摘 要：為開發(fā)具有較好抗氧化活性的植物源蛋白肽，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶法水解漢麻籽粕獲得漢麻籽蛋白水解物，經(jīng)膜分離技術(shù)得到4種不同分子質(zhì)量的多肽組分。通過DPPH自由基清除率、總還原力的測(cè)定，評(píng)價(jià)不同多肽組分的抗氧化活性，并對(duì)抗氧化活性最強(qiáng)的多肽組分進(jìn)行氨基酸序列分析。結(jié)果顯示：低分子質(zhì)量的漢麻籽多肽組分具有更好的抗氧化活性，其中HP-Ⅳ組分(分子質(zhì)量<1kDa)的抗氧化活性最強(qiáng)；HP-Ⅳ組分中豐度較高的6個(gè)肽段的分子質(zhì)量分別為364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41Da,氨基酸序列分別為NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRREGGRG、NHNNQLDLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLDTSNVNNQLDDNPRRFY。漢麻籽蛋白水解物，尤其是分子質(zhì)量小于1kDa的多肽組分可作為功能性成分用于抗氧化相關(guān)功能食品和保健品的開發(fā)。
關(guān)鍵詞：漢麻籽多肽；抗氧化活性；氨基酸序列
活性氧(ROS)參與人體生理代謝過程并起著至關(guān)重要的作用，在正常情況下，多余的ROS能夠通過生物體內(nèi)的抗氧化酶和非酶因子被有效消除[1]。ROS過多可導(dǎo)致許多疾病，如糖尿病、冠心病、癌癥、肝病和炎癥性疾病[2]。此外，ROS介導(dǎo)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致食物變酸，產(chǎn)生異味，并在食物中產(chǎn)生潛在的毒性[3]。因此，開發(fā)有效的抗氧化劑，對(duì)于食品加工和保鮮工業(yè)非常重要。目前，一些合成抗氧化劑具有很強(qiáng)的抗氧化性，并且已經(jīng)廣泛用于醫(yī)藥和食品工業(yè)。但是合成抗氧化劑具有副作用，如肝損害和致癌，影響其應(yīng)用[4]。因此，開發(fā)天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑具有重要的意義。飲食中的抗氧化成分包括維生素、類胡蘿卜素、類黃酮、酚和多肽等[5],其中功能活性肽具有生物活性高、毒性低的特點(diǎn)，可開發(fā)為天然抗氧化劑[6]。
食物源抗氧化肽在其氨基酸序列中無活性親本蛋白，具有2～20個(gè)氨基酸殘基，易于吸收并且沒有有害的免疫反應(yīng)，可以發(fā)揮其作為自由基清除劑、過氧化物活性分解劑、金屬滅活劑和氧氣抑制劑的作用，保護(hù)食品和生物免受ROS的侵害[7]。研究表明，植物蛋白來源的多肽如大豆蛋白肽[8]、鷹嘴豆多肽[9]、米糠多肽[10]、玉米多肽[11]、核桃仁多肽[12]具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以用于功能性食品。
漢麻(Cannabis sativa L.)也稱工業(yè)大麻、火麻、漢麻、線麻、黃麻等，是一種一年生草本植物，隸屬于大麻科，在中國和加拿大地區(qū)廣泛種植[13]。漢麻為無毒品種，四氫大麻酚含量低于0.3%。漢麻籽具有很好的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，其藥用功效在2000年版的《藥典》和2001年“藥食同源”名單中均有記載[14]。漢麻籽脂肪含量為35%～50%,蛋白質(zhì)含量為20%～40%。漢麻籽蛋白營養(yǎng)價(jià)值高，致敏性低，易消化，氨基酸種類齊全，組成均衡，必需氨基酸含量可以與酪蛋白和大豆蛋白相媲美，且精氨酸和谷氨酸含量豐富，是一種極具開發(fā)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)蛋白[15]。目前關(guān)于漢麻籽多肽的制備工藝與降血糖、降血脂、抗氧化作用研究已有大量的報(bào)道[13,16,17,18],而關(guān)于漢麻籽抗氧化肽組成分析和結(jié)構(gòu)鑒定的研究較少，因此本研究以漢麻籽粕為原料制備漢麻籽抗氧化肽，并對(duì)其進(jìn)行組成分析和結(jié)構(gòu)鑒定，以期為漢麻籽多肽在功能食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
漢麻籽粕，實(shí)驗(yàn)室采用超臨界技術(shù)由漢麻籽提取油脂后制得；木瓜蛋白酶(酶活力為8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力為1.3×105U/g),無錫雪梅酶制劑有限公司；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，ABSCIEX公司；Pellicon切向流超濾系統(tǒng)，Millipore公司；FD-2A-80型真空冷凍干燥機(jī)，上海繼譜電子科技有限公司；UV-5100B紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀、Easy-nLC1000納升級(jí)液相色譜，賽默飛世爾公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1漢麻籽多肽的制備與分離純化
以漢麻籽粕為原料制備漢麻籽多肽。按質(zhì)量比1∶5將漢麻籽粕加入蒸餾水溶解，然后調(diào)整溶液pH為5.0,溫度為70℃,加入漢麻籽粕質(zhì)量3.0%的中性蛋白酶、0.4%的木瓜蛋白酶，酶解3h。95℃水浴滅酶活10min,以10000r/min離心15min, 取上清液，備用。采用不同截留分子質(zhì)量超濾膜(1、3、5kDa)對(duì)上清液進(jìn)行分離，超濾條件為溫度25℃、壓力0.15MPa、轉(zhuǎn)速125r/min。收集各個(gè)組分的多肽液冷凍干燥，計(jì)算各組分所占比例。
1.2.2抗氧化活性測(cè)定
1.2.2.1DPPH自由基清除率的測(cè)定
根據(jù)You等[19]的方法測(cè)定DPPH自由基清除率，略作修改。冷凍干燥的漢麻籽多肽樣品用蒸餾水溶解得到質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mg/mL的溶液。取100μL漢麻籽多肽溶液，與100μL0.1mmol/L的DPPH溶液充分混勻后，在37℃水浴中反應(yīng)1.5h,測(cè)定在517nm處的吸光度。空白組為100μL乙醇溶液和100μL一定質(zhì)量濃度的漢麻籽多肽溶液，對(duì)照組為100μL乙醇溶液和100μLDPPH溶液。DPPH自由基清除率(E)按式(1)計(jì)算。
式中：A1為漢麻籽多肽溶液吸光度；A2為空白組吸光度；A3為對(duì)照組吸光度。
1.2.2.2總還原力的測(cè)定
參照Oyaizu[20]的方法測(cè)定總還原力，略作修改。反應(yīng)管中依次加入0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mg/mL的漢麻籽多肽溶液1.0mL,2.5mL0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5mL10mg/mL鐵氰化鉀溶液，充分混合后，于50℃的水浴中充分反應(yīng)20min,以3000r/min離心10min,取2.5mL上清液與0.1mL1mg/mLFeCl3混合，測(cè)定在700nm處的吸光度，以吸光度的大小表示總還原力的強(qiáng)弱。
1.2.3漢麻籽抗氧化肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定
采用MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)漢麻籽抗氧化肽的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定[21]。取質(zhì)量濃度為1mg/mL的漢麻籽多肽溶液1μL,點(diǎn)至樣品靶位上，自然干燥后，再取1μL CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(4700Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1)。采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品Calibration Mixture 1進(jìn)行外標(biāo)一級(jí)校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差小于0.5Da。圖譜采集條件：一級(jí)質(zhì)譜(MS)范圍(m/z)100～5000,每張譜圖累加500個(gè)Laser Shots。
1.2.4漢麻籽抗氧化肽的氨基酸序列分析
參照文獻(xiàn)[21]方法，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對(duì)漢麻籽抗氧化肽的氨基酸序列進(jìn)行分析，采用ESI質(zhì)譜鑒定及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。
2結(jié)果與分析
2.1漢麻籽多肽各組分所占比例
對(duì)漢麻籽粕酶解液進(jìn)行分離純化后得到4個(gè)多肽組分，各組分分子質(zhì)量及所占比例見表1。
表1 漢麻籽多肽各組分分子質(zhì)量及所占比例
由表1可知，得到的4個(gè)多肽組分中，HP-Ⅲ組分(分子質(zhì)量為1～3kDa)所占比例最高，為54.32%,其次為HP-Ⅳ組分(分子質(zhì)量<1kDa),所占比例為40.18%。
2.2漢麻籽多肽的抗氧化活性
2.2.1DPPH自由基清除能力
漢麻籽多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖1所示
圖1 漢麻籽多肽的DPPH自由基清除能力
DPPH自由基在乙醇溶液中穩(wěn)定，且在517nm處有最大的吸光度。當(dāng)DPPH自由基遇到提供質(zhì)子的物質(zhì)，如抗氧化劑時(shí)，自由基被清除，吸光度降低。這個(gè)方法可評(píng)價(jià)抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力。由圖1可見，漢麻籽多肽對(duì)DPPH自由基具有清除能力，且呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。漢麻籽多肽的分子質(zhì)量越大，相同質(zhì)量濃度的漢麻籽多肽對(duì)DPPH自由基清除能力越小。一般來說，生物活性肽的分子質(zhì)量、疏水性、氨基酸組成和序列被認(rèn)為在抗氧化作用中起關(guān)鍵作用，抗氧化肽的生物活性高度依賴于其分子大小，因?yàn)樾》肿拥目寡趸瘎└锌赡芘c自由基相互作用，以防止過氧化反應(yīng)[22]。
2.2.2總還原力
漢麻籽多肽的總還原力如圖2所示。
圖2 漢麻籽多肽的總還原力
總還原力是評(píng)價(jià)活性肽抗氧化活性的重要指標(biāo)。從圖2可見，在0.1～10.0mg/mL范圍內(nèi)，漢麻籽多肽的總還原力均隨著漢麻籽多肽質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系，相同質(zhì)量濃度條件下，分子質(zhì)量越大，總還原力越低，HP-Ⅳ組分的分子質(zhì)量(分子質(zhì)量<1kDa)最小，其總還原力最強(qiáng)。
2.3漢麻籽抗氧化肽的分子質(zhì)量分布
經(jīng)測(cè)定，HP-Ⅳ組分豐度較高的6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的肽段分子質(zhì)量分別為 364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41Da。
2.4漢麻籽抗氧化肽的氨基酸序列分析
為了確定可能引起抗氧化活性的肽段結(jié)構(gòu)，根據(jù)HP-Ⅳ組分的分子質(zhì)量分布，對(duì)HP-Ⅳ組分豐度較高的6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的肽段進(jìn)行氨基酸序列分析，多肽序列分析結(jié)果如表2所示，質(zhì)譜圖如圖3～圖8所示。
表2 漢麻籽抗氧化肽肽段的氨基酸序列
注：G.甘氨酸；A.丙氨酸；V.纈氨酸；L.亮氨酸；I.異亮氨酸；P.脯氨酸；F.苯丙氨酸；Y.酪氨酸；S.絲氨酸；T.蘇氨酸；M.甲硫氨酸；N.天冬酰胺；Q.谷氨酰胺；D.天冬氨酸；E.谷氨酸；R.精氨酸；H.組氨酸。
圖3 NRDDMRER質(zhì)譜圖
圖4 ANQLDQFSR質(zhì)譜圖
圖5 NPEDEFEQLRREGGRG 質(zhì)譜圖
圖6 NHNNQLDLTPR質(zhì)譜圖
圖7 TVNSYNLPILRF質(zhì)譜圖
圖8 VSLLDTSNVNNQLDDNPRRFY質(zhì)譜圖
據(jù)報(bào)道，天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等對(duì)肽的抗氧化性有貢獻(xiàn)[23]。由表2和圖3～圖8可知，鑒定的6個(gè)肽段中，均含具有抗氧化活性的氨基酸。已有研究證明多肽序列中異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸等疏水性氨基酸使其具有較好的抗氧化活性[24]。因此，研究認(rèn)為NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRR-EGGRG、NHNNQLDLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLD-TSNVNNQLDDNPRRFY多肽序列組成是使分子質(zhì)量小于1kDa的漢麻籽多肽組分具有較好抗氧化活性的主要因素。
3結(jié)論
本文采用復(fù)合蛋白酶法制備了具有較高抗氧化活性的漢麻籽多肽。利用切向流超濾系統(tǒng)分離純化，通過比較不同組分漢麻籽多肽的抗氧化活性，確定分子質(zhì)量小于1kDa的漢麻籽多肽具有最強(qiáng)的抗氧化活性。分子質(zhì)量小于1kDa的漢麻籽多肽組分中豐度較高的6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的肽段分子質(zhì)量分別為364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41Da,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列分析，得到的氨基酸序列分別為NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRREGGRG、NHNNQL-DLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLDTSNVNNQLDDN-PRRFY。研究認(rèn)為分子質(zhì)量小于1kDa的漢麻籽蛋白水解物是抗氧化功能食品開發(fā)的優(yōu)良原料。
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文章摘自：魏連會(huì),董艷,石杰,宋淑敏,孫興榮.漢麻籽抗氧化肽的制備與氨基酸序列分析[J].中國油脂,2022,47(04):36-40.DOI:10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.210278.
