摘  要:目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究羅布麻治療非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制。方法：檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)獲取羅布麻活性成分及靶點(diǎn)，通過(guò)GeneCards、OMIM、TTD等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取非酒精性脂肪肝病相關(guān)靶點(diǎn)。借用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)羅布麻與疾病的共同靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；利用Cytoscape軟件對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析以得到羅布麻治療非酒精性脂肪肝核心作用靶點(diǎn)，再利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。結(jié)果：篩選得到羅布麻治療非酒精性脂肪肝核心成分20個(gè)，核心靶點(diǎn)包括TP53、SRC、HSP90AA1等45個(gè)，涉及癌癥、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信號(hào)通路。結(jié)論：揭示了羅布麻治療非酒精性脂肪肝的多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用特點(diǎn)，為深入研究羅布麻緩解非酒精性脂

關(guān)鍵詞:羅布麻；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；非酒精性脂肪肝；靶點(diǎn)；作用機(jī)制

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是因飲食習(xí)慣、肥胖等因素導(dǎo)致人體肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)多積聚而引起的一種代謝綜合征^[1]。在我國(guó)，其發(fā)病率逐年上升，總體患病率為29.8%^[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種藥食同源植物具有保肝護(hù)肝作用，比如羅布麻(Apocynum venetum L.)，其葉可做保健食品用外，同時(shí)被《中國(guó)藥典》2020年版收錄，具有平肝安神、清熱利水的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，羅布麻提取物具有降血脂、降肝脂、抗氧化應(yīng)激和改善代謝綜合征大鼠脂肪性肝病的作用，此外還可顯著緩解對(duì)乙酰氨基酚(APAP)、四氯化碳、d-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肝損傷^[3-7]。但至今未發(fā)現(xiàn)羅布麻抗非酒精性脂肪肝作用機(jī)制方面的文獻(xiàn)報(bào)道?；诖耍疚囊粤_布麻抗非酒精性脂肪肝藥效成分為研究對(duì)象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討其治療非酒精性脂肪肝疾病多成分、多靶點(diǎn)、多路徑的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)綠色健康的特醫(yī)食品和功能食品奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 羅布麻化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)收集

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)及文獻(xiàn)調(diào)研等收集羅布麻所含化學(xué)成分。借用Swiss Drug Design(http://swisstargetprediction.ch/)、SuperPred webserver、Targnet、STITCH等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取羅布麻所含化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化處理以獲得標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 非酒精性脂肪肝疾病靶點(diǎn)收集

以“Nonalcoholic fatty liver disease”、“Non-alcoholic fatty liver disease”、“Non alcoholic fatty liver disease”、“NAFLD”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/search)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，經(jīng)合并去重后得到非酒精性脂肪肝病關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)。

1.3 獲取羅布麻與非酒精性脂肪肝病共同靶點(diǎn)

使用Venny 2.1.0在線平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對(duì)羅布麻作用靶點(diǎn)與非酒精性脂肪肝疾病靶點(diǎn)取交集，得到羅布麻與非酒精性脂肪肝病的共同靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，將1.3中的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homosapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為0.700，相關(guān)游離節(jié)點(diǎn)隱藏，其余設(shè)置不變，得到PPI網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)數(shù)據(jù)，再將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。PPI網(wǎng)絡(luò)圖可為提取羅布麻治療非酒精性脂肪肝病核心靶點(diǎn)提供依據(jù)，另以核心靶點(diǎn)Degree值為標(biāo)準(zhǔn)，確定羅布麻抗非酒精性脂肪肝病的關(guān)鍵化學(xué)成分。

1.5 GO 功能富集和 KEGG 通路富集分析

將1.3中的共同靶點(diǎn)輸入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)，分別進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析；其中GO又分為生物過(guò)程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組成(CC)三類(lèi)，且以P＜0.01為篩選條件，分別選取前10個(gè)生物學(xué)條目繪制條形圖。KEGG富集分析同樣以P＜0.01為顯著富集篩選條件，選取前15條信號(hào)通路繪制氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 羅布麻活性成分的收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

經(jīng)TCMSP、國(guó)家科技圖書(shū)文獻(xiàn)中心、Swiss Drug Design、SuperPred webserver、Targnet、STITCH等數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得羅布麻活性成分124種^[8-14]，涉及929個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 非酒精性脂肪肝病靶點(diǎn)篩選

借助GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)整合處理后共得到非酒精性脂肪肝病作用靶點(diǎn)6720個(gè)。利用Venny平臺(tái)，得到羅布麻與非酒精性脂肪肝疾病的共同靶點(diǎn)678個(gè)，繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1。

2.3 PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)圖及數(shù)據(jù)分析

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入2.2中的共同靶點(diǎn)，并借助Cytoscape 3.9.0軟件，可得到擁有643個(gè)節(jié)點(diǎn)，11418條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)，篩選度值Degree前45的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)(見(jiàn)表1)。將核心靶點(diǎn)歸入到羅布麻各化學(xué)成分中，計(jì)算出各個(gè)化合物所對(duì)應(yīng)的核心靶點(diǎn)Degree值之和，以得到羅布麻治療非酒精性脂肪肝病的關(guān)鍵化學(xué)成分，見(jiàn)表2。

2.4 GO功能富集分析和 KEGG 通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)678個(gè)共同靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO和KEGG分析。其中GO功能富集分析包括生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)三部分，并將各自前10條目繪制條形圖，橫坐標(biāo)代表GO的各個(gè)條目，縱坐標(biāo)代表富集到與該條目的靶點(diǎn)數(shù)目，見(jiàn)圖3。BP主要涉及蛋白磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、肽基絡(luò)氨酸磷酸化、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等生物過(guò)程；MF主要包括蛋白激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、ATP結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等功能；CC主要包含質(zhì)膜、胞液、受體復(fù)合物、神經(jīng)元細(xì)胞體、細(xì)胞表面等組成。將KEGG通路富集分析的前15條通路繪制氣泡圖進(jìn)行可視化分析，主要涉及癌癥通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信號(hào)通路，如圖4所示。

3 結(jié)論

羅布麻(Apocynum venetum L.)為夾竹桃科羅布麻屬植物，直立半灌木，又稱(chēng)茶葉花、野麻、野務(wù)其干(新疆維語(yǔ))等。國(guó)內(nèi)主要分布于新疆、青海、甘肅及內(nèi)蒙古等省區(qū)，廣泛野生在鹽堿荒地、沙漠邊緣、戈壁荒灘及河流兩岸等地。該植物具有保肝護(hù)肝、抗氧化、抗癌抑菌、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝平衡等多種生物活性[15-17]，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步研究羅布麻保肝的作用機(jī)制，為其應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，羅布麻作用于非酒精性脂肪肝的關(guān)鍵化學(xué)成分為奎寧酸、四甲基吡嗪、槲皮素、東莨菪內(nèi)酯等。其中奎寧酸具有較強(qiáng)的抗氧化性、DNA修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)功能^[18]。四甲基吡嗪通過(guò)抑制炎癥因子和p-NF-B/ROS信號(hào)通路，對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠具有顯著的肝保護(hù)作用^[19]。槲皮素具有抗氧化性、降血壓、降血脂等作用，并有實(shí)驗(yàn)證明槲皮素可減輕模型鼠炎癥、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝以治療NAFLD^[20]。東莨菪內(nèi)酯通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞^[21]，此外還可促進(jìn)胰島素分泌^[22]，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥基因來(lái)改善非酒精性脂肪肝病^[23]。

本研究表明羅布麻治療非酒精性脂肪肝病的核心靶點(diǎn)為TP53、SRC、HSP90AA1、MAPK3、AKT1、MAPK1等。TP53是目前常見(jiàn)的抑癌基因，在非酒精性脂肪肝患者的肝組織中表達(dá)顯著^[24]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)若抑制TP53表達(dá)可減緩肝細(xì)胞衰老或凋亡以及脂質(zhì)的過(guò)度積累和氧化應(yīng)激^[25]，進(jìn)而緩解非酒精性脂肪肝病的發(fā)展。SRC激酶是治療乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、遷移、侵襲的一個(gè)抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，大量實(shí)驗(yàn)證明，抑制SRC的磷酸化可緩解非酒精性脂肪肝炎^[26]、阻止肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，減緩肝癌進(jìn)展^[27-28]。

KEGG富集分析顯示，羅布麻治療非酒精性脂肪肝病主要涉及癌癥、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信號(hào)通路。最近研究表明，非酒精性脂肪肝病患者在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、肝細(xì)胞功能改變、胰島素抵抗及脂肪源性激素等因素作用下，可促使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生^[29]。武鈺林等^[30]研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒X蛋白通過(guò)增強(qiáng)肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白表達(dá)以促進(jìn)胰島素抵抗，進(jìn)而增加患NAFLD的概率。此外，研究發(fā)現(xiàn)^[31]AGE-RAGE信號(hào)通路不僅可激活NF-κB、TGFβ、VEGF，還可增強(qiáng)炎性因子釋放，以促進(jìn)非酒精性脂肪肝病發(fā)展。推測(cè)羅布麻可能通過(guò)干預(yù)癌癥、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信號(hào)通路以緩解非酒精性脂肪肝病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，羅布麻可能通過(guò)奎寧酸、四甲基吡嗪、槲皮素、東莨菪內(nèi)酯等活性成分作用于TP53、SRC、HSP90AA1等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)NAFLD相關(guān)通路，以治療非酒精性脂肪性肝病。本研究結(jié)果證實(shí)了羅布麻抗非酒精性肝病多成分、多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)的作用特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究羅布麻緩解NAFLD提供了理論依據(jù)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法具有一定的局限性，后續(xù)將進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以明確羅布麻抗NAFLD的主要調(diào)控靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] Cotter T G，Rinella M．Nonalcoholic fatty liver disease 2020：the state of the disease[J]．Gastroenterology，2020，158(7)：1851-1864．

[2] LI J，ZOU BY，YEO YH，et al．Prevalence，incidence，and outcome of non-alcoholic fatty liver disease in Asia，1999-2019：a systematic review and meta-analysis[J]．Lancet Gastroenterol Hepatol，2019，4(5)：389-398．

[3] Xie W，Chen C，Jiang Z，et al．Apocynum venetum Attenuates Acetaminophen-Induced Liver Injury in Mice[J]．American Journal of Chinese Medicine，2015，43(3)：457-476．

[4] Xiong Q，F(xiàn)an W，Tezuka Y，et al．Hepatoprotective effect of Apocynum venetum and its active constituents[J]．Planta Medica，2000，66(2)：127-133．

[5] 楊新波，吳向起，楊解人，等．羅布麻葉提取物對(duì)兩腎一夾高糖高脂飲 食大鼠脂肪性肝病的保護(hù)作用[J]．世界華人消化雜志，2009(2)：6．

[6] Wang L，Zhang X，Niu Y，et al．Anticoagulant activity of two novel polysaccharides from flowers of Apocynum venetum L[J]．International Journal of Biological Macromolecules，2018，124．

[7] 許澤恭，白榮鈺，嚴(yán)雪梅，等．羅布麻葉總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠的降脂 作用研究[J]．中藥新藥與臨床藥理，2021，32(02)：208-213．

[8] 汪永琴，盧彬，李芳，等．頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定羅布 麻茶香氣成分[J]．食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，010(013)：4222-4226．

[9] 陳帥，王亮，齊絨絨，等．UPLC 法同時(shí)測(cè)定羅布麻葉中 7 種成分[J]．中 成藥，2020，042(012)：3211-3215．

[10] 張娟，卿德剛，孫宇，等．化學(xué)計(jì)量學(xué)輔助分析羅布麻中的黃酮類(lèi)成 分[J]．西北藥學(xué)雜志，2020，035(002)：173-177．

[11] 徐絢絢，鞏繼賢，張健飛，等．羅布麻抑菌物質(zhì)及其作用機(jī)制的研究 進(jìn)展[J]．紡織學(xué)報(bào)，2020，041(009)：149-154．

[12] 周金輝．羅布麻葉多糖提取及其生物活性的研究[D]．青島大學(xué)，2020．

[13] 徐碩，金鵬飛，徐文峰，等．羅布麻葉的 HPLC 指紋圖譜及抗氧化活 性譜效關(guān)系研究[J]．西北藥學(xué)雜志，2020，035(004)：475-480．

[14] 艾比拜罕·麥提如則，張娟，朱軍，等．不同采收期羅布麻和白麻藥材 化學(xué)成分的差異分析[J]．氨基酸和生物資源，2021，043(003)：211-217．

[15] Zhang W，Dong Z，Chang X，et al．Protective effect of the total flavonoids from Apocynum venetum L．on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in vitro and in vivo[J]．J Physiol Biochem，2018，74：301-312．

[16] Dadea C，Dejmkova H，Scampicchio M，et al．Medical compounds and the antioxidant capacity of aqueous extracts of Apocynum venetum L．in Xinjiang NW China[J]．Monatsh Chem，2019，150：451-460．

[17] Huang S P，Ho T M，Yang C W，et al．Chemopreventive Potential of Ethanolic Extracts of Luobuma Leaves (Apocynum venetum L．) in Androgen Insensitive Prostate Cancer[J]．Nutrients，2017，9：948．

[18] 張偉．以莽草酸為起始原料合成奎寧酸[D]．華東理工大學(xué)，2015．

[19] Chen Bing，Ma Yaluan，Xue Xin，et al．Tetramethylpyrazine reduces inflammation in the livers of mice fed a high fat diet[J]．Molecular medicine reports，2019，19(4 Pt．B)：2561-2568．

[20] YANG H，YANG T T，HENG C，et al．Quercetin improves nonalc-oholic fatty liver by ameliorating inflammation，oxidative stress，and lipid metabolism in db/db mice[J]．Phytother Res，2019，33(12)：3140-3152．

[21] Wu Zongmei．Scopoletin and umbelliferone protect hepatocytes against palmitate- and bile acid-induced cell death by reducing endoplasmic reticulum stress and oxidative stress[J]．Toxicology and Applied Pharmacology，2021， 115858．

[22] Eun P J，Young K S，Han J S．Scopoletin stimulates the secretion of insulin via a KATP channel-dependent pathway in INS-1 pancreatic β cells[J]．Journal of Pharmacy and Pharmacology，2022(9)：9．

[23] Ham J R，Lee H I，Choi R Y，et al．Anti-obesity and anti-hepatosteatosis effects of dietary scopoletin in high-fat diet fed mice[J]．Journal of Functional Foods，2016，25：433-446．

[24] YAN Z，MIAO X，ZHANG B，et al．p53 as a double-edged sword in the progression of non-alcoholic fatty liver disease[J]．Life Sciences，2018，215： 64-72．

[25] 嚴(yán)峻彬，聶云夢(mèng)，張婷婷，等．益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方通過(guò)調(diào)控 CDKN1A 改 善非酒精性脂肪性肝炎的研究[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2022，38(02)：311-318．

[26] Sanabria Juan．Src-phosphorylation at the α1-Na/K-ATPase is Associated with Microbiota Community Changes in Diet-Induced NASH in the Murine [J]．The FASEB Journal，2021，35．

[27] Jiang XiaoLi．Dihydrotanshinone I inhibits the growth of hepatoma cells by direct inhibition of Src[J]．Phytomedicine ：international journal of phytotherapy and phytopharmacology，2021，95：153705-153705．

[28] Zhao Ran et al．Corrigendum to “EF24 Suppresses Invasion and Migration of Hepatocellular Carcinoma Cells via Inhibiting the Phosphorylation of Src” [J]．BioMed Research International，2021：9839618-9839618．

[29] 屠燕，楊嬋娟，黃瑩，等．非酒精性脂肪肝與心血管疾病相關(guān)性的研 究[J]．自然雜志，2022，44(02)：149-154．

[30] 武鈺林，楊慷．乙型肝炎與非酒精性脂肪性肝病的相關(guān)性[J]．肝臟， 2018，23(7)：75-78．

[31] 楊超茅，楊志新，馬曉玲．AGEs-RAGE 信號(hào)通路在糖尿病腎病中的 作用機(jī)制及中醫(yī)藥研究進(jìn)展[J]．中醫(yī)學(xué)報(bào)，2019(9)：63-67．

文獻(xiàn)摘自：王同為,米慧佳,盧劉欣,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥 理學(xué)探究羅布麻治療非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制[J].廣東化 工,2023,50(9):64-66+6.