摘 要：MYB類轉(zhuǎn)錄因子KAN4(KANADI4)在紅麻類黃酮合成和纖維發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。本研究以紅麻品種‘福紅952’為材料，對 HcKAN4 基因進行克隆和表達模式分析，探討 TRV-VIGS 誘導(dǎo)該基因沉默對類黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達量改變的影響。基因克隆顯示，HcKAN4 基因開放閱讀框(open reading frame, ORF)全長為966bp，編碼 322 個氨基酸，包含一個 MYB 保守結(jié)構(gòu)域。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，其與擬南芥和木槿KAN4s的親緣關(guān)系較近。表達分析表明，該基因在植物不同組織中均有表達，且轉(zhuǎn)錄水平隨著植物的生長遞增。VIGS誘導(dǎo)基因沉默顯示，6株HcKAN4 的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，達到基因沉默效果。進一步實時熒光定量 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，類黃酮合成相關(guān)基因HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，分別是對照組的 0.51、0.14、0.23、0.11 倍，表明 HcKAN4 基因可調(diào)控紅麻類黃酮生物合成相關(guān)基因。這些結(jié)果為闡明紅麻MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類黃酮合成提供了依據(jù)，同時為改善纖維品質(zhì)提供了研究思路。
關(guān)鍵詞：紅麻;HcKAN4;類黃酮合成;VIGS
紅麻(Hibiscus cannabinus L.)為錦葵科木槿屬的一年生常異花授粉纖維作物，屬于短日照喜溫類型，主 要種植在亞洲的中國、印度、孟加拉、馬來西亞以及非洲的馬里、貝寧、贊比亞等國家[1]。紅麻屬于韌皮部纖維作物，具有質(zhì)地柔軟、吸濕性強、透氣性好、抑菌、易降解等優(yōu)良特性。在建材、可降解塑料、吸污、飼料、汽車內(nèi)襯和藥用等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[2-4]。
類黃酮化合物是植物中具有高度活性的次生代謝產(chǎn)物，在植物抗氧化、抗病蟲害等方面具有良好效果，原花青素(proanthocyanidins, PAs)是在植物中廣泛存在的一種類黃酮化合物，能夠決定植物器官顏色，并在應(yīng)對生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[5]。同時，花青素可以有效清除自由基，在抗氧化、抗衰老方面效果顯著[6]。因此深入了解類黃酮在紅麻中的合成及調(diào)控過程，對于培育彩色纖維、增強抗逆性、提高纖維品質(zhì)具有重要作用。
類黃酮生物合成途徑已被廣泛研究，參與其生物合成的結(jié)構(gòu)基因己相繼被克隆和鑒定。類黃酮生物合成通路錯綜復(fù)雜，其中先后涉及到十幾個關(guān)鍵酶(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR\LDOX、ANS、LAR、ANR、LAC等)的催化反應(yīng)[7]。此外，類黃酮代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也被廣泛研究，涉及到多種轉(zhuǎn)錄因子(WIP-ZF、MYB、bHLH、WD40、WRKY、MADS)[7-8]，其中以MYB、bHLH和WD40最為常見，這3類轉(zhuǎn)錄因子可以以MYB-bHLH-WD40(MBW)復(fù)合體的形式來調(diào)控植物PAs的生物合成[9]，也可以單獨發(fā)揮作用，例如Ding等[10]發(fā)現(xiàn)蘋果的轉(zhuǎn)錄因子MdMYB28可以負調(diào)控花青素的合成。MYB轉(zhuǎn)錄因子決定MBW復(fù)合體的特異性和被激活的基因，是復(fù)合體的核心成員，可通過過表達MYB就會明顯促進PAs的生物合成[11]。
在許多植物中，MYB轉(zhuǎn)錄因子均已被報道參與類黃酮代謝的調(diào)控。例如，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子TT2/AtMYB123通過調(diào)節(jié)ANR、DFR和AHA10的表達來特異調(diào)控種皮原花青素的積累[12]。在水稻(Oryza sativa L.)中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子OsPL通過調(diào)控花青素代謝使種子耐熱性增加[13]。在苜蓿(Medicago truncatula)中，MtMYB5和MtMYB14通過與MtTT8和MtWD40-1相互作用形成復(fù)合體，從而激活A(yù)NR和LAR的表達來協(xié)同調(diào)控種子外殼原花青素的積累[14]。MYB轉(zhuǎn)錄因子不同成員除了正調(diào)控類黃酮的合成外，也存在對其負調(diào)控。例如，在苦蕎(Fagopyrum tataricum)中，MYB轉(zhuǎn)錄因子基因FtMYB11通過與FtSAD2或FtJAZ1的相互作用抑制苯丙烷的生物合成[15]從而抑制類黃酮的合成。擬南芥中AtKAN4基因過表達產(chǎn)生了一個顯性突變系sk21-D，突變體中的CHS、CHI、F3’H、DFR、LDOX、ANR等類黃酮合成相關(guān)基因的表達量均下降，表明AtKAN4基因可廣泛調(diào)控擬南芥PAs生物合成相關(guān)基因[16]。
病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)是一種植物用來抵御入侵病毒的自然防御機制，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)[17]。利用VIGS技術(shù)能夠快速鑒定目標基因沉默后的表型和基因轉(zhuǎn)錄水平變化，不需要通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。因此它在功能基因組學(xué)研究中有顯著的優(yōu)勢，能快速地鑒定目的基因功能。VIGS的沉默效率受多種因素的影響，病毒載體的選擇對沉默效率有著較大影響，目前植物中應(yīng)用范圍較廣的是煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)，與其他病毒載體相比，TRV具有沉默效率高和時間長等優(yōu)點，TRV-VIGS體系目前已在棉花[18]、亞麻[19]等多種寄主植物中應(yīng)用[20]。
與黃麻等韌皮部纖維作物相比，紅麻纖維纖維素含量較低而木質(zhì)素含量較高。據(jù)報道[21]，有317個淀粉和糖代謝途徑基因可能參與纖維素生物合成，包括CesA、Csls基因家族;根據(jù)相關(guān)研究[22]發(fā)現(xiàn)，PAL、HCT、C4H、COMT、CAD、4CL和F3’H在木質(zhì)素生物合成起關(guān)鍵作用。同時類黃酮代謝途徑不僅可以獨自影響纖維的發(fā)育，其還可能和木質(zhì)素代謝途徑或者與苯丙烷代謝途徑的其他分支代謝途徑共同地來調(diào)控纖維的發(fā)育[23]。植物MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類黃酮代謝和纖維發(fā)育的機制復(fù)雜多樣[24]，而在紅麻中鮮有報道。本研究以紅麻優(yōu)良品種‘福紅 952’為材料，基于其全基因組測序數(shù)據(jù)[25]，克隆獲得一個與擬南芥AtKAN4的同源基因HcKAN4，通過Gateway技術(shù)構(gòu)建HcKAN4的VIGS載體，獲得基因沉默植株后結(jié)合實時熒光定量PCR分析其對紅麻類黃酮合成途徑相關(guān)基因的表達影響。這將豐富MYB轉(zhuǎn)錄因子KAN4在紅麻類黃酮合成途徑中的研究，為紅麻類黃酮合成及調(diào)控的分子機制研究和提高纖維品質(zhì)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
本研究以紅麻‘福紅 952’為試驗材料，由福建農(nóng)林大學(xué)麻類遺傳育種與綜合利用實驗室保存提供。大腸桿菌菌株DB3.1、TOP10、農(nóng)桿菌菌株GV3101、Gateway入門載體pDONR207、載體pTRV1、和pTRV2等均由福建農(nóng)林大學(xué)麻類遺傳育種與綜合利用實驗室保存。RNA 提取試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化技術(shù)有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 RNA提取和cDNA合成
使用RNA提取試劑盒提取‘福紅 952’紅麻葉片的總RNA。用超微量分光光度計Nano Drop ND-1000(Nano Drop, Wilmington, DE, USA)檢測RNA樣品濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為(5× Fastking-RT SuperMix: 4 μL、Total RNA 50 ng: 2 μg、RNase-Free ddH2O補足到20μL)，反應(yīng)程序為42°C反應(yīng)15min、95°C反應(yīng)3min，以cDNA為模板進行紅麻HcKAN4基因的克隆及實時熒光定量PCR分析。
1.2.2 紅麻HcKAN4基因克隆
實驗室前期基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)HcKAN4基因?qū)︻慄S酮合成有著調(diào)控作用。從已報道文獻[16]和TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)獲得擬南芥AtKAN4(AT5G42630)蛋白序列。利用AtKAN4氨基酸序列進行BLASTP比對分析，獲得相似性較高的同源基因，命名為HcKAN4(紅麻數(shù)據(jù)庫編號:Hc.03G039160)。以紅麻cDNA為模板設(shè)計特異引物克隆HcKAN4基因(附表1)。PCR程序為:95°C預(yù)變性2min;95°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸30s，34個循環(huán);72°C延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA純化試劑盒(Vazyme,南京)回收目的條帶，送尚亞生物技術(shù)公司(福州)測序，并通過DNAMAN軟件進行序列比對。
1.2.3 紅麻HcKAN4蛋白系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及序列比對分析
在中國國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(National Genomics Data Center)基因組數(shù)據(jù)庫Genome Warehouse(https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh)中進行BLASTP比對，得到‘福紅 952’紅麻KAN4基因的蛋白質(zhì)序列，用MEGA11.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹。使用NCBI-Blast在線分析獲得不同物種KAN4基因的同源蛋白序列，通過多序列比對軟件DNAMAN對紅麻HcKAN4蛋白序列進行比對分析。
1.2.4 紅麻HcKAN4基因表達分析
根據(jù)實驗室前期建立了紅麻‘福紅 952’的根、莖、葉和花等不同發(fā)育時期不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，用R語言中的pheatmap函數(shù)對‘福紅 952’紅麻HcKAN4基因的電子表達量繪制熱圖。
1.2.5 TRV-VIGS載體構(gòu)建
以克隆獲得的HcKAN4基因為模板，通過primer5.0軟件設(shè)計位于HcKAN4基因CDS上約250bp特異性片段的引物HcKAN4-SF和HcKAN4-SR(附表1)。PCR反應(yīng)結(jié)束電泳檢測并回收目標條帶，測序后檢查序列是否正確。
pTRV2-HcKAN4載體構(gòu)建:將擴增得到的HcKAN4基因特異性片段、載體pDONR207和BP酶按BP反應(yīng)體系(HcKAN4-250bp(20ngμL-1):0.5μL, pDONR207 vector (40 ng μL-1): 0.5 μL, BP Clonase reaction buffer: 0.25 μL)混勻后，25°C過夜連接，轉(zhuǎn)化到DB3.1感受態(tài)細胞中，然后涂布在含有50μg mL-1慶大霉素的LB平板上。過夜培養(yǎng)后挑取單克隆，進行菌液PCR檢測。將陽性菌液提取質(zhì)粒，命名為pDONR207-HcKAN4。將質(zhì)粒pDONR207-HcKAN4、載體pTRV2和LR酶按LR反應(yīng)體系(pDONR207-HcKAN4 (80～100ng μL-1):0.5μL,pTRV2(80～100ngμL-1):0.5μL,LR Clonase reaction buffer:0.25 μL)混勻后，過夜連接。轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)，挑取單克隆，菌液PCR檢測，菌液送尚亞生物技術(shù)公司進行測序，序列比對正確，提取質(zhì)粒，將其命名為pTRV2-HcKAN4。
1.2.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染液制備
將pTRV1、pTRV2、pTRV2-HcKAN4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，挑取單克隆，接種到含50μg mL-1的卡那霉素、50μgmL-1 的慶大霉素和50μgmL-1的利福平的液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)12h，菌液PCR檢測后驗證陽性克隆。將驗證為陽性的菌液，按1∶100的比例接種到含有卡那霉素、慶大霉素、利福平的150mLLB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)，以適當(dāng)體積的重懸液(10mmolL-1MgCl2，10mmolL-1 MES以及200μmolL-1乙酰丁香酮)重懸液濃度OD600=0.8。將攜帶有pTRV1載體重懸液與分別攜帶pTRV2、pTRV2-HcKAN4 的重懸液按體積比1∶1混勻，用于侵染種植7d的紅麻真葉。將侵染后的植株置于溫度25°C、光/暗周期(14h/10h)的條件下生長，并用防蟲網(wǎng)遮蓋，根據(jù)生長情況澆營養(yǎng)液。
1.2.7 紅麻類黃酮合成相關(guān)基因鑒定
利用擬南芥類黃酮生物合成相關(guān)基因與實驗室組裝的紅麻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行BLASTP比對，鑒定得到紅麻類黃酮生物合成基因，分別為HcPAL、HcCHS、HcF3’H、HcFLS、HcF3’5’H。通過 NCBI-CDD分析紅麻類黃酮合成候選基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，再根據(jù)實驗室前期建立的紅麻‘福紅 952’在不同發(fā)育時期不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(種子萌發(fā)后10d下胚軸、種子萌發(fā)后60d莖皮、種子萌發(fā)后120d莖皮)，分析類黃酮合成相關(guān)基因在紅麻莖皮中的表達模式。
1.2.8 紅麻細胞壁合成相關(guān)基因的篩選
根據(jù)已發(fā)表文獻[25]得到紅麻木質(zhì)素合成途徑相關(guān)基因HcPAL、HcC4H、Hc4CL、HcCOMT、HcHCT、HcCCR、HcCAD、HcC3H、HcF5H，纖維素合成途徑相關(guān)基因HcCSLD、HcCESA9、HcCESA5、HcCEL6，再根據(jù)實驗室前期建立的紅麻‘福紅 952’在不同發(fā)育時期不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析紅麻發(fā)育過程中細胞壁合成相關(guān)基因的表達模式。
1.2.9 實時熒光定量PCR分析
以紅麻Hc18sRNA為內(nèi)參基因，使用熒光定量PCR儀試劑盒(GO Taq qPCR Master Mix (Promega，美國))，在實時熒光定量PCR儀CFX96 (BIO-RAD，美國)中進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR反應(yīng)體系為cDNA2.0μL、左引物和右引物各0.7μL、SYBR Green I 10.0 μL、ddH2O 6.6 μL，擴增程序為95°C預(yù)變性5s;95°C變性5s，退火溫度為55°C，延伸30s，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，采用2-DDCt 計算基因的相對表達量[26]。采用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，用SPSS Statistics 25軟件分析顯著性。
2 結(jié)果與分析
2.1 紅麻HcKAN4基因克隆與生物學(xué)信息分析
以紅麻‘福紅 952’葉片cDNA為模板，以HcKAN4-F/R為引物克隆獲得HcKAN4基因(圖1-a)，擴增結(jié)果和預(yù)期片段大小一致?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明(圖1-b)，HcKAN4基因包含6個外顯子、521bp的5′非翻譯區(qū)(non translated region，UTR)和226bp的3’UTR，編碼322個氨基酸。預(yù)測蛋白分子量為35.38kD，等電點(pI)為6.90，分子式為C1523H2425N449O490S。該蛋白氨基酸含量較多的有Ser(41個，12.7%)、Leu(39個，12.1%)、Gly(24個，7.5%)、Thr(20個，6.2%)、Asp(21個，6.5%)，氨基酸不包含Pyl和Sec。通過DNAMAN進行蛋白質(zhì)序列比對分析表明，紅麻、棉花、木槿、榴蓮和葡萄的KAN4蛋白序列比對都包含一段高度保守的氨基酸序列，屬于MYB保守結(jié)構(gòu)域，屬于MYB家族(圖1-c)，其氨基酸序列與棉花、木槿、榴蓮和葡萄比較發(fā)現(xiàn)都具有較高的同源性，其中與木槿同源性最高，達到87.42%，說明該基因在錦葵科植物中具有較高的保守性。使用MHMM軟件對Hc.KAN4蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)進行分析可知，Hc.KAN4整條肽鏈都存在細胞膜外側(cè)，說明不存在跨膜螺旋(附圖1)。通過MEGA7.0軟件構(gòu)建Hc.KAN4蛋白與其他植物KAN4蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，探究它們之間的同源關(guān)系(附圖2)可知，Hc.KAN4與擬南芥和木槿的同源關(guān)系較近，與油菜、辣椒的同源關(guān)系較遠。
圖1 紅麻HcKAN4基因克隆及序列分析
Fig. 1 Cloning and sequence analysis of HcKAN4 gene in kenaf
a：HcKAN4基因克隆電泳圖。其中，M表示DL2000 DNA Marker，1和2表示克隆產(chǎn)物。b：HcKAN4基因結(jié)構(gòu)示意圖。c：HcKAN4蛋白與其他物種同源蛋白序列比對圖。其中紅框表示MYB保守結(jié)構(gòu)域，HcKAN4表示紅麻KAN4蛋白，HsKAN4表示木槿KAN4蛋白，GhKAN4表示棉花KAN4蛋白，DzKAN4表示榴蓮KAN4蛋白，VvKAN4表示葡萄KAN4蛋白。
a: the electrophoretic map of HcKAN4 gene cloning. M: DL2000 DNA marker; 1 and 2 represent cloning products. b: the schematic diagram of HcKAN4 gene structure. c: the sequence alignment diagram of HcKAN4 protein with homologous proteins of other species. The red box represents MYB conserved domain, HcKAN4 represents kenaf KAN4 protein, HsKAN4 represents hibiscus KAN4 protein, GhKAN4 represents cotton KAN4 protein, DzKAN4 represents durian KAN4 protein, and VvKAN4 represents grape KAN4 protein.
2.2 HcKAN4基因在不同時期不同組織中的表達分析
由圖2-a可知，Hc.KAN4基因在旺盛生長期(種子萌發(fā)后60d根、莖皮、莖骨和葉)及工藝成熟期(種子萌發(fā)后120d莖皮)的表達特征。Hc.KAN4在莖和葉中均有不同程度的表達，在旺盛生長期根和莖骨中表達低，而工藝成熟期(種子萌發(fā)后120 d)莖皮表達量最高，說明Hc.KAN4基因具有組織特異性。在種子萌發(fā)后120 d時莖皮中的表達量約為60d的12倍，說明Hc.KAN4基因隨著植物生長在莖皮中發(fā)揮著重要作用。分析Hc.KAN4基因在不同發(fā)育時期的圓葉、三裂葉、五裂葉和七裂葉葉片的表達特征(圖2-b)發(fā)現(xiàn)，Hc.KAN4基因在R7時具有最高表達量，是R、R3、R5時期的8.56倍、1.21倍、4.86倍，表明隨著葉片發(fā)育基因表達量總體呈升高的趨勢，推測Hc.KAN4基因可能參與紅麻葉片的發(fā)育。
圖2 紅麻HcKAN4基因在不同時期不同組織中的表達分析 下載原圖
Fig. 2 Relative expression level of HcKAN4 genes of different tissues at different stages in kenaf
root-60 d、stem-stick-60 d、leaf-60 d、stem-bark-60 d、stem-bark-120 d分別代表種子萌發(fā)60 d后根、莖骨、葉、莖皮、和種子萌發(fā)120 d后莖皮；R、B3、B5、B7分別代表種子萌發(fā)120 d后圓葉、三裂葉、五裂葉和七裂葉。
root-60 d, stem-stick-60 d, leaf-60 d, stem-bark-60 d, and stem-bark-120 d represent root, stem stick, leaf, stem bark after 60 days of seed germination, and stem bark after 120 days of seed germination, respectively. R, B3, B5, and B7 represent round leaf, tri-lobed leaf, five-lobed leaf, and seven-lobed leaf after 120 days of seed germination, respectively.
2.3 紅麻HcKAN4沉默載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
為了沉默目的基因HcKAN4，以TRV作為病毒載體，構(gòu)建TRV-HcKAN4并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。以紅麻葉片cDNA為模板進行PCR，得到一條與預(yù)期大小一致的擴增片段?；厥漳康钠魏笸ㄟ^Gateway技術(shù)構(gòu)建pTRV2-KAN4載體，經(jīng)凍融法獲得轉(zhuǎn)入pTRV1、pTRV2 (空載)、pTRV2-KAN4載體的農(nóng)桿菌GV3101，用特異引物進行菌液PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示，出現(xiàn)符合預(yù)期的條帶，表明3個TRV-VIGS表達載體成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101中。
圖3 紅麻Hc.KAN4基因重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后菌液PCR結(jié)果
Fig. 3 PCR results of Hc.KAN4 recombinant plasmid transformation in kenaf
M：DL2000 DNA marker。a：P代表質(zhì)粒，1~4代表pTRV2-KAN4待測農(nóng)桿菌；b：1~5代表pTRV1待測農(nóng)桿菌；c：1~5代表pTRV2(空載)待測農(nóng)桿菌。M: DL2000 DNA marker. a: P represents plasmid, 1–4 represents Agrobacterium pTRV2-KAN4 to be tested; b: 1–5 represents Agrobacterium pTRV1 to be tested; c: 1–5 represents Agrobacterium pTRV2 (mock) to be tested.
圖4 紅麻HcKAN4的cDNA和氨基酸序列
Fig.4 cDNA and amino acid sequences of HcKAN4 in kenaf
紅色線標出沉默片段。
The silent fragment is underlined by the red line.
2.4 TRV-VIGS誘導(dǎo)HcKAN4基因沉默的效率檢測
當(dāng)沉默HcPDS基因的植株開始出現(xiàn)白化表型，隨機選取6株沉默HcKAN4基因的紅麻植株，以及長勢與沉默植株一致的3株空載處理的紅麻植株作為對照。本研究通過qRT-PCR檢測TRV-VIGS對紅麻葉中HcKAN4基因表達水平的影響(圖5-a)發(fā)現(xiàn)，VIGS沉默后，與對照相比，6株沉默植株的相對表達量都達到顯著性降低，沉默效率達到100%。為證實TRV-VIGS沉默效果是整株植物沉默，隨機選取2株沉默HcKAN4植株，取其莖皮和2株空載處理植株作為對照(圖5-b)。與對照相比，沉默植株莖皮的相對表達量也出現(xiàn)了降低，沉默效率100%，說明TRV-VIGS是整株沉默且沉默效率良好。
圖5 HcKAN4基因沉默后紅麻植株的沉默效果檢測
Fig. 5 Silencing effect detection of individuals after HcKAN4 gene silencing in kenaf
a：VIGS沉默后葉片HcKAN4基因的qRT-PCR分析；b：VIGS沉默后莖皮HcKAN4基因的qRT-PCR分析。柱上不同小寫字母表示同一基因在不同植株表達量差異達到顯著水平。
a: the relative expression level of HcKAN4 genes in leaves after VIGS silencing; b: the relative expression level of HcKAN4 genes in stem bark after VIGS silencing. Different lowercase letters above the bars indicate significant difference at the 0.05 probability level in the relative expression level of the same gene at different individuals.
2.5 HcKAN4基因沉默對類黃酮合成基因表達的影響
2.5.1 類黃酮合成相關(guān)基因在不同發(fā)育時期莖皮中的表達分析
利用擬南芥類黃酮合成相關(guān)基因蛋白質(zhì)序列，通過與紅麻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)blastp鑒定得到紅麻類黃酮合成相關(guān)基因，通過NCBI-CDD對這些基因的結(jié)構(gòu)域進一步分析(表1)。由表1可知，Hc.CHS蛋白具有PLN03172 super family結(jié)構(gòu)域，Hc.F3'H具有p450 super family結(jié)構(gòu)域，Hc.ANS具有PLN03178結(jié)構(gòu)域，Hc.ANR具有PLN00198 super family結(jié)構(gòu)域，Hc.F3’5’H具有p450 super family結(jié)構(gòu)域。
通過對鑒定得到的類黃酮合成基因在紅麻不同時期莖皮的電子表達量進行表達模式分析(圖6)發(fā)現(xiàn)，5個類黃酮合成基因的電子表達量都隨著生長時間增加在莖皮中的表達量呈顯著性增加的趨勢，說明類黃酮在植物莖皮的生長發(fā)育中起著重要作用。由圖7-a可知，紅麻木質(zhì)素合成相關(guān)基因Hc.PAL、Hc.C4H、Hc.COMT、Hc.HCT、Hc.CCR、Hc.CAD、Hc.C3H、Hc.F5H的電子表達量隨著植株生長時間的增加呈顯著性降低的趨勢，只有木質(zhì)素合成相關(guān)基因Hc.CCT的電子表達量先降低后增加的變化；由圖7-b可知，紅麻纖維素合成相關(guān)基因Hc.CSLD、Hc.CESA9、Hc.CESA6、Hc.CEL6的電子表達量隨著植物生長時間增加呈顯著性降低的趨勢。說明隨著植株生長時間增加，莖皮中類黃酮合成基因的電子表達量呈顯著性增加趨勢，而莖皮中的木質(zhì)素和纖維素合成相關(guān)基因呈顯著性降低趨勢，類黃酮表達量的增加導(dǎo)致了木質(zhì)素基因和纖維素合成酶基因表達量的減少，由此可說明類黃酮相關(guān)基因高表達可能不利于紅麻纖維品質(zhì)的提高。
圖6 紅麻類黃酮合成相關(guān)基因在不同時期莖皮的表達分析
Fig. 6 Relative expression level of genes related to flavonoid biosynthesis at different stages in kenaf
Hypocotyl-10 d：種子萌發(fā)后10 d的下胚軸；stem-bark-60 d：種子萌發(fā)后60 d的莖皮；stem-bark-120 d：種子萌發(fā)后120 d的莖皮。柱上不同小寫字母表示同一基因在不同時期表達量差異達到顯著水平。
Hypocotyl-10 d: hypocotyl of 10 days after germination; stem-bark60 d: stem barks of 60 days after germination; stem-bark-120 d: stem barks of 120 days after germination. Different lowercase letters above the bars indicate that there is significant difference at the 0.05 probability level in the relative expression level of the same gene at different stages.
圖7 紅麻纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因在不同時期莖皮的表達量
Fig. 7 Relative expression level of genes related to cellulose and lignin biosynthesis at different stages in kenaf
a：表示木質(zhì)素合成相關(guān)基因在不同時期莖皮的表達量；b：表示纖維素合成相關(guān)基因在不同時期莖皮的表達量；Hypocotyl-10 d：種子萌發(fā)后10 d的下胚軸；stem-bark-60 d：種子萌發(fā)后60 d的莖皮；stem-bark-120 d：種子萌發(fā)后120 d的莖皮。柱上不同小寫字母表示同一基因在不同時期表達量差異達到顯著水平。
a:the relative expression level of lignin synthesis-related genes in stem bark at different stages; b: the relative expression level of cellulose synthesis related genes in stem bark at different stages; Hypocotyl-10 d: hypocotyl of 10 days after germination; stem-bark60 d: stem barks of 60 days after germination; stem-bark-120 d: stem barks of 120 days after germination. Different lowercase letters above the bars indicate that there is significant difference at the 0.05 probability level in the relative expression level of the same gene at different stages.
2.5.2 HcKAN4基因沉默植株類黃酮合成相關(guān)基因的表達分析
對HcKAN4基因VIGS沉默處理的和對照組的紅麻莖皮中的類黃酮合成相關(guān)基因進行qRT-PCR檢測(圖8)發(fā)現(xiàn)，HcKAN4基因VIGS沉默植株中，類黃酮合成基因HcF3’H、HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR在莖皮的表達量下調(diào)達到極顯著水平，分別是對照組的0.51、0.14、0.23、0.11倍。表明HcKAN4基因能夠影響紅麻類黃酮合成基因的表達，從而影響類黃酮的生物合成。
圖8 紅麻HcKAN4基因VIGS沉默后類黃酮合成相關(guān)基因的qRT-PCR分析
Fig. 8 Relative expression level of flavonoid synthesis-related genes after VIGS silencing of HcKAN4 gene in kenaf
每組數(shù)據(jù)代表3次技術(shù)重復(fù)的平均值，誤差以SD表示，*表示在0.05概率水平差異顯著，**表示在0.01概率水平差異顯著。HcCHS：查爾酮合成酶基因；HcF3’H：類黃酮3’-羥化酶基因；HcF3’5’H：類黃酮3’5’-羥化酶基因；HcANS：花青素合成酶基因；HcANR：花青素還原酶基因。
Each group of data represents the mean of 3 technical replicates, and the error is expressed in SD, * and **mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. HcCHS: Chalcone synthetase gene; HcF3'H: flavonoid 3’-hydroxylase gene; HcF3'5H: flavonoid 3’5’-hydroxylase gene; HcANS: anthocyanin synthase gene; HcANR: anthocyanin reductase gene.
3 討論
3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子在類黃酮和纖維發(fā)育中的作用機制
MYB轉(zhuǎn)錄因子在類黃酮合成和纖維發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，本研究利用TRV-VIGS技術(shù)鑒定了紅麻HcKAN4基因在類黃酮合成中的作用。結(jié)果顯示，在HcKAN4基因沉默后，類黃酮合成基因表達量均顯著減少，說明HcKAN4是紅麻類黃酮代謝途徑中部分酶基因的關(guān)鍵調(diào)控因子。進一步分析發(fā)現(xiàn)，該基因在紅麻中主要在莖、葉中表達而在根中不表達。在油菜中，KAN4基因在根莖葉中都有表達，在根中的表達量顯著高于莖、葉[27]，表明該基因同源基因在不同植物存在不同表達模式，具有組織特異性。
多種轉(zhuǎn)錄因子對類黃酮生物合成通路中的基因有調(diào)控作用，MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類黃酮的途徑也有相關(guān)報道。Zhai等[28]發(fā)現(xiàn)PbMYB10b可以調(diào)控PAs的生物合成，但其功能可以被其他MYB轉(zhuǎn)錄因子補充。Li等[29]發(fā)現(xiàn)FhMYB5和bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因FhTT8L和FhGL3L共同作用時，類黃酮合成基因被激活。Zhu等[30]從菊花中發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的CmMYB8基因?qū)δ举|(zhì)素和類黃酮化合物的合成起到負調(diào)控作用。在棉花中發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB基因與纖維品質(zhì)有遺傳相關(guān)性[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默HcKAN4基因顯著下調(diào)紅麻類黃酮化合物合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，而正向調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因的表達。這些結(jié)果表明，紅麻HcKAN4沉默后可能抑制了黃酮類化合物的合成而促進纖維素含量積累。而提高纖維素含量是改良纖維品質(zhì)的關(guān)鍵途徑，因此，這為改善紅麻纖維品質(zhì)的分子育種提供了新的研究思路。
關(guān)于HcKAN4基因與類黃酮合成相關(guān)基因HcF3’H、HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR之間的調(diào)控關(guān)系，是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控還是蛋白結(jié)合等方式實現(xiàn)，目前還沒有相關(guān)文獻報道。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，紅麻類黃酮合成相關(guān)基因HcF3’5’H (Hc.10G006460)啟動子上游1959 bp處存在1個HcKAN4的結(jié)合元件(TTTTTACGGTTA)，其功能是MYB binding site involved in flavonoid biosynthetic genes regulation。多項研究顯示，該元件是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控下游靶基因的核心元件。因此，轉(zhuǎn)錄因子HcKAN4可能結(jié)合HcF3’5’H啟動子進而調(diào)控類黃酮的合成。具體調(diào)控機制有待進一步深入研究。
3.2 TRV-VIGS的影響因素
VIGS具有不通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化就降低目的基因表達水平的特征，從而可以研究目的基因表達水平降低后對作物表型的影響。VIGS的沉默效率受多種因素影響，如載體種類[32]、侵染方法[33]、侵染時間[34]等。VIGS在不同的植物中沉默效率也有較大差別，Jia等[35]發(fā)現(xiàn)草莓CHS基因的沉默效率達80%左右，而本研究中沉默Hc.KAN4基因沉默效率為100%?，F(xiàn)階段VIGS研究通常沉默一個基因，從而研究基因功能作用。李玉霞等[36]通過共沉默GbCHI、GbDFR和GbF3’H來研究在海島棉中的抗枯萎病發(fā)現(xiàn)，共沉默相對于單獨沉默GbF3’H的作用效果有顯著提升。通過共沉默來探討紅麻HcKAN4基因與類黃酮合成相關(guān)基因HcF3’H、HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR之間的調(diào)控關(guān)系，有待進一步研究。
4 結(jié)論
HcKAN4基因表達具有組織特異性，在莖、葉中的表達量顯著高于根中。TRV-KAN4的沉默效率良好，且沉默植株中類黃酮合成相關(guān)基因的表達量與對照相比顯著下降，通過對植株在相同組織不同時期的表達量發(fā)現(xiàn)，類黃酮合成相關(guān)基因的表達量呈上升趨勢，而纖維素和木質(zhì)素相關(guān)基因的表達量呈下降趨勢。推測該轉(zhuǎn)錄因子可以影響類黃酮的生物合成，進而影響紅麻的纖維發(fā)育。
附圖1 不同植物KAN4蛋白系統(tǒng)進化樹
Fig. S1 Phylogenetic tree of KAN4 proteins in different plants
CaKAN4：辣椒KAN4蛋白；ZmKAN4：玉米KAN4蛋白；BaKAN4：油菜KAN4蛋白；CsKAN4：黃瓜蛋白；VvKAN4：葡萄KAN4蛋白；HsKAN4：木槿KAN4蛋白；ATKAN4：擬南芥KAN4蛋白；HcKAN4：紅麻KAN4蛋白；GaKAN4：棉花KAN4蛋白；DzKAN4：榴蓮KAN4蛋白。
CaKAN4: pepper KAN4 protein; ZmKAN4, maize KAN4 protein; BaKAN4, rapeseed KAN4 protein; CsKAN4 cucumber protein; VvKAN4, grape KAN4 protein;HsKAN4:hibiscus KAN4 protein;ATKAN4,Arabidopsis KAN4 protein; HcKAN4: kenaf KAN4 protein; GaKAN4: cotton KAN4 protein; DzKAN4: durian KAN4 protein.
附圖2 Hc.KAN4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測
Fig. S2 Prediction of the transmembrane structure of Hc.KAN4 protein
附表1 本試驗所用引物
Table S1 All primers used in this study
參考文獻
[1] Afzal M Z, Ibrahim A K, Xu Y, Niyitanga S, Li Y, Li D, Yang X, Zhang L. Kenaf (Hibiscus Cannabinus L.) breeding. J Nat Fibers, 2022, 19: 4063–4081.
[2] Sreenivas H T, Krishnamurthy N, Arpitha G R. A comprehensive review on light weight kenaf fiber for automobiles. Intl J Lightweight Mater Manufact, 2020, 3: 328–337.
[3] Saba N, Paridah M T, Jawaid M. Mechanical properties of kenaf fiber reinforced polymer composite: a review. Constr Build Mater, 2015, 76: 87–96.
[4] Mahmood A, Sapuan S M, Karmegam K, Abu A S. Design and development of kenaf fiber-reinforced polymer composite polytechnic chairs. Asian J Agric Biol, 2018, 6: 62–65.
[5] 張迪, 趙文軍, 馬麗娟, 柴友榮. 原花青素的性質(zhì)、功能、純化和利用. 安徽農(nóng)學(xué)通報, 2009, 15(1): 35–39.
[6] 劉淑華, 臧丹丹, 孫燕, 李金霞, 趙恒田. 花青素生物合成途徑及關(guān)鍵酶研究進展. 土壤與作物, 2022, 11: 336–346.
[7] 趙文軍, 張迪, 馬麗娟. 原花青素的生物合成途徑、功能基因和代謝工程. 植物生理學(xué)通訊, 2009, 45: 509–519.
[8] 蘇全勝, 王爽, 孫玉強, 梅俊, 柯麗萍. 植物原花青素生物合成及調(diào)控研究進展. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報, 2021, 43(1): 219–229.
[9] Chen L H, Hu B, Qin Y H, Hu G B, Zhao J T. Advance of the negative regulation of anthocyanin biosynthesis by MYB transcription factors. Plant Physiol Biochem, 2019, 136: 178–187.
[10] 安秀紅, 張修德, 陳可欽, 劉肖娟, 郝玉金, 程存剛. 蘋果MdMYB9、MdMYB11表達及其蛋白互作分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 11: 2208–2216.
[11] Peter C P. Molecular controls of proanthocyanidin synthesis and structure: Prospects for genetic engineering in crop plants. J Agric Food Chem, 2018, 66: 9882–9888.
[12] Nesi N, Jond C, Debeaujon I, Caboche M, Lepiniec L. The Arabidopsis TT2 gene encodes an R2R3 MYB domain protein that acts as a key determinant for proanthocyanidin accumulation in developing seed. Plant Cell, 2001, 13: 2009–2114.
[13] Akhter D, Qin R, Nath U K, Jin X L, Shi C H. A rice gene, OsPL, encoding a MYB family transcription factor confers anthocyanin synthesis, heat stress response and hormonal signaling. Gene, 2019, 699: 62–72.
[14] Liu C C, Jun J H, Dixon R A. MYB5 and MYB14 play pivotal roles in seed coat polymer biosynthesis in Medicago truncatula. Plant Physiol, 2014, 165: 1424–1439.
[15] Zhou M L, Sun Z M, Ding M Q, Logacheva M D, Kreft I, Wang D, Yan M L, Shao J R, Tang Y X, Wu Y M, Zhu X M. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytol, 2017, 216: 814–828.
[16] Gao P, Li X A, Cui D J , Wu L M, Parkin I, Gruber M Y. Margaret Y G. A new dominant Arabidopsis transparent testa mutant, sk21-D, and modulation of seed flavonoid biosynthesis by KAN4. Plant Biotechnol J, 2010, 8: 979–993.
[17] Purkayastha A, Dasgupta I. Virus-induced gene silencing: a versatile tool for discovery of gene functions in plants. Plant Physiol Biochem, 2009, 47: 967–976.
[18] Chantreau M, Chabbert B, Billiard S, Billiard S, Hawkins S, Neutelings G. Functional analyses of cellulose synthase genes in flax (Linum usitatissimum) by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol J, 2015, 13: 1312–1324.
[19] 王心宇, 呂坤, 蔡彩平, 徐軍, 郭旺珍. TRV 病毒介導(dǎo)的基因沉默體系在棉花中的建立及應(yīng)用. 作物學(xué)報, 2014, 40: 1356–1363.
[20] Liu Y L, Schiff M, Dinesh-Kumar S P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J, 2002, 31: 777–786.
[21] Zhang L W, Wan X B, Xu J T, Lin L H, Qi J M. De novo assembly of kenaf (Hibiscus cannabinus) transcriptome using Illumina sequencing for gene discovery and marker identification. Mol Breed, 2015, 35: 192.
[22] Ryu J, Kwon S J, Sung S Y, Kim W J, Kim D, Ahn J W, Kim J B, Kin S, Ha B K, Kang S Y. Molecular cloning, characterization, and expression analysis of lignin biosynthesis genes from kenaf (Hibiscus cannabinus L.). Genes Genomics, 2015, 38: 59–67.
[23] 涂禮莉, 譚家福, 郭凱, 李中華, 張獻龍. 類黃酮代謝途徑與棉花纖維發(fā)育. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2014, 44: 758–765.
[24] 郭光艷, 柏峰, 劉偉, 秘彩莉. 轉(zhuǎn)錄因子對木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究進展. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48: 1277–1287.
[25] Zhang L W, Xu Y, Zhang X T, Ma X K, Zhang L L, Liao Z Y, Zhang Q, Wan X B, Chen Y, Zhang J S, Li D X, Zhang L M, Xu J T, Tao A F, Lin L H, Fang P P, Chen S, Qi R, Xu X M, Qi J M, Ming R. The genome of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) provides insights into bast fiber and leaf shape biogenesis. Plant Biotechnol J, 2020, 18: 1796–1809.
[26] Qin G J, Gu H Y, Ma L G, Peng Y B, Deng X W, Chen Z L, Qu L J. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Res, 2007, 17: 471–482.
[27] 高國應(yīng), 伍小方, 黃偉, 周定港, 張大為, 周美亮, 張凱旋, 嚴明理. 芥菜型油菜 BjuB.KAN4 基因調(diào)控類黃酮的途徑. 作物學(xué)報, 2020, 46: 1322–1331.
[28] Zhai R, Wang Z M, Zhang S W, Meng G, Song L Y, Wang Z G, Li P M, Ma F W, Xu L F. Two MYB transcription factors regulate flavonoid biosynthesis in pear fruit (Pyrus bretschneideri Rehd.). J Exp Bot, 2016, 67: 1275–1284.
[29] Li Y Q, Shan X T, Zhou L D, Gao R F, Yang S, Wang S C, Wang L, Gao X. The R2R3-MYB factor FhMYB5 from freesia hybrid a contributes to the regulation of anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis. Front Plant Sci, 2018, 9: 1935.
[30] Zhu L, Guan Y X, Zhang Z H, Song A P, Chen S M, Jiang J F, Chen F D. CmMYB8 encodes an R2R3 MYB transcription factor which represses lignin and flavonoid synthesis in chrysanthemum. Plant Physiol Biochem, 2020, 149: 217–224.
[31] Wang N H, Ma Q, Ma J J, Pei W F, Liu G Y, Cui Y P, Wu M, Zang X S, Zhang J F, Yu S X, Ma L J, Yu J W. A comparative genome-wide analysis of the R2R3-MYB gene family among four gossypium species and their sequence variation and association with fiber quality traits in an interspecific G. hirsutum × G. barbadense population. Front Genet, 2019, 10: 741.
[32] Chapman S, Kavanagh T, Baulcombe D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J, 1992, 2: 549–557.
[33] Liu Y L, Schiff M, Dinesh-Kumar S P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J, 2002, 31: 777–786.
[34] 李萌晗. 油棕病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)體系的建立, 優(yōu)化和驗證研究. 海南大學(xué)碩士學(xué)位論文, 海南?？? 2022.
[35] Jia H F, Lu D, Sun J H, Li C L, Xing Y, Qin L, Shen Y Y. Type 2C protein phosphatase ABI1 is a negative regulator of strawberry fruit ripening. J Exp Bot, 2013, 64: 1677–1687.
[36] 李玉霞, 曲延英, 艾海提·艾合買提, 王慧敏, 黃啟秀, 陳琴, 陳全家. 通過GbF3'H基因單獨沉默及其與GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海島棉中抗枯萎病功能. 棉花學(xué)報, 2020, 32(1): 1–10.
文章摘自：吳法軒,李秦,楊昕等.紅麻HcKAN4基因克隆、表達及在類黃酮合成中的功能[J/OL].作物學(xué)報:1-13[2023-10-09].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230928.0957.002.html
