摘  要：本發(fā)明屬于化妝品原料技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種羅布麻發(fā)酵提取物及其制備方法和應(yīng)用。該制備方法按照以下步驟：在沸水中加入5％～10％的羅布麻碎粉，90～100℃浸泡10～30min，冷卻至室溫得到未濾渣的羅布麻水提液；將未濾渣的羅布麻水提液加入滅活乳酸菌菌液和葡萄糖得到發(fā)酵培養(yǎng)基，往每公斤發(fā)酵培養(yǎng)基中加入假絲酵母2×10⁸～5×10¹⁰個，在37～42℃溫度下發(fā)酵3～6h得到發(fā)酵液；對發(fā)酵液進行過濾、離心、二次過濾獲得羅布麻發(fā)酵提取物。發(fā)明發(fā)酵提取物降低了細(xì)胞毒性的同時減少對表皮葡萄球菌的抑制，也保留了對其它兩種致病菌的抑菌效果，提高了抗炎的效果，增強了修復(fù)細(xì)胞的活性，整體上提高了效率。

 

權(quán)利要求書

1.一種羅布麻發(fā)酵提取物的制備方法，其特征在于按照以下操作步驟：

(1)向沸水中加入羅布麻碎粉，90～100℃浸泡10～30min，冷卻至室溫得到未濾渣的羅布麻水提液；所述羅布麻碎粉的質(zhì)量為沸水質(zhì)量的5％～10％；

(2)將步驟(1)所得未濾渣的羅布麻水提液加入滅活乳酸菌菌液和葡萄糖得到發(fā)酵培養(yǎng)基，往每公斤發(fā)酵培養(yǎng)基中加入假絲酵母2×10⁸～5×10¹⁰個，在37～42℃溫度下發(fā)酵3～6h得到發(fā)酵液；所述滅活乳酸菌菌液的加入量為未濾渣的羅布麻水提液質(zhì)量的5％～10％，所述葡萄糖的加入量為未濾渣的羅布麻水提液質(zhì)量的0.2％～1％；

(3)對步驟(2)所得發(fā)酵液進行過濾、離心、二次過濾獲得羅布麻發(fā)酵提取物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)所述羅布麻為市售羅布麻，包含市售羅布麻的莖和葉；所述羅布麻碎粉為羅布麻粉碎至20目以上。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)所述乳酸菌為植物乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、腸膜明串珠菌的一種或者多種組合乳酸菌；所述假絲酵母為熱帶假絲酵母、齊藤假絲酵母、蜂生假絲酵母的一種或多種組合。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)所述滅活乳酸菌菌液的總菌數(shù)不少于5×10¹⁰個/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)所述滅活乳酸菌菌液由相應(yīng)的乳酸菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后離心得到菌體，用純化水重懸至所需濃度，再經(jīng)過高溫滅菌獲得。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(3)所述過濾是過50～400目篩；所述離心是采用5000～15000rpm轉(zhuǎn)速進行離心；所述二次過濾是采用0.22～0.45um濾膜進行過濾。

7.一種由權(quán)利要求1所述的制備方法制備得到的羅布麻發(fā)酵提取物。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的羅布麻發(fā)酵提取物在化妝品中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述化妝品為具有抑菌、消炎、修復(fù)功效的化妝品。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述化妝品為面膜、精華液、爽膚水、凍干粉或清潔泡沫。權(quán)利要求書1/1頁2CN116350561A2一種羅布麻發(fā)酵提取物及其制備方法和應(yīng)用

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化妝品原料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物發(fā)酵類化妝品原料及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種羅布麻發(fā)酵提取物及其制備方法和應(yīng)用。

 

背景技術(shù)

羅布麻(Apocynum venetum L)是一種夾竹桃科多年生宿根半灌木，其莖葉富含黃酮類化合物，含量高達(dá)10mg/g以上。羅布麻主要抑菌物質(zhì)有黃酮類化合物、鞣質(zhì)、甾體及其苷類、香豆素類化合物、酚酸類和苯甲醛類化合物以及揮發(fā)油等。羅布麻提取物對人體皮膚中金葡菌、痤瘡丙酸桿菌這類有害微生物有明顯的抑制效果，但同時也對表皮葡萄球菌有一定的抑制，其多種組分對微生物都有不同程度的抑制作用。羅布麻主要的活性成分黃酮多酚類均易溶于水，可利用熱水浸泡提取。

痤瘡丙酸桿菌是一類在毛囊皮脂腺內(nèi)部寄生的常駐細(xì)菌。當(dāng)皮脂分泌過多、毛囊口堵塞時，菌群平衡被打破，痤瘡丙酸桿菌容易過量繁殖，誘發(fā)多種炎癥因子，從而造成痤瘡癥狀。目前針對痤瘡的治療，主要是采取內(nèi)服及外用敏感的抗菌藥物的方法。外用藥物包括克林霉素凝膠、過氧化本甲酰凝膠等，口服大環(huán)內(nèi)酯類以及四環(huán)素類的抗菌素，能夠明顯的改善痤瘡癥狀。但抗生素的的廣泛使用令痤瘡丙酸桿菌的耐藥性越來越普遍，一項歐洲的調(diào)查顯示，超過2/3的樣本中發(fā)現(xiàn)了耐藥性的痤瘡丙酸桿菌，形勢越來越嚴(yán)峻。不僅如此，抗生素藥物的外用同時也對皮膚正常菌群造成影響，加速了皮膚菌群失衡。

金黃色葡萄球菌，俗稱金葡菌，常見于皮膚表面及上呼吸道黏膜。當(dāng)皮膚損傷存在滲出血液、組織液時，會引起區(qū)域內(nèi)的金葡菌大量繁殖。在痤瘡皮膚中尤其是痘痘皮損周邊存在大量的金葡菌，它分泌毒素加劇了皮膚炎癥，阻礙了皮膚的恢復(fù)。

表皮葡萄球菌是皮膚中的常見菌株，不產(chǎn)生血漿凝固酶也不分泌溶血素，一般情況下不致病，對維持皮膚菌群的平衡有重要的意義。

金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌都是引起皮膚炎癥的主要微生物。在皮膚表面，皮損局部微環(huán)境對金葡菌生長更有利。主要表現(xiàn)在痤瘡區(qū)域有較多金葡菌，它取代了表皮葡萄球菌形成優(yōu)勢菌群。抗生素和一些抑菌植物成分都可以有效抑制、殺滅金葡菌，但同時對表皮葡萄球菌也有較大的影響。當(dāng)藥效過后，短時間內(nèi)皮膚微環(huán)境并沒有發(fā)生根本性變化。菌落數(shù)量都比較少的條件下，金葡萄還是會大量繁殖從而占據(jù)優(yōu)勢地位。要達(dá)到較好的效果通常都需要長時間定時外用藥物，但實際情況往往會出現(xiàn)間斷，從而造成痤瘡反復(fù)。

祛痘除了抑制炎癥，恢復(fù)的過程還涉及到皮膚的修復(fù)。以往在化妝品中可加入表皮生長因子促進皮膚的修復(fù)，然而在生長因子類產(chǎn)品被明確禁用后，修復(fù)類功效產(chǎn)物有廣泛的市場需求。

乳酸菌和釀酒酵母是植物發(fā)酵中常用的微生物，往往一種或多種，一步或兩步發(fā)酵協(xié)同發(fā)酵，可以提高植物活性成分的利用率，減少刺激成分降低毒性，增加活性成分溶出率，減少有機溶劑使用。乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物是化妝品中常用的生物發(fā)酵功效原料。一般乳酸菌發(fā)酵植物后會采用溶胞工藝，釋放胞內(nèi)的多種活性成分和菌體吸附的植物活性成分。羅布麻水提取物對乳酸菌有一定抑制效果，難以在含高比例羅布麻的發(fā)酵體系利用乳酸菌發(fā)酵。利用乳酸菌發(fā)酵少量的羅布麻，大量活性成分會被乳酸菌菌體吸附，需要溶胞工藝來釋放，這造成羅布麻活性成分的損耗。利用酵母發(fā)酵，同樣會面臨活性成分被吸附的問題。而且，隨著時間的增加，羅布麻部分活性成分還會被部分代謝消耗掉。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種羅布麻發(fā)酵提取物的制備方法。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種上述制備方法制備得到的羅布麻發(fā)酵提取物。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種上述羅布麻發(fā)酵提取物的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種羅布麻發(fā)酵提取物的制備方法，按照以下操作步驟：

(1)向沸水中加入羅布麻碎粉，90～100℃浸泡10～30min，冷卻至室溫得到未濾渣的羅布麻水提液；所述羅布麻碎粉的質(zhì)量為沸水質(zhì)量的5％～10％；

(2)將步驟(1)所得未濾渣的羅布麻水提液加入滅活乳酸菌菌液和葡萄糖得到發(fā)酵培養(yǎng)基，往每公斤發(fā)酵培養(yǎng)基中加入假絲酵母2×10⁸～5×10¹⁰個，在37～42℃溫度下發(fā)酵3～6h得到發(fā)酵液；所述滅活乳酸菌菌液的加入量為未濾渣的羅布麻水提液質(zhì)量的5％～10％，所述葡萄糖的加入量為未濾渣的羅布麻水提液質(zhì)量的0.2％～1％；

(3)對步驟(2)所得發(fā)酵液進行過濾、離心、二次過濾獲得羅布麻發(fā)酵提取物。

步驟(1)所述羅布麻為市售羅布麻，包含市售羅布麻的莖和葉；所述羅布麻碎粉為羅布麻粉碎至20目以上。

步驟(2)所述乳酸菌為植物乳桿菌、雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、腸膜明串珠菌的一種或者多種組合乳酸菌；所述假絲酵母為熱帶假絲酵母、齊藤假絲酵母、蜂生假絲酵母的一種或多種組合。

步驟(2)所述滅活乳酸菌菌液的總菌數(shù)不少于5×10¹⁰個/mL。

步驟(2)所述滅活乳酸菌菌液由相應(yīng)的乳酸菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后離心得到菌體，用純化水重懸至所需濃度，再經(jīng)過高溫滅菌獲得。

步驟(3)所述過濾是過50～400目篩；所述離心是采用5000～15000rpm轉(zhuǎn)速進行離心；所述二次過濾是采用0.22～0.45um濾膜過濾。

一種由上述的制備方法制備得到的羅布麻發(fā)酵提取物。

上述的羅布麻發(fā)酵提取物在化妝品中的應(yīng)用。

上述化妝品為具有抑菌、消炎、修復(fù)功效的化妝品。

上述化妝品為面膜、精華液、爽膚水、凍干粉或清潔泡沫。

本發(fā)明的原理是：

為了提高羅布麻在化妝品中的使用價值，采用發(fā)酵的方式進行提取，雖然損失部分抑菌活性，使得最終的抑菌效果發(fā)生改變，同時提高和增加功效。

羅布麻中的活性成分大部分水溶，而且容易被微生物的菌體吸附，并不適合發(fā)酵利用。某些種類的假絲酵母有著適應(yīng)高溫、快速發(fā)酵優(yōu)勢，能在短時間內(nèi)代謝羅布麻的刺激性成分，減少發(fā)酵造成的損耗。在羅布麻發(fā)酵培養(yǎng)基中加入滅活的乳酸菌菌體，通過發(fā)酵分解產(chǎn)生乳酸菌溶胞物，其中的菌體碎片可吸附部分羅布麻的成分。在此共同作用下，可保留大部分抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性成分，減少對表皮葡萄球菌的影響。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明所用方法，圍繞痤瘡皮膚護理的需求，以減弱對皮膚常駐微生物的影響為重心，兼顧修復(fù)和舒緩的功效，不追求最優(yōu)抑菌效果；以損失少部分羅布麻的活性為代價，利用簡單工藝實現(xiàn)多種效果。

(2)本發(fā)明所得羅布麻提取物，與水提液相比有更好的抗炎效果，增加了細(xì)胞修復(fù)活性，不需要復(fù)雜的分離方式就實現(xiàn)了抑菌效果的改變。滿足了痤瘡皮膚護理所需要抑菌、抗炎、修復(fù)的三種功效，提高羅布麻提取物的使用價值。

附圖說明

圖1為加入不同酵母量發(fā)酵所得羅布麻發(fā)酵提取物的細(xì)胞存活率圖。

  

圖2為不同樣品對炎癥因子TNFα的影響圖。

  

圖3為凍干粉樣品對細(xì)胞的遷移率圖。

  

 

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

本實施例為羅布麻發(fā)酵提取物的制備工藝：

(1)在加熱桶中將純化水煮沸后加入純化水質(zhì)量6.5％的羅布麻碎粉，95℃保溫20min，冷卻至室溫，得到未濾渣的羅布麻水提液。

(2)將步驟(1)所得未濾渣的羅布麻水提液與滅活乳酸菌菌液和葡萄糖投入發(fā)酵罐得到發(fā)酵培養(yǎng)基，每公斤發(fā)酵培養(yǎng)基中加入假絲酵母5×109個，在40℃下發(fā)酵培養(yǎng)5h得到發(fā)酵液；所述滅活乳酸菌菌液的加入量為未濾渣的羅布麻水提液質(zhì)量的8％，所述葡萄糖的加入量為未濾渣的羅布麻水提液質(zhì)量的0.75％；

(3)將步驟(2)所得發(fā)酵液用200目過濾器過濾，濾液用管式離心機10000rpm離心，離心上清液用0.22um濾膜過濾后在無菌容器收集，得到羅布麻假絲酵母發(fā)酵提取物。

對比例1

將實施例1步驟(2)中假絲酵母換成釀酒酵母，40℃調(diào)整為37℃，以每公斤發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5×109個酵母為1份，分別以1份、4份、8份、16份數(shù)量的酵母發(fā)酵，得到用不同數(shù)量釀酒酵母發(fā)酵的羅布麻發(fā)酵提取物。

對比例2

實施例1步驟(2)中假絲酵母的加入量計為1份，將假絲酵母的數(shù)量分別改為4份、8份、16份數(shù)量，其它條件不變，得到用不同數(shù)量假絲酵母發(fā)酵的羅布麻發(fā)酵提取物。

對比例3

將實施例1中的假絲酵母換成釀酒酵母，40℃調(diào)整為37℃，其它條件不變；最終得到羅布麻釀酒酵母發(fā)酵提取物。

實施例2

本實施例為實施例1所得羅布麻假絲酵母發(fā)酵提取物的體外抑菌效果評價

利用比濁法測定羅布麻假絲酵母發(fā)酵提取物對三種受試菌的最小抑菌濃度(MIC)，同時與實施例1中步驟(1)所得羅布麻水提液、對比例3所得羅布麻釀酒酵母發(fā)酵提取物對比，評價發(fā)酵前后的抑菌活性。

1.受試菌液的準(zhǔn)備：

從平板上挑取金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌單菌落于MH肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，備用。

從平板上挑取痤瘡丙酸桿菌于液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，備用。

2.供試品溶液的配制：

將羅布麻假絲酵母發(fā)酵提取物、羅布麻水提液、羅布麻釀酒酵母發(fā)酵提取物0.22um過濾器除菌，備用。

在超凈工作臺中無菌操作，將除菌后樣品用相應(yīng)的培養(yǎng)基梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為原液的2、4、8、16、32、64、128倍，每管1mL，得到供試品溶液。

3.檢測：

將受試菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌菌液調(diào)至在625nm波長檢測吸收為0.090～0.10，然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基按1：100稀釋，用培養(yǎng)基將上述供試品溶液分別加入等體積的含菌培養(yǎng)基1mL，使得最終稀釋倍數(shù)為4、8、16、32、64、128、256倍系列樣品濃度，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，痤瘡丙酸桿菌在厭氧罐中抽去氧氣后通入無氧混合氣體，37℃培養(yǎng)箱中72h。

4.結(jié)果判定：

將測試管與空白培養(yǎng)基的對照管相比，肉眼可見渾濁判斷為長菌，無明顯渾濁的最大稀釋倍數(shù)判定檢測樣品MIC。

結(jié)果如表1所示，羅布麻假絲酵母發(fā)酵提取物仍保留大部分對兩種致病菌抑制，同時對表皮葡萄球菌抑制減弱，由原來稀釋128倍變成16倍。

表1 兩種羅布麻發(fā)酵提取物和羅布麻水提液的抑菌活性

  

實施例3

本實施例為評估實施例1與對比例1、對比例2在細(xì)胞毒性上的差異。

具體操作為：

Raw264.7細(xì)胞株用完全培養(yǎng)基于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液殘留至2mL，將細(xì)胞輕輕吹打至脫落，1000rpm、離心5min，加入新鮮含1％FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸并進行細(xì)胞計數(shù)，制備3×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h。

設(shè)置對照組、以實施例1、對比例1、對比例2所得羅布麻發(fā)酵提取物為樣品組，使用0.22um濾膜過濾后用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋，每組設(shè)置6個復(fù)孔，將樣品配制為終濃度的2倍體系，棄去50μL培養(yǎng)液，對照組加入50μL基礎(chǔ)培養(yǎng)液，樣品組加入50μL不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h；每孔加入CCK8溶液10μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，孵育1h，于酶標(biāo)儀450nm處檢測吸光度值，A0為對照組吸光度值，An為樣品組吸光度值。以細(xì)胞存活率評估終濃度為0.1％的不同羅布麻樣品細(xì)胞毒性，用以下公式計算。

 

加入不同酵母量發(fā)酵所得羅布麻提取物的細(xì)胞存活率結(jié)果圖1所示，假絲酵母可以用更少的接種數(shù)量降低細(xì)胞毒性。

實施例4

本實施例為實施例1所得羅布麻發(fā)酵提取物作為原料在化妝品凍干粉劑型的應(yīng)用。

該凍干粉含有質(zhì)量百分比3％～15％的羅布麻發(fā)酵提取物，其它組分為常用輔料。具體為：A相：去離子水77份、甘露醇6份、磷酸氫二鈉0.1份、磷酸二氫鈉0.3份。B相：羅布麻發(fā)酵提取物10份。

該凍干粉的制備按照以下具體步驟：

1.將A相的組分溶解后121℃高溫滅菌20min，放置冷卻得到A相，備用。

2.將B相的組分加入A相中，裝入西林瓶。

3.冷凍干燥成型，得到凍干粉。

所得凍干粉加入一定溶媒，溶解后即可涂抹使用。溶媒中無需加入防腐劑，羅布麻發(fā)酵提取物有一定的抑菌效果，凍干粉劑型通常一周內(nèi)使用完。羅布麻發(fā)酵提取物在凍干粉中使用更能體現(xiàn)對皮膚微生態(tài)的友好。

實施例5

本實施例為實施例4在人體中的使用，評價羅布麻發(fā)酵提取物在人體皮膚中的實際效果。

利用實施例4所得凍干粉，加入一定量無菌水溶解，使得其中的組分羅布麻發(fā)酵提取物稀釋至原濃度的10％。招募30個臉上有痘痘的志愿者，隨機分成兩組，臉部清潔后使用產(chǎn)品；使用6小時后，一次性滅菌棉簽用300μl滅菌PBS蘸濕，在痘痘周邊2×2cm皮膚上擦拭15～30s，放進含2mL的R2A液體培養(yǎng)基中，35℃震蕩培養(yǎng)活化20min，取100μl菌液接入涂于R2A固態(tài)培養(yǎng)基中用于計算總菌落數(shù)，100μl菌液稀釋至1mL于金黃色葡萄球菌指示片中，用于計算金黃色葡萄球菌數(shù)量；37℃培養(yǎng)2448h后取出計數(shù)。以金黃色葡萄球菌與總菌落數(shù)比例評價對皮膚菌群的影響。

結(jié)果如表2所示，使用羅布麻發(fā)酵提取物的試驗組金黃色葡萄球菌占比主要在10～30％區(qū)間比較多，而空白組在30％以上較多，使用羅布麻發(fā)酵提取物凍干粉可以改善痤瘡皮膚中金黃色葡萄球菌比例，有助于減少其引發(fā)的炎癥。

表2 羅布麻發(fā)酵提取物對金黃色葡萄球菌與總菌落數(shù)比例的影響

  

實施例6

本實施例為實施例1所制備假絲酵母細(xì)胞實驗測試，痤瘡生成的同時伴隨著局部的炎癥，舒緩功效以降低TNFα含量來表征。具體操作為：

1.細(xì)胞接種

1)Raw264.7細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液殘留至2mL，將細(xì)胞輕輕吹打至脫落。

2)將脫落的細(xì)胞收集至離心管中后500rpm、離心5分鐘。

3)離心結(jié)束后，棄掉上清液，向離心管中加入新鮮含1％FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)液4mL，吸管吹打重懸細(xì)胞，血球計數(shù)板在顯微鏡下進行計數(shù)。

4)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至接種密度3×105/mL，接種至96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。

5)接種結(jié)束后，放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24±2h。

2.實驗分組

實驗中設(shè)置空白對照組、模型組、陽性對照組(LPS+甘草酸二鉀)及樣品組。樣品組使用實施例1所得假絲酵母和實施例1中步驟(1)所得羅布麻水提液。根據(jù)細(xì)胞毒性檢測的結(jié)果，選擇細(xì)胞相對活力大于8090％的濃度用無血清培養(yǎng)基進行稀釋，每個濃度梯度下設(shè)置3個復(fù)孔。

3.配制樣品工作液

用無血清培養(yǎng)基按下表(表3)配制不同濃度的樣品工作液。

4.給藥：待96孔板中細(xì)胞融合率達(dá)到60％左右時進行給藥。空白對照組和模型組每孔加入100μL的無血清培養(yǎng)基；樣品組每孔加入100μL含有相應(yīng)濃度的樣品工作液；陽性對照組加入100μL含有終濃度為100μg/mL的甘草酸二鉀。給藥完成后，將96孔板放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

5.LPS刺激：孵育4h后，根據(jù)實驗設(shè)計，分別向已給藥的孔板中加入120μL終濃度為1μg/mL的LPS的無血清培養(yǎng)基，空白對照組中加入無血清培養(yǎng)基120μL，混勻后將96孔板放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h。

6.收樣：孵育培養(yǎng)結(jié)束后，收集110μL細(xì)胞上清液于1.5mL無菌離心管中，4℃條件下1000rpm離心15分鐘取上清，立即用于后續(xù)ELISA實驗。

7.ELISA檢測：根據(jù)TNFɑELISA檢測試劑盒的操作說明書進行檢測。

表3 樣品工作液的配制

  

不同樣品對炎癥因子TNFα的影響如圖2所示，羅布麻假絲酵母發(fā)酵提取物與水提浸出液均可降低TNFα的含量，發(fā)酵提取物的效果更明顯。

實施例7

皮損修復(fù)涉及細(xì)胞的增殖遷移，利用細(xì)胞遷移實驗評價發(fā)酵提取物對皮膚的修復(fù)效果，用各樣品的最優(yōu)結(jié)果作比較。

由實施例4所得羅布麻凍干粉作試驗組；

使用實施例1中制備步驟(1)所得羅布麻水提液，用實施例4的方法制得凍干粉作對照組1；

使用實施例1中不加入假絲酵母酵母發(fā)酵，其它條件相同，最終所得的羅布麻提取物，用實施例4的方法制得凍干粉作對照組2；

使用實施例1中不加入滅活乳酸菌菌液，其余條件相同，最終所得羅布麻提取物，用實施例4的方法制得凍干粉作對照組3。

以人表皮生長因子EGF的適宜濃度作陽性對照組。

1.樣品溶液配制

無血清培養(yǎng)基稀釋凍干粉樣品，根據(jù)每個樣品細(xì)胞毒性檢測的結(jié)果選擇合適濃度；根據(jù)EGF標(biāo)準(zhǔn)品說明書用無血清培養(yǎng)基稀釋至合適的活性濃度。以上樣品均做4倍系列稀釋，共4個稀釋度，做2個復(fù)孔，操作均在無菌條件下進行。

2.操作過程

2.1先用Maker筆在12孔板背后，用直尺比劃參考線，橫穿過孔中心，每孔至少穿過2條線。

2.2胰酶消化處于對數(shù)期的Hacat細(xì)胞，10％FBS的培養(yǎng)基重懸，以10萬/mL，1mL/孔接種細(xì)胞至12孔板中。

2.3第二天觀察長至90％后，用無血清培養(yǎng)基配制樣品所需的稀釋濃度，每個濃度需2mL。

2.4吸棄12孔板中的上清，殘留100200μL培養(yǎng)基，用200μL槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的參考線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗滌細(xì)胞12次，去除脫落下的細(xì)胞，鏡下觀察沒有漂浮的細(xì)胞即為洗滌干凈。

2.5加入配置好的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，900ul/孔，做好標(biāo)記。

2.6放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；按0，6，24小時選取位置拍照(每組拍攝的不同時間點要求是同一位置)，可根據(jù)實際情況調(diào)整拍攝時間。

2.7用ImageJ軟件處理圖片，結(jié)果以遷移率表示。

3.計算

 

凍干粉樣品對細(xì)胞的遷移率如圖3所示，本發(fā)明羅布麻假絲酵母發(fā)酵提取物有明顯促進細(xì)胞遷移效果，可實現(xiàn)修復(fù)皮膚的功效。對比對照組1，水提羅布麻無明顯活性。結(jié)合對照組2分析，乳酸菌菌體未經(jīng)過假絲酵母發(fā)酵并不產(chǎn)生明顯活性。再結(jié)合對照組3分析，水提羅布麻即使不加入乳酸菌，經(jīng)發(fā)酵后也會產(chǎn)生明顯活性，并且在加入乳酸菌菌體一起發(fā)酵后效果更優(yōu)，最終實現(xiàn)與EGF生長因子有相似的效果。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

 

摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：李洪金，張齊，申請?zhí)?/font>：202310495960.9，申請日：2023.05.05