摘 要：目的:建立羅布麻葉破壁飲片的UPLC指紋圖譜及有效成分量測(cè)定方法。方法:采用ACQUITY UP-LC®HSS T3 C18(100mm×2.1mm，1.8μm)色譜柱；以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；流速為0.3mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm；柱溫為25℃。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。結(jié)果:15批破壁飲片樣品指紋圖譜標(biāo)定了17個(gè)共有峰，指認(rèn)了金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素3個(gè)成分；與對(duì)照?qǐng)D譜相似度為0.922～0.994，HCA及PCA分析將15批樣品分為3類，OPLS-DA分析找到對(duì)評(píng)價(jià)羅布麻葉破壁飲片質(zhì)量一致性和分類貢獻(xiàn)較大的7個(gè)成分；羅布麻葉破壁飲片中的金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素含量分別為2.338～4.092mg/g、3.339～5.670mg/g、0.135～0.696mg/g。結(jié)論:該研究建立的指紋圖譜及含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別可用于羅布麻葉破壁飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制。
關(guān)鍵詞：羅布麻葉；破壁飲片；指紋圖譜；含量測(cè)定；質(zhì)量控制
羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉，具有平肝安神、清熱利水的功效，用于治療肝陽(yáng)眩暈、心悸失眠、浮腫尿少，分布于我國(guó)西北和華北地區(qū)的鹽漬荒漠或半荒漠土壤，河北中南部、天津是其適宜生境〔1，2〕?，F(xiàn)代研究表明羅布麻葉主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、三萜及甾醇類等成分〔3-6〕，具有鎮(zhèn)靜催眠、降血壓、降血脂、抗抑郁、抗氧化、止咳、平喘、化痰等作用〔7-11〕。
羅布麻葉破壁飲片是將其傳統(tǒng)飲片通過(guò)現(xiàn)代粉碎技術(shù)加工至粒徑D90<45μm的粉體，進(jìn)一步通過(guò)制粒成型技術(shù)制成的可直接口服的30～100目顆粒狀飲片，具有質(zhì)量均一、成分高效利用、服用便捷等特點(diǎn)。2020年版中國(guó)藥典一部羅布麻葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中是以對(duì)照藥材、槲皮素和山柰酚對(duì)照品為薄層定性鑒別指標(biāo)，以金絲桃苷作為含量測(cè)定指標(biāo)，缺少可反映批間質(zhì)量一致性的指標(biāo)，存在一定的局限性。為了更科學(xué)、有效評(píng)價(jià)和控制羅布麻葉破壁飲片的質(zhì)量，本研究建立其UPLC指紋圖譜和多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，結(jié)合聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等方法進(jìn)行研究，尋找對(duì)評(píng)價(jià)羅布麻葉破壁飲片質(zhì)量一致性和分類貢獻(xiàn)較大的主要因素，以期為提高羅布麻葉破壁飲片的質(zhì)量控制水平提供參考。
1儀器與材料
1.1儀器
Waters H-class型超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204型萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
1.2材料
金絲桃苷(批號(hào):111521-201809，質(zhì)量分?jǐn)?shù):94.9%)、異槲皮苷(批號(hào):250004-202011，質(zhì)量分?jǐn)?shù):97.2%)、槲皮素(批號(hào):100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù):99.1%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水；其余試劑均為分析純；2020年6月從羅布麻葉的3個(gè)主產(chǎn)地共采集樣品15批，經(jīng)中智藥業(yè)集團(tuán)賈世清主管中藥師鑒定為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉，凈制、切段成傳統(tǒng)飲片(編號(hào):DP1～DP15)，超微粉碎制備成破壁粉體(中間體，編號(hào):UP1～UP15)，經(jīng)“無(wú)添加制粒”專利技術(shù)制成羅布麻葉破壁飲片(成品不含輔料，編號(hào):S1～S15)。破壁飲片及其原料藥材的產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。
表1 羅布麻葉樣品來(lái)源信息
2方法與結(jié)果
2.1溶液的制備
2.1.1供試品溶液:
取羅布麻葉破壁飲片約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇15mL，稱重，超聲(560W，40kHz)30min，冷卻至室溫，用70%甲醇補(bǔ)重，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
2.1.2對(duì)照品溶液:
精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度分別為1.0、1.8、0.7mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇制成濃度分別為150、170、20μg/mL的混合對(duì)照品溶液。
2.2色譜條件
色譜柱為ACQUITY UPLC®HSS T3 C18(100mm×2.1mm，1.8μm)柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～6min，9%A；6～8min，9～14%A；8～25min，14%～18%A；25～37min，18%～45%A；37～40min，45%～9%A)；流速為0.3mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為2μL。
2.3指紋圖譜研
2.3.1精密度試驗(yàn):
取羅布麻葉破壁飲片供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以4號(hào)金絲桃苷色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.00%，相對(duì)峰面積RSD<1.00%，表明儀器精密度良好。
2.3.2重復(fù)性試驗(yàn):
取同一批羅布麻葉破壁飲片6份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以4號(hào)金絲桃苷色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.00%，相對(duì)峰面積RSD<2.50%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn):
取羅布麻葉破壁飲片供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，以4號(hào)金絲桃苷色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.00%，相對(duì)峰面積RSD<4.90%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.4指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià):
取15批羅布麻葉破壁飲片樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，以S14號(hào)樣品的圖譜為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正后采用平均數(shù)法(時(shí)間窗0.1min)生成疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖1，確定了17個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品(圖2)比對(duì)，指認(rèn)了其中3個(gè)成分，分別為金絲桃苷(4號(hào))、異槲皮苷(5號(hào))、槲皮素(16號(hào))。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。各樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.922～0.994，說(shuō)明15批破壁飲片樣品質(zhì)量較穩(wěn)定。
圖1 15批羅布麻葉破壁飲片UPLC疊加圖譜(S1～S15)及對(duì)照?qǐng)D譜(R)
圖2 混合對(duì)照品溶液的HPLC色譜圖
4.金絲桃苷5.異槲皮苷16.槲皮素
表2 羅布麻葉破壁飲片指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
表3 羅布麻葉中3個(gè)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果
2.4成分含量測(cè)定
2.4.1線性關(guān)系考察:
取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表3。
2.4.2精密度試驗(yàn):
取羅布麻葉破壁飲片供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算得到金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.72%、0.78%、0.87%，表明儀器精密度良好。
2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn):
取羅布麻葉破壁飲片供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.51%、1.18%、0.83%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.4重復(fù)性試驗(yàn):
取同一批羅布麻葉破壁飲片(S14)6份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.72%、0.74%、0.54%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.4.5加樣回收率試驗(yàn):
取已知成分含量的羅布麻葉破壁飲片(S14)9份，每份0.5g，精密稱定，分別按已知成分含量50%、100%、150%的比例加入各對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的平均加樣回收率分別為97.93%、100.14%、100.21%，RSD分別為0.52%、2.26%、2.46%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。
2.4.6樣品含量測(cè)定:
取15批羅布麻葉破壁飲片樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。15批羅布麻葉破壁飲片中金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素含量分別為2.338～4.092mg/g、3.339～5.670mg/g、0.135～0.696mg/g；不同產(chǎn)地原藥材所制備破壁飲片中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素含量差異較大。
表4 羅布麻葉破壁飲片中3個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)
2.5化學(xué)計(jì)量學(xué)分析
2.5.1系統(tǒng)聚類分析(HCA):
以羅布麻葉破壁飲片中17個(gè)共有峰的峰面積為變量，運(yùn)用SPSS22.0軟件，采用Ward連結(jié)法選用Z得分對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以平方歐式距離測(cè)量進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)平方歐式距離為5時(shí)，樣品被分為3類，圖315批羅布麻葉破壁飲片HCA圖其中第1類為S1～S8號(hào)樣品，第2類為S9、S10號(hào)樣品，第3類為S11～S15號(hào)樣品。當(dāng)平方歐式距離為15時(shí)，原藥材產(chǎn)自河北青縣和滄縣的破壁飲片S1～S10號(hào)樣品歸為一類，而原藥材產(chǎn)自天津靜海的破壁飲片S11～S15號(hào)樣品歸為一類。15批樣品的含量測(cè)定結(jié)果結(jié)合聚類分析結(jié)果初步顯示，羅布麻葉破壁飲片的質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)和分類與原藥材的產(chǎn)地具有較大相關(guān)性。
圖3 15批羅布麻葉破壁飲片HCA圖
2.5.2主成分分析(PCA):
采用SIMCA-P14.1軟件，以17個(gè)共有峰的峰面積為變量進(jìn)行PCA，模型解釋率參數(shù)R2X為0.989，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.956，表明該模型穩(wěn)定、可靠；PCA得分圖結(jié)果與HCA結(jié)果一致，見(jiàn)圖4。15批破壁飲片按原藥材的產(chǎn)地被分為2類樣本點(diǎn)；原藥材產(chǎn)自天津靜海的破壁飲片樣品能與河北的樣品顯著分開(kāi)，原藥材產(chǎn)自河北青縣和滄縣的破壁飲片樣品(S1～S8)無(wú)法區(qū)分。
圖4 15批羅布麻葉破壁飲片PCA得分圖
2.5.3正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA):
采用SIMCA-P14.1軟件，在PCA分析的基礎(chǔ)上，以17個(gè)共有峰面積為變量進(jìn)行OPLS-DA分析，得分矩陣圖見(jiàn)圖5，變量重要性投影(VIP值)圖見(jiàn)圖6。模型累積解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.996和0.984，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.948，說(shuō)明具有較好的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力，可用于分析不同質(zhì)量的樣品；由OPLS-DA得分矩陣圖可知，15批樣品可分為4類，產(chǎn)自天津靜海的藥材所制備破壁飲片聚為1類，與河北藥材所制樣品顯著分開(kāi)；產(chǎn)自河北滄縣藥材所制備破壁飲片聚為1類；產(chǎn)自河北青縣藥材所制備破壁飲片分為2類，具有較大的質(zhì)量差異性；以VIP>1.0為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出對(duì)OPLS-DA模型分類貢獻(xiàn)度大的變量，依次為色譜峰8、4、2、5、7、9、17號(hào)。
圖5 15批羅布麻葉破壁飲片OPLS-DA得分圖
圖6 羅布麻葉破壁飲片OPLS-DAVIP值圖
2.6基于量質(zhì)傳遞分析制備工藝對(duì)破壁飲片質(zhì)量的影響
2.6.1破壁飲片及其中間體、原藥材的指紋圖譜測(cè)定:
從OPLS-DA分析后的4類破壁飲片中各取1批破壁飲片樣品(S5、S8、S10、S11)及其對(duì)應(yīng)的中間體(UP5、UP8、UP10、UP11)和原藥材飲片(DP5、DP8、DP10、DP11)，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖7。
2.6.2破壁飲片—中間體—原藥材的量質(zhì)傳遞分析:
將來(lái)源于同批藥材的破壁飲片及其中間體(破壁粉體)和原藥材(傳統(tǒng)飲片)的UPLC指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行單組數(shù)據(jù)分析。由傳統(tǒng)飲片依次制備成破壁粉體和破壁飲片成品，指紋圖譜的全譜相似度均≥0.997，見(jiàn)表5～8；除11、12、16、17號(hào)共有峰外，其它13個(gè)共有峰的破壁飲片-中間體-原料之間的峰面積RSD平均值均<5.00%，而峰面積RSD平均值>5.00%的4個(gè)峰均不屬于對(duì)OPLS-DA分類貢獻(xiàn)度較大的共有峰，見(jiàn)表9。表明破壁飲片—中間體—原藥材的化學(xué)相關(guān)性高，量質(zhì)傳遞效果好，破壁飲片的制備工藝技術(shù)及過(guò)程控制未造成顯著的成分流失、新成分生成或成分含量降低、升高。
表5 羅布麻葉破壁飲片(S5)及其中間體(UP5)、原料(DP5)的相似度
表6 羅布麻葉破壁飲片(S8)及其中間體(UP8)、原料(DP8)的相似度
表7 羅布麻葉破壁飲片(S10)及其中間體(UP10)、原料(DP10)的相似度
表8 羅布麻葉破壁飲片(S11)及其中間體(UP11)、原料(DP11)的相似度
表9 羅布麻葉破壁飲片及其中間體(破壁粉體)、原料(傳統(tǒng)飲片)的UPLC指紋圖譜共有峰面積RSD值(%)
圖7 羅布麻葉破壁飲片及其中間體(破壁粉體)、原料(傳統(tǒng)飲片)的 UPLC 疊加圖譜比較
3討論
3.1色譜條件的確定
試驗(yàn)前期對(duì)色譜條件進(jìn)行了系統(tǒng)考察，包括不同的流動(dòng)相系統(tǒng)(乙腈-0.1%醋酸溶液、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%磷酸溶液-乙腈、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-水)、柱溫(20、25、30、35、40℃)、流速(0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mL/min)、進(jìn)樣量(1、2、3、4、5μL)、波長(zhǎng)，最終確定了羅布麻葉破壁飲片指紋圖譜分析和含量測(cè)定的最佳色譜條件。
3.2中藥破壁飲片批間質(zhì)量一致性的控制
通過(guò)對(duì)15批羅布麻葉破壁飲片UPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA、PCA和OPLS-DA分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地原藥材所制備的破壁飲片質(zhì)量具有顯著性差異；金絲桃苷和異槲皮苷的含量測(cè)定結(jié)果也表現(xiàn)出顯著的地域性差異；對(duì)破壁飲片及其中間體、原藥材飲片的指紋圖譜進(jìn)行了全譜相似度分析和共有峰峰面積比較，發(fā)現(xiàn)制備工藝過(guò)程的量質(zhì)傳遞高效，通過(guò)工藝技術(shù)的先進(jìn)性和標(biāo)準(zhǔn)化的過(guò)程控制實(shí)現(xiàn)破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的同質(zhì)性。綜合分析，原藥材質(zhì)量是影響羅布麻葉破壁飲片成品質(zhì)量一致性的主要因素之一，在產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中，除需關(guān)注固定原藥材產(chǎn)地外，還需進(jìn)一步統(tǒng)一控制生長(zhǎng)年限、采收時(shí)間、產(chǎn)地加工方法等，實(shí)施全產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量控制，必要時(shí)進(jìn)行均一化處理，提高批間質(zhì)量一致性。通過(guò)OPLS-DA分析，找出對(duì)不同批次羅布麻葉破壁飲片分類貢獻(xiàn)較大的7個(gè)成分，也是鑒別批間質(zhì)量一致性的主要標(biāo)志性成分，在該品種后續(xù)的質(zhì)量控制方法優(yōu)化研究中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注，特別是具有藥理活性且含量可達(dá)定量限度要求的標(biāo)志性成分應(yīng)建立含量測(cè)定質(zhì)量控制項(xiàng)，提高該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
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文章摘自：?jiǎn)绦l(wèi)林，黃麗桃，彭麗華，陳煒璇，史軍杰，陳金梅.羅布麻葉破壁飲片的指紋圖譜和多成分定量質(zhì)量控制研究[J/OL].中藥材，2023(01):137-143[2023-03-19].DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2023.01.024.
