1.2.3cDNA第一條鏈的合成

按照TransScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AQ301-01)的說明合成cDNA第一條鏈，并經(jīng)1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1本研究所用引物名稱和序列

1.2.4引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

通過idta primers網(wǎng)站(https://www.idtdna.com/)在線設(shè)計(jì)引物，利用TBtools軟件選擇引物，片段大小為70～200bp，引物長度為18～22bp，引物所對應(yīng)的模板序列復(fù)性溫度(Tm)為59～65℃，引物GC含量為50%～60%。參照Hossain et al^[34]的方法對引物的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)所用引物的名稱和序列見表1，其中，UBC2(the ubiquitin-conjugating enzyme like protein)為內(nèi)參基因。

1.2.5 qRT-PCR反應(yīng)

利用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒(AQ602-24)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量^[35]。

2結(jié)果與分析

2.1黃麻HD-ZIPⅠ家族蛋白序列進(jìn)化分析

基于擬南芥、水稻、大豆與黃麻4個(gè)物種的HD-ZIPⅠ家族基因編碼蛋白質(zhì)序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1，根據(jù)Eva et al^[36]定義的擬南芥中HD-ZIPⅠ亞家族的支系標(biāo)記該進(jìn)化樹的支系分組。從圖1可以看出，在黃麻中共鑒定獲得10個(gè)HD-ZIPⅠ編碼蛋白(以O(shè)MO或OMP開頭)，被分成7個(gè)亞組。其中，β1亞組包含2個(gè)黃麻蛋白，分別為OMO73039.1和OMP01294.1，前者與大豆有較近的進(jìn)化關(guān)系，而后者處于一個(gè)較獨(dú)立的分支。β2亞組中包含3個(gè)黃麻蛋白(OMO69727.1、OMO55126.1和OMO52137.1)、6個(gè)大豆蛋白和1個(gè)擬南芥蛋白，其中，OMO55126.1和OMO52137.1與大豆有較近的親緣關(guān)系，而OMO69727.1與擬南芥和大豆均有同源性，但與大豆的進(jìn)化關(guān)系更近。ε亞組中有1個(gè)黃麻蛋白(OMO83981.1)及2個(gè)大豆蛋白和2個(gè)擬南芥蛋白，OMO83981.1同樣表現(xiàn)出與大豆更近的親緣關(guān)系。γ亞組中有3個(gè)黃麻蛋白，分別為OMP08645.1、OMO97833.1和OMP02850.1，其中，前2個(gè)基因與大豆的親緣關(guān)系較近，而第3個(gè)基因處于一個(gè)較獨(dú)立的分支，其與大豆和擬南芥均有一定的同源性。在δ亞組的10個(gè)成員中，只有1個(gè)黃麻蛋白(OMO84308.1)，位置相對較獨(dú)立，但與擬南芥和大豆均有一定的進(jìn)化關(guān)系，與水稻關(guān)系較遠(yuǎn)。α、Φ兩個(gè)亞組均沒有黃麻HD-ZIPⅠ蛋白，其中，α亞組包含擬南芥和水稻蛋白，Φ亞組只包含1個(gè)擬南芥蛋白(ATHB54)。可見，黃麻HD-ZIPⅠ的蛋白序列與雙子葉植物大豆和擬南芥的相似度高于與單子葉植物水稻的相似度^[37]。

為進(jìn)一步明確黃麻與擬南芥和水稻HD-ZIPⅠ基因分化的情況，計(jì)算了Ka/Ks值(表2、3)，并進(jìn)行了共線性分析(圖2)。由表2和圖2可知，黃麻HD-ZIPⅠ家族8個(gè)基因與擬南芥的8個(gè)基因有共線性關(guān)系，這些基因主要位于第2和第5染色體上，第1、第3和第4染色體上也有分布，其Ka/Ks值在0.11～0.27之間，它們之間的分化時(shí)間最長為1.2146億年，最短為0.4730億年。而黃麻HD-ZIPⅠ家族中僅有2個(gè)基因與水稻有共線性關(guān)系，位于第2和第4染色體上，分別對應(yīng)水稻的3個(gè)基因，Ka/Ks值在0.07～0.26之間，它們之間的分化時(shí)間最長為1.4788億年，最短為0.6730億年(表3、圖2)。將與擬南芥和水稻均有同源性的2個(gè)基因(編號Co.02G0036900和Co.04G0025100)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們與水稻在更早之前開始分化，而與擬南芥的分化時(shí)間較晚。如黃麻Co.02G0036900與水稻分化的時(shí)間為1.3216億年，顯著長于其與擬南芥的分化時(shí)間(0.8479億年)。以上結(jié)果表明，黃麻HD-ZIPⅠ家族的基因與雙子葉植物擬南芥的進(jìn)化關(guān)系比與單子葉植物水稻更近。

圖1擬南芥、水稻、大豆和黃麻HD-ZIPⅠ家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹

ATH代表擬南芥，KHN代表大豆，LOC代表水稻，OM代表黃麻。

表2黃麻與擬南芥HD-ZIPⅠ基因家族的Ka/Ks值和分化時(shí)間

表3黃麻與水稻HD-ZIPⅠ基因家族的Ka/Ks值和分化時(shí)間

圖2黃麻與水稻和擬南芥HD-ZIPⅠ基因家族的共線性分析

2.2黃麻LEA14蛋白序列進(jìn)化分析

前期分析發(fā)現(xiàn)，黃麻LEA蛋白家族中僅LEA14基因的蛋白序列與其他物種有同源性，因此，利用擬南芥、棉花、大豆和黃麻4個(gè)物種的LEA14蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。從黃麻中僅鑒定獲得1個(gè)與擬南芥、大豆和棉花LEA14蛋白具有同源性的蛋白(OMP00313.1)，其與棉花(XP016708350)屬于同一個(gè)分支，相似度為86%，表明黃麻的LEA14基因與棉花的進(jìn)化關(guān)系最近。同時(shí)，OMP00313.1和XP016708350所構(gòu)成的小分支，與3個(gè)大豆蛋白處在同一個(gè)較大的分支內(nèi)，表明黃麻的LEA14基因與大豆也有較近的進(jìn)化關(guān)系。

2.3黃麻總RNA質(zhì)量檢測與引物驗(yàn)證

圖4表明，本研究所提取的黃麻RNA完整性較好，無DNA殘留，無明顯拖尾降解或受污染的現(xiàn)象。用吸光光度計(jì)檢測所提取RNA的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)D260nm/D280nm的值在1.9～2.2之間，D260nm/D230nm的值大于2.0，說明RNA純度較高。可見，本研究所提取的RNA質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。

圖3擬南芥、大豆、棉花和黃麻LEA14蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4黃麻總RNA電泳圖

圖5 qRT-PCR引物電泳結(jié)果

用HDZ4和LEA14及內(nèi)參基因UBC2的引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行對比，基于驗(yàn)證成功的引物選擇qRT-PCR的引物，以黃麻反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖5所示。所得條帶單一且清晰，沒有非特異性擴(kuò)增條帶，表明引物特異性強(qiáng)，片段大小與預(yù)期相一致，符合后續(xù)的qRT-PCR試驗(yàn)要求。

2.4鹽脅迫下黃麻LEA14基因的表達(dá)分析

由圖6A可知，隨著鹽脅迫時(shí)間的推移，LEA14在中黃麻1號葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)先下調(diào)再上調(diào)后又下調(diào)的規(guī)律，鹽脅迫48h時(shí)LEA14基因表達(dá)量最高；LEA14在中黃麻1號根部的表達(dá)規(guī)律與葉片中相同，鹽脅迫48h時(shí)表達(dá)量最高，但72h時(shí)表達(dá)量幾乎為0。此外，鹽脅迫24h時(shí)中黃麻1號葉片與根部LEA14的表達(dá)量接近，而鹽脅迫48和72h時(shí)LEA14在葉片中的表達(dá)量明顯高于根部。

圖6LEA14在中黃麻1號(A)和福農(nóng)1號(B)葉片和根部的表達(dá)量

LEA14在福農(nóng)1號葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)再下調(diào)的趨勢，鹽脅迫48h時(shí)達(dá)到最高值；而LEA14在福農(nóng)1號根部的表達(dá)規(guī)律為先下調(diào)再上調(diào)后又下調(diào)，脅迫48h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高水平。此外，鹽脅迫24和72h時(shí)LEA14在葉片中的表達(dá)量為根部的2倍左右，而48h時(shí)在葉片中的表達(dá)量略高于根部(圖6B)。

比較LEA14在兩個(gè)黃麻品種中的表達(dá)量(圖6)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫24h時(shí)，福農(nóng)1號葉片中LEA14的表達(dá)量明顯高于中黃麻1號，而此時(shí)二者根部LEA14的表達(dá)量差別不大。鹽脅迫48h時(shí)，中黃麻1號葉片中LEA14的表達(dá)量顯著高于福農(nóng)1號，而福農(nóng)1號根部LEA14的表達(dá)量較中黃麻1號高。鹽脅迫72h時(shí)，福農(nóng)1號葉片和根部LEA14的表達(dá)量均高于中黃麻1號。整體來看，在鹽脅迫條件下，LEA14在福農(nóng)1號葉片和根部的表達(dá)量高于中黃麻1號(除48h葉片外)。

2.5鹽脅迫下黃麻HDZ4基因的表達(dá)分析

由圖7可以看出：隨著鹽脅迫時(shí)間的推移，HDZ4在中黃麻1號葉片和根部的表達(dá)量變化不明顯，且同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，HDZ4在根部的表達(dá)量稍高于葉片，差異不顯著；HDZ4在福農(nóng)1號葉片和根部的表達(dá)量幾乎沒有差異，且在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量差異也不明顯。

圖7HDZ4在中黃麻1號(A)和福農(nóng)1號(B)葉片和根部的表達(dá)量

3討論

3.1HD-ZIPⅠ亞家族及LEA14蛋白的進(jìn)化關(guān)系

系統(tǒng)發(fā)育樹不僅可以分析不同物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，而且可以直觀表現(xiàn)不同物種的發(fā)生關(guān)系^[38,39]，該方法在LEA基因家族的分類和進(jìn)化關(guān)系研究中得到了廣泛應(yīng)用^[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃麻的1個(gè)LEA14基因編碼蛋白與棉花的親緣關(guān)系比與其他作物的關(guān)系更近。黃麻與棉花同屬錦葵科，具有較好的共線性。與棉花相比，黃麻的遺傳研究相對落后，而利用棉花遺傳信息加強(qiáng)對黃麻的遺傳研究，可為黃麻和棉屬的比較基因組學(xué)和遺傳研究提供依據(jù)，對于發(fā)現(xiàn)黃麻新基因、創(chuàng)造新種質(zhì)、培育新品種等均具有重要意義。

前人也利用進(jìn)化樹分析的方法，確定了不同作物HD-ZIP蛋白的分類和進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HD-ZIPⅠ為成員最多的亞家族。鐘宣伯^[16]揭示了擬南芥、水稻、野生大豆和大豆HD-ZIPⅠ蛋白的進(jìn)化關(guān)系，推測HD-ZIPⅠ亞組的分化起始于單、雙子葉植物分化之前，并在單、雙子葉植物分化后持續(xù)分化。本研究鑒定到10個(gè)與其他作物基因家族具有同源性的黃麻HD-ZIPⅠ蛋白，其與大豆、擬南芥(雙子葉)的序列相似度高于與水稻(單子葉)的相似度，且與擬南芥有更多的共線性基因，并且與擬南芥的分化時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于與水稻的分化時(shí)間，表明HD-ZIPⅠ家族基因在單、雙子葉中存在功能分化^[37]。該結(jié)果與鐘宣伯^[16]的研究結(jié)果類似。

3.2鹽脅迫下HDZ基因的表達(dá)

HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子可通過激活抗氧化系統(tǒng)、調(diào)節(jié)滲透穩(wěn)態(tài)、維持Na+/K+的穩(wěn)態(tài)以及調(diào)控下游脅迫響應(yīng)基因參與植物對鹽脅迫的應(yīng)答。研究表明：HD-ZIP基因可以提高抗氧化酶的活性和一些可溶性有機(jī)物質(zhì)的積累^[41]；玉米HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子HD-ZIPⅠ亞家族參與脫落酸(abscisic acid, ABA)介導(dǎo)的鹽脅迫響應(yīng)途徑，在高濃度鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株存活率遠(yuǎn)高于野生型^[42]；羅少^[11]發(fā)現(xiàn)，在所鑒定的33個(gè)桑樹HD-ZIP基因中，6個(gè)基因在高鹽處理下被顯著誘導(dǎo)，推測這6個(gè)基因與桑樹的抗鹽能力有關(guān)。本研究中，HDZ4基因在不同品種以及鹽脅迫的不同時(shí)間的表達(dá)量差異均不明顯。這可能是由于取樣間隔時(shí)間(24h)太長，推測黃麻HDZ4基因可能在鹽脅迫后短時(shí)間(12h)內(nèi)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，之后表達(dá)趨于穩(wěn)定，對此有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3鹽脅迫下LEA基因的表達(dá)

LEA蛋白是一種親水性蛋白，主要應(yīng)對與脫水相關(guān)的非生物逆境脅迫，包括耐鹽、抗旱、抗凍等^[43]。LEA基因在不同作物中有不同的表達(dá)趨勢，且過量表達(dá)該基因能增強(qiáng)作物對逆境脅迫的耐性。例如：將大麥LEA基因HVA1轉(zhuǎn)化至水稻中，轉(zhuǎn)基因植株抵御鹽脅迫的能力較野生型明顯增強(qiáng)^[44]；擬南芥Atlg01470.1基因在干旱、鹽、強(qiáng)光3種脅迫下的表達(dá)量比非脅迫條件下高5倍^[22]；Jia et al^[23]從擬南芥中鑒定獲得一種LEA蛋白AtLEA14，其過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽的耐受性增強(qiáng)；甘薯在鹽脅迫條件下，葉片和根系中IbLEA14的表達(dá)量從12h后開始上調(diào)，24h后下調(diào)^[24]；天山雪蓮的SiLEA14基因，在低溫和鹽脅迫24h時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，并且該基因過量表達(dá)能提高煙草的耐鹽能力^[25]。本研究中：LEA14在鹽脅迫處理的黃麻中也基本呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的規(guī)律，且鹽脅迫48h時(shí)是該基因被誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)；同時(shí)，LEA14在不同黃麻品種葉片中的表達(dá)量均高于根部，表明該基因在不同植物組織中的表達(dá)水平存在差異；另外，LEA14在較耐鹽品種福農(nóng)1號根部和葉片中的表達(dá)量基本高于在較敏感品種中黃麻1號中的表達(dá)量，這表明LEA14的上調(diào)表達(dá)與植物對鹽脅迫的耐性有關(guān)。后續(xù)可通過該基因的過量表達(dá)研究其提高黃麻耐鹽性的作用機(jī)理，為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、耐鹽黃麻新品種的選育提供理論依據(jù)。

4結(jié)論

本研究在黃麻中鑒定到10個(gè)與其他作物具有同源性的HD-ZIPⅠ蛋白，發(fā)現(xiàn)其與雙子葉植物蛋白序列的相似度高于與單子葉植物的相似度；同時(shí)，鑒定到1個(gè)與其他作物同源性較高的黃麻LEA14蛋白OMP00313.1，其與棉花的同源性最高，進(jìn)化關(guān)系最近。另外，在鹽脅迫處理下，HDZ4在不同黃麻品種、不同組織及不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量沒有明顯差異；而LEA14在2個(gè)黃麻品種葉片中的表達(dá)量高于在根部的表達(dá)量，并且在較耐鹽品種福農(nóng)1號中的表達(dá)量總體上高于在較敏感品種中黃麻1號中的表達(dá)量；同時(shí)，鹽脅迫48h時(shí)是LEA14基因表達(dá)的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。

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文章摘自：陳毓娜,Manuel Sebastian Fiallos,李靜,李云清,祁建民,徐建堂,方平平,林荔輝,張立武,陶愛芬.黃麻與其他物種HD-ZIPⅠ和LEA14蛋白序列同源性及其鹽脅迫表達(dá)分析[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2022,51(03):298-306.DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2022.03.002.