)行果膠酶酶活力的測(cè)定，酶活力的測(cè)定使用 DNS 法進(jìn)行，并使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定此時(shí)上清液的蛋白濃度。測(cè)定過程中使用的標(biāo)準(zhǔn)樣品為半乳糖醛酸和牛血清白蛋白。酶活定義為：在 50 °C 的條件下，每 1 min 水解果膠產(chǎn)生 1 μg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活單位(U)。

1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化特性研究

通過劃線分離法在平板上獲得分離后的單菌落，觀察并記錄單菌落的形態(tài)、顏色、透明度、邊緣光滑程度及是否凸起等特征。使用掃描電鏡觀察菌株的形態(tài)。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[18]對(duì)菌株 WNH 的生理生化指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)菌 16S rRNA 基因測(cè)序及序列分析

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒按柱式法提取基因組 DNA，16s rRNA 序列 PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物 27F 和 1492R，引物信息如表 1 所示。PCR 產(chǎn)物由北京六合華大基因科技有限公司完成測(cè)序，反應(yīng)體系及條件如表 2 所示。在測(cè)序后將該菌株基因序列在 NCBI 上進(jìn)行 BLAST 比對(duì)分析，選擇同源性高的標(biāo)準(zhǔn)菌株及序列，使用軟件 MEGA11.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 16s rRNA 序列擴(kuò)增引物

  

表 2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件

  

1.2.5 果膠桿菌 WNH 的生長曲線及產(chǎn)酶能力

取活化后的種子液，按 10%的接種量接種至 PMAS 培養(yǎng)基中，在 33 °C、140 r/min 的培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 48 h。前 24 h 每 8 小時(shí)取菌液樣品，后 24 h 每隔 12 h 取樣，使用分光光度計(jì)測(cè)量樣品在波長 600 nm 處的吸光值，獲得菌株 WNH 的生長曲線；使用 1.2.2 中的果膠酶酶活測(cè)定方法對(duì)菌液樣品進(jìn)行處理，測(cè)定每個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)，果膠桿菌 WNH 的產(chǎn)酶性能。

1.2.6 果膠桿菌 WNH 的產(chǎn)酶能力的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，只改變培養(yǎng)溫度、初始 pH、轉(zhuǎn)速和接種量等因素，探索果膠桿菌 WNH分泌胞外果膠酶的最適條件。使用 1.2.2 中的酶活測(cè)定方法測(cè)定不同條件下培養(yǎng)后菌液樣品中果膠酶酶活力，分析并選擇最適條件進(jìn)行產(chǎn)酶驗(yàn)證，測(cè)定該條件下果膠酶酶活力水平。

1.2.7 果膠桿菌 WNH 對(duì)漢麻韌皮的脫膠能力

使用果膠桿菌 WNH 進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn)。將保藏的菌株 WNH 進(jìn)行活化，33 °C 培養(yǎng) 48 h 后獲得種子液。將漢麻韌皮用清水沖洗一遍后晾干，取 2.1±0.1 g 的漢麻韌皮添加至對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，將種子液按 10%的比例接種，33 °C、120 r/min 處理 24 h，對(duì)照組不接種種子液。處理后將漢麻韌皮用流水沖洗 4−5 遍，于 105 °C 烘箱中烘干至恒重。結(jié)合脫膠率、掃描電子顯微鏡觀察等方法評(píng)估果膠桿菌 WNH 的漢麻脫膠效果。

脫膠率計(jì)算方式如下： 

 

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株 WNH 的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)

該細(xì)菌在 PMAS 固體瓊脂平板上生長較快，24−36 h 即可形成成熟菌落。如圖 1 所示，菌落直徑為 0.3−0.5 cm，形態(tài)呈乳白色的圓形菌落，質(zhì)地不透明且有光澤，邊緣光滑。通過 SEM 觀察可得，菌體呈桿狀，約為(18.6−37.6 μm)×5 μm。剛果紅染色結(jié)果為圈徑比 6.06±0.53，菌落直徑為 0.37 cm，在 PMAS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h 后，果膠酶酶活力達(dá) 85.05 U/mL，粗酶液中蛋白濃度為 19.9 mg/mL。

  

表 3 細(xì)菌 WNH 的生理生化鑒定

  

細(xì)菌 WNH 的生理生化鑒定結(jié)果如表 3 所示。該細(xì)菌能在 37 °C 下生長，能使明膠液化，能夠利用果膠并分泌果膠酶，能以葡萄糖、蔗糖等為唯一碳源進(jìn)行生長，但不能以淀粉、乙酸等為唯一碳源生長。這些特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株 P.aroidearum SCRI 109[15−16]的特征一致。該菌革蘭氏染色結(jié)果呈紅色，為陰性菌；甲基紅實(shí)驗(yàn)為陰性，不能利用丙酮酸；脲酶試驗(yàn)呈現(xiàn)陽性，說明其能分泌脲酶，降解尿素；接觸酶試驗(yàn)呈陰性，說明該菌不能產(chǎn)生過氧化氫酶。這與腸桿菌目細(xì)菌的生化特征相符。纖維素降解試驗(yàn)為陰性，說明該菌不具備分泌纖維素酶的能力，不能分解纖維素，能夠作為脫膠菌應(yīng)用于漢麻生物脫膠中。

2.2 細(xì)菌 WNH 的分子生物學(xué)鑒定

使用 BLAST 工具將細(xì)菌 WNH 的 16S rRNA 基因數(shù)據(jù)與 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性較高的菌株。結(jié)果表明，細(xì)菌 WNH 與 GenBank 中的果膠桿菌屬同源性最高，相似度超過 99.9%。通過系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)筑軟件 MEGA−11 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖 1 所示。綜合 16S rRNA 基因測(cè)序結(jié)果、

菌株形態(tài)學(xué)特征及生理生化指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果，判斷細(xì)菌 WNH 為一株果膠桿菌(P. aroidearum)，屬于腸桿菌目溶果膠菌科。

  

2.3 果膠桿菌 WNH 的生長曲線及產(chǎn)酶性能

為評(píng)估果膠桿菌 WNH 分泌果膠酶的能力，對(duì)果膠桿菌 WNH 的生長曲線和酶活力曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖 3 所示，果膠桿菌 WNH 的生長速度較快，接種后潛伏期較短，16 h 取樣時(shí)已結(jié)束對(duì)數(shù)生長期，進(jìn)入穩(wěn)定期。隨后直至取樣結(jié)束時(shí)，體系內(nèi)細(xì)菌量均維持在較高水平。果膠酶酶活力的趨勢(shì)與生長曲線相似，接種后至 16 h 這一期間內(nèi)，酶活力有顯著提高，隨后有一定降低但趨于穩(wěn)定。

 

  

2.4 果膠桿菌 WNH 的產(chǎn)酶性能優(yōu)化

為優(yōu)化果膠桿菌 WNH 分泌果膠酶的能力，如圖 4 所示，采用單因素優(yōu)化的方法，依次探究溫度、pH、接種量和轉(zhuǎn)速這四個(gè)因素對(duì)果膠桿菌 WNH 果膠酶分泌能力的影響。各因素對(duì)果膠酶酶活力的影響均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，其中培養(yǎng)溫度為 27 °C 時(shí)、pH 為 7.0、接種量為 10%和轉(zhuǎn)

速為 160 r/min 時(shí)分別在各自曲線中呈現(xiàn)出最高的果膠酶酶活力，使用該條件培養(yǎng)果膠桿菌 WNH，培養(yǎng) 16 h 后其果膠酶酶活力為 155.03 U/mL。

2.5 生物脫膠效果

通過掃描電鏡觀察可得，使用果膠桿菌 WNH 對(duì)漢麻韌皮進(jìn)行二次脫膠處理前，漢麻韌皮纖維表面粗糙，有大量膠質(zhì)等物質(zhì)殘留，纖維束間連接緊密，分離現(xiàn)象不明顯(圖 5 A.B.C)；處理后漢麻韌皮纖維表面光潔，膠質(zhì)殘留少，纖維分離明顯(圖 5 D.E.F)。處理后的漢麻韌皮纖維柔軟蓬松，色澤柔和，實(shí)驗(yàn)組韌皮纖維脫膠率為 27.18%，對(duì)照組為 20.25%，較對(duì)照組提高了 6.93%。說明果膠桿菌 WNH 具備漢麻生物脫膠能力，能進(jìn)一步降低漢麻韌皮中的膠質(zhì)含量，有助于漢麻纖維質(zhì)量的改善。

   

3 討論與結(jié)論

麻類纖維的生物脫膠處理始終是麻類相關(guān)研究的熱點(diǎn)，優(yōu)質(zhì)的微生物資源則是生物脫膠處理的關(guān)鍵。研究者們發(fā)現(xiàn)[19]，果膠桿菌多數(shù)具備較強(qiáng)的果膠降解能力，能夠應(yīng)用于麻類生物脫膠的生產(chǎn)實(shí)踐中。本研究篩選獲得的果膠桿菌 WNH 與其他已發(fā)表菌株(表 4)相比，具備較高的果膠酶酶活力水平，未檢測(cè)到纖維素降解現(xiàn)象，但尚未驗(yàn)證其是否同樣具備分泌木聚糖酶的能力。綜上所述，該細(xì)菌擁有較強(qiáng)果膠酶分泌能力，能有效實(shí)現(xiàn)果膠類物質(zhì)的降解，且對(duì)麻纖維的損傷較小。

表4 果膠桿菌 WNH 與已發(fā)表菌株產(chǎn)酶性能的對(duì)比

  

與苧麻等麻類的研究相比，漢麻生物脫膠的研究則相對(duì)較少，且由于漢麻原料的特殊性，漢麻生物脫膠難度較大。但漢麻纖維性能相對(duì)優(yōu)異，吸引諸多研究者進(jìn)行研究，楊田[24]等篩選的枯草芽孢桿菌可以在脫膠處理 4 d 后將殘膠率降低到 13%，精干麻纖維柔軟、色澤光亮。童藝翾[25]等使用厭氧生物脫膠系統(tǒng)，處理 72 h 后，漢麻纖維殘膠率為 20.13%。Li[26]等使用裂褶菌(Schizophyllum commune)處理漢麻纖維兩周，木質(zhì)素、半纖維素等含量均呈現(xiàn)不同程度的降低，但分泌的纖維素酶的造成一定程度的纖維損傷。成莉鳳[27]克隆純化果膠解聚酶 419 和 G403，較原始菌株 DCE−01 分泌的果膠解聚酶酶活力分別提高了 13.3 倍和 2.2 倍，且兩株酶均表現(xiàn)出良好的耐熱耐堿性。Alqahtani[28]將來自枯草芽孢桿菌 15A B−92 的果膠酶進(jìn)行純化，純化后果膠酶比活性為 99.6 U/mg，純化程度為 11.6 倍。Xu[29]采用基因工程方法獲得的分泌突變型果膠酸裂解酶(Pel419) 的菌株 V52A，其處理苧麻效果與商業(yè)果膠酶處于同一水平。Rafique [30]從胡蘿卜軟腐果膠桿菌中分離出編碼內(nèi)切半乳糖醛酸酶的基因，使用 pHT43 表達(dá)載體于枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，能在 IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)下穩(wěn)定表達(dá)胞外果膠酶。

本研究獲得的果膠桿菌 WNH 進(jìn)行漢麻生物脫膠，經(jīng)脫膠處理后，漢麻纖維手感柔和、分散明顯，通過 SEM 觀察纖維表面的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)纖維表面光滑、膠質(zhì)殘留少、纖維損傷少，有利于其在紡織等領(lǐng)域的應(yīng)用，說明該果膠桿菌 WNH 具被應(yīng)用于漢麻生物脫膠生產(chǎn)的潛力。

本研究獲得一株能高效分泌胞外果膠酶、具備一定脫膠功能的果膠桿菌 WNH(P.aroidearum WNH)，在培養(yǎng)溫度 27 °C、轉(zhuǎn)速為 160 r/min、接種量 10%、初始 pH=7、培養(yǎng)菌株 WNH 16 h 的條件下，果膠酶酶活力為 155.03 U/mL。使用果膠桿菌 WNH 對(duì)漢麻韌皮進(jìn)行二次脫膠處理，其脫膠率為 27.18%，較對(duì)照組顯著提高 6.93%。該菌株具備漢麻生物脫膠的應(yīng)用潛力。

本研究主要就果膠桿菌 WNH 的產(chǎn)酶性能和脫膠效果進(jìn)行研究。要進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力，更好的發(fā)揮脫膠功能，通過果膠酶純化、果膠酶基因異源表達(dá)等方法，將是今后的研究方向。

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文章摘自：劉嘉樂，郭媛，黃榮，趙信林，邱財(cái)生，邱化蛟，王偉東.果膠桿菌(Pectobacterium aroidearum)WNH的篩選及其漢麻生物脫膠效果[J/OL].微生物學(xué)通報(bào)：1-13[2022-12-02].DOI：10.13344/j.microbiol.china.220826.