摘  要：黃酮醇合成酶（FLS）是黃酮醇合成的關(guān)鍵酶，對(duì)植物花色的色調(diào)和強(qiáng)度形成有重要作用，研究該基因密碼子偏好性有助于進(jìn)一步了解黃酮醇的功能.為明確羅布麻黃酮醇合成酶基因密碼子的使用特性，采用CondoW、Tbtools、SPSS軟件及EMBOSS在線程序分析AvFLS密碼子偏好性，通過(guò)ENc繪圖、中性繪圖和PR2-plot分析FLS基因密碼子偏好性形成的可能原因，比較AvFLS與模式生物的密碼子使用頻率獲得最佳受體.結(jié)果表明：AvFLS的有效密碼子數(shù)（ENc）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）和GC含量分別為47.09、0.2和39.48%，表明AvFLS基因密碼子偏好性較弱。AvFLS基因偏好性密碼子有27個(gè)（RSCU>1），其中22個(gè)以A/T結(jié)尾，表明該基因偏好使用A/T結(jié)尾的密碼子；基因序列進(jìn)化分析及RSCU聚類分析表明，AvFLS基因的密碼子使用偏好性與同源關(guān)系較近的桔梗相似；密碼子堿基成分和相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，AvFLS密碼子偏好性主要受突變壓力的影響；密碼子使用頻率比較分析發(fā)現(xiàn)，酵母真核表達(dá)系統(tǒng)更適合AvFLS異源表達(dá)。本研究表明模式植物擬南芥、煙草、番茄、甜菜和蒺藜苜蓿均可作為AvFLS的遺傳轉(zhuǎn)化受體，結(jié)果可為后續(xù)AvFLS改造和功能驗(yàn)證研究提供一定參考。（圖6表3參44）

關(guān)鍵詞：羅布麻；AvFLS；密碼子偏好性；進(jìn)化分析；外源宿主

 

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，黃酮類化合物就是其中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，其分子量較低，分布區(qū)域廣泛，與花色的形成、保護(hù)植物緩解脅迫傷害等密切相關(guān)^[1].通過(guò)苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生的黃酮類化合物，主要有查爾酮、異黃酮、黃酮醇、花青素等^[2,3].黃酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）是調(diào)節(jié)黃酮醇化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶，F(xiàn)LS基因表達(dá)量高低顯著調(diào)控植物黃酮醇的含量^[4]。黃酮醇合酶在許多植物中已有廣泛的研究^[5]，其全長(zhǎng)首先在矮牽牛中被克隆出來(lái)^[6]。黃酮醇不僅在植物抵御環(huán)境脅迫中起保護(hù)作用；而且在醫(yī)療保健領(lǐng)域也存在十分廣泛的用途：對(duì)血管收縮具有松弛作用、抗氧化、抗癌、抗菌消炎、預(yù)防心腦血管疾病和糖尿病等作用^[7,8]。黃酮醇合成酶基因FLS不僅影響著植物中黃酮類化合物的代謝途徑，同時(shí)參與植物花色的形成。黃酮醇合成酶基因FLS與花青苷基因DFR競(jìng)爭(zhēng)底物二氫黃酮醇，影響著產(chǎn)物黃酮醇和花青素含量^[5]。

遺傳信息的傳遞過(guò)程中，從DNA到蛋白質(zhì)需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階段。生物遺傳信息的基本單位是脫氧核糖核苷酸，含有4種（A、T、C、G）不同的堿基。堿基不同的排列順序儲(chǔ)藏著遺傳信息，也稱為遺傳密碼子。mRNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，密碼子在聯(lián)系核酸與合成蛋白質(zhì)氨基酸過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。自然界中共存在61種密碼子，編譯著20種氨基酸，除了甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）由唯一的密碼子編碼外，其他氨基酸最少2個(gè)密碼子，最多達(dá)到6個(gè)密碼子。由于遺傳環(huán)境影響以及基因的生物學(xué)功能不同造成物種對(duì)密碼子的使用存在偏好性^[9]。密碼子使用偏好性是物種進(jìn)化的特征之一，對(duì)研究基因功能、物種進(jìn)化等問(wèn)題具有重要科學(xué)意義^[10]。密碼子偏好性主要受到突變壓力和自然選擇的作用，此外還受到基因的功能、基因長(zhǎng)度、蛋白質(zhì)翻譯、氨基酸親疏水性等因素的影響。通過(guò)分析密碼子的使用頻率和影響因素，能夠了解物種間基因的起源關(guān)系及進(jìn)化規(guī)律^[11]。此外，密碼子偏好分析有助于了解基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的分子機(jī)制、最優(yōu)密碼子、合適外源表達(dá)宿主及提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量和合成生物學(xué)的發(fā)展^[12,13]。

羅布麻是一種極具耐鹽、耐旱的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、藥用植物，能在鹽堿地和荒漠等惡劣的自然條件下生長(zhǎng)。黃酮類化合物是羅布麻主要的活性成分。目前羅布麻的研究主要集中于次生代謝產(chǎn)物的提取分離純化^[14]及生理研究^[15]，缺少羅布麻黃酮類化合物相關(guān)基因的功能研究。羅布麻AvFLS基因作為羅布麻黃酮類化合物合成通路中的關(guān)鍵調(diào)控基因發(fā)揮著重要的作用。目前，有關(guān)AvFLS基因密碼子研究仍為空白，因此開(kāi)展AvFLS基因密碼子相關(guān)研究具有重要意義。本課題組已克隆出AvFLS基因，這為進(jìn)一步開(kāi)展AvFLS基因功能和表達(dá)模式的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究比較分析AvFLS基因與其他物種中與黃酮醇代謝相關(guān)的FLS基因，明確AvFLS基因的密碼子偏好性與進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)，通過(guò)比較羅布麻AvFLS和模式生物密碼子頻率，確定合適的異源表達(dá)宿主，為后續(xù)探究AvFLS基因的功能特別是異源表達(dá)提供一定參考。

1材料與方法

1.1序列數(shù)據(jù)來(lái)源

AvFLS(GenBank登錄號(hào)：MK391176.1）全長(zhǎng)為1212bp，含有一個(gè)1008bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼335個(gè)氨基酸^[16]。水稻、玉米、煙草等26個(gè)物種的FLS基因序列來(lái)源于GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），登錄號(hào)見(jiàn)表1.擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、甜菜（Beta vulgaris）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、大腸桿菌（Escherichia coli）及酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）基因組密碼子偏好性數(shù)據(jù)來(lái)源于密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/）^[14]。

1.2密碼子偏好性參數(shù)分析

參照彭麗云等和趙耀等的數(shù)據(jù)分析方法^[17,18]，采用CodonW軟件和EMBOSS^[19]在線程序CHIPS(http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）和CUSP(http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）分析比較不同物種FLS基因的編碼序列（coding sequence,CDS）的密碼子使用參數(shù)。

1.3密碼子堿基組成分析

分析密碼子的堿基組成規(guī)律可揭示造成密碼子偏好性形成的原因。參考趙春麗等的方法^[20]，使用Excel 2010等軟件對(duì)FLS基因密碼子相關(guān)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。

1.4進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及聚類分析

使用MEGA 7.0鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建不同物種FLS基因的CDS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。以不同物種間FLS基因同義密碼子相對(duì)使用度RSCU作為變量，采用TBtools^[21]對(duì)不同物種FLS基因的RSCU值進(jìn)行分層聚類分析。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0^[20]對(duì)密碼子偏好性參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

1.6AVFLS基因受體系統(tǒng)的選擇

選擇羅布麻黃酮醇合成酶基因的合適表達(dá)宿主，計(jì)算其與多個(gè)模式物種基因組密碼子使用頻率之間的比值，確定最合適的異源表達(dá)受體^[18]。

2結(jié)果與分析

2.1AvFLS密碼子使用偏好性

2.1.1AvFLS基因有效密碼子數(shù)、GC及密碼子適應(yīng)指數(shù)

AvFLS的有效密碼子數(shù)（ENc）值為47.09，表明AvFLS的密碼子大都可以均勻利用，但也存在一定選擇偏好性。研究結(jié)果表明，結(jié)果顯示AvFLS中密碼子的GC含量為39.48%,GC1含量為51.49%,GC2含量為31.55%,GC3含量為35.42%，見(jiàn)表1，說(shuō)明AvFLS的GC含量較低，同時(shí)比較偏愛(ài)A或U結(jié)尾.AvFLS的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）值為0.2，遠(yuǎn)低于1.0，進(jìn)一步表明AvFLS基因偏好性較弱.

2.1.2AvFLS同義密碼子的相對(duì)使用度RSCU

當(dāng)密碼子的RSCU值等于1時(shí)，說(shuō)明能夠平均的使用該密碼子，超過(guò)1時(shí)，說(shuō)明其出現(xiàn)頻率高于期望值，表現(xiàn)為使用率較好，反之則較差。圖1顯示了AvFLS的RSCU分析結(jié)果，其偏好性密碼子27個(gè)，有22個(gè)以A/U結(jié)尾，G/C結(jié)尾的有5個(gè)，進(jìn)一步表明AvFLS偏愛(ài)以A/U密碼子。羅布麻FLS蛋白中亮氨酸和精氨酸殘基的主要密碼子分別是CUU和AGA。密碼子UCA、CUU、GCA、ACU的RSCU≥2，具有優(yōu)先選擇性。另外，密碼子UAU、UAC的RSCU值在翻譯酪氨酸（Tyr）時(shí)為1，沒(méi)有使用偏好。CUC、GUA、UCG、CCG、ACG、GCG、CGU和CGG等RSCU值為0的密碼子，表明AvFLS缺失這些密碼子。

2.2不同物種間FLS基因密碼子使用偏好性

2.2.1密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)

表1顯示了FLS基因密碼子偏好性參數(shù)。草本植物FLS基因的CAI值、ENc和GC值存在明顯的差異，與此相反木本植物差異較小。草本植物的GC、GC1、GC2、GC3、GC12、GC3s、ENc、CAI平均值分別為49.98%、56.25%、35.36%、58.34%、45.81%、56.2%、50.03、0.210，與木本植物密碼子偏好性數(shù)據(jù)平均值47.54%、54.76%、35.01%、52.83%、44.89%、50.57%、55.50、0.216沒(méi)有明顯差異.單子葉植物GC、CAI及ENc平均值為56.56%、0.233和54.67，說(shuō)明單子葉植物FLS基因的密碼子偏好性較強(qiáng)，表示其可能具有較高的基因表達(dá)豐度.雙子葉植物GC、CAI及ENc平均值分別為45.55%、0.202、53.79，表明雙子葉植物密碼子的偏好性較弱，尤其是銀杏，其FLS基因?qū)γ艽a子的選擇完全隨機(jī)（ENc=61).AvFLS基因與雙子葉植物中的煙草、忍冬、杜仲、矮牽牛、橡膠樹(shù)及富含黃酮類化合物的番茄等的FLS基因的ENc值為46.01-53.37，平均值為49.64，說(shuō)明羅布麻AvFLS基因具有雙子葉植物密碼子偏好性的典型特征。

 

圖1 AvFLS基因同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）分析。下劃線表示羅布麻AvFLS基因?qū)υ撁艽a子的使用頻率較高。

 

2.2.2不同物種FLS基因中性

利用SPSS 22.0對(duì)密碼子GC含量、ENc、CAI及密碼子數(shù)目進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果（表2）顯示不同物種FLS基因GC與GC1、GC2、GC3呈顯著性正相關(guān)，表示密碼子3個(gè)堿基組成比較相似，GC、GC1、GC3與ENc呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01),GC2與ENc呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），表明GC含量越大，則ENc值越小，密碼子偏好性越強(qiáng)。ENc與密碼子數(shù)目N之間未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明密碼子數(shù)目對(duì)ENc的影響較弱﹐即排除了基因序列長(zhǎng)度對(duì)密碼子偏好性的影響。采用中性分析法（圖2）對(duì)不同物種的FLS基因進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，GC3范圍35.42%-95.18%,GC12范圍為41.52%-53.90%,GC12范圍較小，且大部分分布在回歸線左右兩側(cè)；線性歸系數(shù)和顯著性相關(guān)水平分別為0.732和0.859(P<0.01），與Pearson的關(guān)聯(lián)分析一致，不同物種的FLS基因GC12和GC3的堿基組成無(wú)明顯差異.AvFLS基因位于回歸線的左側(cè)，與雙子葉草本植物的FLS基因分布關(guān)系密切.羅布麻AvFLS基因密碼子的偏好性主要受突變壓力的影響。

表1 不同物種間FLS基因密碼子選擇偏好性分析

 

 

表2 不同物種FLS基因密碼子成分相關(guān)性分析（Pearson分析）

 

*表示顯著相關(guān)（P<0.05），**表示極顯著相關(guān)（P<0.01)。

 

 

圖2 FLS基因密碼子使用偏好性中性繪圖

 

2.2.3不同物種FLS基因ENc

ENc不僅表示密碼子使用的偏好性，還可以鑒定堿基組成在物種進(jìn)化過(guò)程中形成獨(dú)特的密碼子偏好性的作用。ENc和GC3的期望曲線可以證明它們?cè)谕蛔儔毫ι系膶?duì)應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)果（圖3）表明，除銀杏和臺(tái)灣相思的基因位點(diǎn)位于期望曲線上方，其余均位于期望曲線下方，同時(shí)GC3s值在0.354 2-0.951 8之間，表明FLS的密碼子偏好性主要受突變壓力的作用.FLS基因分散分布表明受到突變壓力的影響程度不同，同時(shí)還受自然選擇的影響^[22,23,24]。

2.2.4不同物種FLS基因PR2

奇偶偏好性結(jié)果（圖4）顯示不同物種FLS基因的坐標(biāo)值均偏離了0.5，從橫縱坐標(biāo)來(lái)看，AvFLS基因密碼子第3位堿基T的使用頻率高于A,G/C的使用頻率中密碼子第三位對(duì)G具有偏好性。若FLS基因完全受到突變壓力的作用，A/T和G/C的使用頻率應(yīng)相等^[23]，因此不同物種FLS基因進(jìn)化過(guò)程中突變壓力與自然選擇均會(huì)影響密碼子偏好性。

2.2.5不同物種FLS基因RSCU及CDS的聚類

通過(guò)鄰接法對(duì)37個(gè)FLS基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖5）顯示，基因CDS序列與氨基酸序列聚類結(jié)果大致相同。由進(jìn)化樹(shù)可知26個(gè)物種可聚為7小枝：草本植物中雙子葉植物聚為一個(gè)小支，羅布麻AvFLS基因與合瓣花亞綱的番茄、矮牽牛、煙草、忍冬、桔梗以及原始花被亞綱杜仲的FLS基因聚為1支，其ENc值差異較?。?6.01≤Enc≤57.56），但GC3含量卻差異較大（35.42%≤GC3≤60.24%），可能是杜仲密碼子偏好性受第三位GC含量影響較大。草本植物中單子葉植物玉米、水稻、水仙、葡萄風(fēng)信子、鐵皮石斛、洋蔥、蝴蝶蘭、蕙蘭的ENc值和GC3含量相似度較高聚為一支。擬南芥6個(gè)黃酮醇合成酶基因單獨(dú)聚為一支。木本植物中茄科植物橡膠樹(shù)、木薯、茶樹(shù)、臺(tái)灣相思樹(shù)和葡萄的1個(gè)基因等聚為1個(gè)分支。木本植物中薔薇科的物種蘋(píng)果、櫻桃、薔薇和西洋梨和鼠李目的葡萄4個(gè)基因聚為一個(gè)分支。裸子植物銀杏單獨(dú)聚為一支。

 

圖3 FLS相關(guān)基因有效密碼子數(shù)（ENc）含量的分布。

 

 

圖4 奇偶偏好偏差分析A3、T3、G3、C3分別表示密碼子第三位上各個(gè)堿基的含量。紅色數(shù)據(jù)標(biāo)記點(diǎn)為羅布麻FLS基因。

 

RSCU值為變量，采用TBtools進(jìn)行聚類分析和熱圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖6.這些物種在FLS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的基礎(chǔ)上略有差異，分為8個(gè)小支.單子葉植物葡萄風(fēng)信子、水稻和兩條玉米的FLS基因聚為一支。合瓣花亞綱的番茄、煙草、忍冬、桔梗、羅布麻、矮牽牛及原始花被亞綱的橡膠樹(shù)等則較接近，聚為一支。鐵皮石斛單獨(dú)聚為一支；薔薇目的杜仲和臺(tái)灣相思樹(shù)與百合目的水仙聚為一支。蘭科的蝴蝶蘭和蕙蘭與十字花科的4條擬南芥FLS基因聚為一支。擬南芥、玉米和葡萄各有1條FLS基因聚為一支。木本植物西洋梨、蘋(píng)果、甜櫻桃、銀杏、茶樹(shù)、木薯、薔薇和2條葡萄FLS基因聚為一支。洋蔥和1條擬南芥基因以及2條葡萄FLS基因歸為一類。

表3 羅布麻FLS基因與常見(jiàn)模式生物基因組密碼子使用偏好性比較

 

 

2.3AvFLS受體系統(tǒng)的選擇

密碼子使用頻率的比值能衡量物種間密碼子使用偏好差異^[25]。將羅布麻FLS基因與模式物種基因組密碼子使用頻率進(jìn)行比較，見(jiàn)表3通常認(rèn)為比值介于0.5-2.0時(shí)物種間密碼子的使用特性^[26]較一致，AvFLS含有23個(gè)與大腸桿菌密碼子頻率差異性較大的密碼子，所以僅有12個(gè)差異密碼子的酵母菌更適合做羅布麻FLS基因的真核表達(dá)載體^[17].羅布麻FLS基因模式植物基因組偏好性差異較小，都只有10個(gè)左右差異較大的密碼子，表明5個(gè)模式植物均可作為AvFLS的異源表達(dá)受體。

 

圖5 基于FLS基因CDS的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

3討論與結(jié)論

長(zhǎng)期以來(lái)，在自然進(jìn)化過(guò)程中，受多種因素共同作用，生物對(duì)密碼子的使用有一定的偏好。本文中結(jié)合Pearson相關(guān)性，中性繪圖、ENc-plot繪圖綜合分析，發(fā)現(xiàn)羅布麻FLS基因密碼子偏好性主要受到突變壓力的作用。這與李蓉等人在蘭科植物FNR基因的研究結(jié)果^[24]相似；莧菜藍(lán)光受體基因AmCRY1、轉(zhuǎn)錄因子AmMYB2基因、AtGAI基因主要受突變壓力的作用形成密碼子偏好性^[18,20,28]；蒺藜苜蓿葉綠體密碼子的偏好性主要受到選擇突變的影響^[29]；陳哲等人研究發(fā)現(xiàn)菠蘿基因密碼子的偏好性經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化受到了自然選擇和突變的共同作用^[30]。而在水稻葉綠體基因組密碼子偏好性形成過(guò)程中自然選擇為主要影響因素，突變壓力這方面起到了次要作用^[31]。綜合分析，認(rèn)為FLS基因密碼子偏好性主要受到突變壓力的作用，但也受轉(zhuǎn)錄翻譯、基因表達(dá)量、自然選擇等因素影響。

本研究對(duì)羅布麻FLS基因進(jìn)行PR2-plot繪圖分析密碼子第3位的堿基含量，發(fā)現(xiàn)第3位堿基富含A和T，且偏好以T結(jié)尾。ENc值47.09遠(yuǎn)大于35，一般認(rèn)為ENc≤35時(shí)密碼子使用具有明顯的偏好，ENc≥50時(shí)則認(rèn)為偏好程度較低^[34]。結(jié)果表明，草本植物FLS基因密碼子的選擇偏好程度比木本植物強(qiáng)，可能有較高的基因表達(dá)豐度。除一條玉米的FLS基因，其余單子葉植物FLS基因偏愛(ài)使用GC結(jié)尾的密碼子，與Wang等雙子葉植物中A或T在密碼子的第3位大多被過(guò)度使用，而G/C結(jié)尾的密碼子大都被單子葉植物使用的結(jié)論^[33]一致。雙子葉植物中草本植物（除杜仲外和5條擬南芥FLS基因）及木本植物中橡膠、木薯、茶樹(shù)偏向以A/T結(jié)尾；鼠李目的杜仲和薔薇目植物葡萄、櫻桃、蘋(píng)果、臺(tái)灣相思樹(shù)、薔薇和西洋梨等可能因環(huán)境、FLS基因類型和功能的差異，或更好地發(fā)揮生物學(xué)功能偏向使用以G/C結(jié)尾的密碼子^[34]。這與趙春麗等發(fā)現(xiàn)薔薇科植物GAI基因的密碼子在進(jìn)化過(guò)程中也偏好以G/C結(jié)尾的結(jié)果^[20]相似。這表明不同植物的FLS基因的堿基組成不同，影響密碼子偏好性的因素也存在差異，可能還受到基因功能、基因堿基組成、基因表達(dá)量和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)多方面的影響^[27,35]。

 

圖6 FLS相關(guān)基因的RSCU值聚類分析

FLS基因的CDS序列進(jìn)化樹(shù)和RSCU值聚類分析的比較結(jié)果表明，F(xiàn)LS基因CDS的差異大小更符合親緣關(guān)系的分類規(guī)律，而密碼子偏好性的聚類分析結(jié)果可能很好地反映了FLS基因的某些特異性進(jìn)化規(guī)律（如能把木本和草本區(qū)分開(kāi)來(lái)）。因此，為了準(zhǔn)確地反映不同物種的進(jìn)化歷史，結(jié)合RSCU值聚類分析與CDS序列進(jìn)化分析是更好的選擇^[35]。這與李蓉和王曉等人的研究結(jié)果^[27,28]相似。

羅布麻黃酮醇合成酶基因密碼子使用特點(diǎn)與大腸桿菌的差異較大，酵母真核表達(dá)系統(tǒng)更適用于羅布麻FLS基因異源表達(dá)^[36]。如要以大腸桿菌為宿主，需對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化編碼序列，甚至可以使基因表達(dá)量提高1 000倍^[37]，但是通過(guò)密碼子優(yōu)化算法的部分基因序列與原始基因相比，表達(dá)量也可能偏低，這可能是基因的表達(dá)還受到翻譯延伸過(guò)程中的影響^[38]。目前改進(jìn)植物CRISPR激活系統(tǒng)可以提高煙草內(nèi)源DFR基因表達(dá)量10 000倍^[39]，這為提高植物目的基因表達(dá)量提供了新的方向。不同模式植物之間的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，5種植物均可作為羅布麻黃酮醇合成酶基因FLS的遺傳轉(zhuǎn)化受體。劉曉等人構(gòu)建蘋(píng)果FLS基因原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，在體外誘導(dǎo)可產(chǎn)生蘋(píng)果FLS蛋白并具有催化活性^[40]。齊月英在定向轉(zhuǎn)化小麥黃酮醇合成酶TaFLS2基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥中，不僅發(fā)現(xiàn)TaFLS2基因具有催化活性，還增強(qiáng)了黃酮醇的合成能力^[41]。然而，過(guò)表達(dá)目的基因的編碼區(qū)與受體內(nèi)源基因存在較高的同源性時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因的表達(dá)同時(shí)受到抑制出現(xiàn)共抑制現(xiàn)象^[42]。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)擬南芥AtCYP1基因和煙草中過(guò)表達(dá)NtFLS2基因，均發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)目的基因表達(dá)量降低的共抑制植物株系^[43,44]。綜上所述，目標(biāo)基因能否高效表達(dá)還受到基因表達(dá)和蛋白生物合成等因素的限制，同時(shí)細(xì)胞生理學(xué)之間的分子機(jī)制仍有許多未知，如何實(shí)現(xiàn)羅布麻FLS基因高效遺傳轉(zhuǎn)化需要更進(jìn)一步的研究。

AvFLS基因是羅布麻黃酮醇積累的關(guān)鍵基因，分析其密碼子偏好性和選擇合適的異源表達(dá)受體為深入研究其進(jìn)化規(guī)律、表達(dá)調(diào)控和后續(xù)開(kāi)展基因功能預(yù)測(cè)奠定了一定基礎(chǔ)。本文通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析確定了羅布麻FLS基因偏好以A/T結(jié)尾的密碼子，具有雙子葉植物的典型特征。羅布麻FLS基因適宜以基因組密碼子偏好性較小酵母細(xì)胞為受體，但也可以選擇優(yōu)化密碼子以大腸桿菌宿主。擬南芥、煙草、番茄、甜菜、蒺藜苜蓿與AvFLS基因密碼子偏好性差異較小，均可作為其異源表達(dá)植物受體。本文初步探明了AvFLS基因合適的異源表達(dá)宿主，但后續(xù)過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建、抗生素篩選標(biāo)記的選擇，以及基因能否在宿主中穩(wěn)定高效的表達(dá)等還需要進(jìn)行進(jìn)一步探究。

 

參考文獻(xiàn)

[1]Hertog MGL, Hollman PCH, Katan MB. Content of potentially anticarcinogenic flavonoids of 28 vegetables and 9 fruits commonly consumed in the Netherlands[J].J Agric Food Chem, 1992, 40(12):2379-2383

[2]鄒麗秋,王彩霞,匡雪君,李瀅,孫超.黃酮類化合物合成途徑及合成生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2016,41(22):4124-4128[Zou LQ, Wang CX, Kuang XJ, Li Y, Sun C. Advance in flavonoids biosynthetic pathway and synthetic biology[J]. China J Chin Mater Med, 2016, 41(22):4124-4128]

[3]Zhang Y,Cao J,Chen W, Yang JD,Hao DF,Zhang Y,Chang PL,Zhao XJ.Reproducibility and relative validity of a food frequency questionnaire to assess intake of dietary flavonol and flavone in Chinese university campus population[J].Nutr Res, 2010, 30(8):520-526

[4]鄭雪蓮,李嘉儀,楊俊,鄭國(guó)華.枇杷黃酮醇合成酶FLS基因表達(dá)與黃酮醇積累的相關(guān)性分析[J].福建農(nóng)業(yè)科技,2019(5):1-6[Zheng XL,Li JY, Yang J,Zheng GH.Correlation analysis between flavonol synthetase genetic expression and flavono accumulation in Loquat[J].Fujian Agric Sci Technol,2019(5):1-6]

[5]石水蓮,李威,李可,呂玲玲.植物FLS研究進(jìn)展[J].分子植物育種,2019,17(18):5980-5985[Shi SL,Li W,Li K,LüLL.Advances of FLS in Plant[J].Mol Plant Breed,2019,17(18):5980-5985]

[6]Froemel S,Vlaming PD,Stotz G,Wiering H,Forkmann G,Schram AW.Genetic and biochemical studies on the conversion of flavanones to dihydroflavonols in flowers of Petunia hybrida[J].Theor Appl Genet,1985,70(5):561-568.

[7]Kim J,Liu L,Guo W,Meydani M. Chemical structure of flavonols in relation to modulation of angiogenesis and immune-endothelial cell adhesion[J].J Nutr Biochem,2006,17(3):165-176

[8]Lee BH,Jeong SM,Jung SM,Lee JH, Kim JH, Yoon IS,Lee JH, Choi SH,Lee SM,Chang CG,Kim HC,Han YS,Paik HD,Kim Y,Nah SY.Quercetin inhibits the 5-hydroxytr yptamine type 3 receptor-mediated ion current by interacting with pretransmembrane domain I.Mol Cells.2005,20(1):69-73

[9]Guo XN,Wang YL,Wang SM. Complete chloroplast genome sequences from yellowhorn(Xanthoceras sorbifolia)and evolution analysis based on codon usage bias[J].Int J Agric Biol,2020,24:676-684

[10]李慧姬,吉雪花,朱冉冉,張中榮,張海英,呂慧.10種植物PSY基因密碼子使用偏好性分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2020,29(2):276-284[Li HJ,Ji XH, Zhu RR, Zhang ZR,Zhang HY, LüH. Codon usage bias analysis for octahydrolycopene synthase gene(PSY)from ten plant species[J].Acta Agric Bor-Occid Sin,2020,29(2):276-284]

[11]蔣守華,陳香華,李闖,賈波,李剛,劉滿霞,趙祥祥,秦進(jìn)華.不同植物CHI基因密碼子使用特性及其影響因素分析[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2020,41(1):76-84[Jang SH,Chen XH,Li C,Jia B, Li G,Liu MX, Zhao XX, Qin JH.Analysis of codon usage characteristics and its influence factors of chalcone isomerase(CHI)gene from different plants[J].J Yangzhou Univ(Agric Life Sci Ed),2020,41(1):76-84]

[12]吳憲明,吳松鋒,任大明,朱云平,賀福初.密碼子偏性的分析方法及相關(guān)研究進(jìn)展[J].遺傳,2007(4):420-426[Wu XM, Wu SF, Ren DM, Zhu YP, He FC. The analysis method and progress in the study of codon bias[J].Hereditas,2007(4):420-426]

[13]Quax TEF, Claassens NJ,Söll D, van der OJ. Codon bias as a means to fine-tune gene expression[J].Mol Cell,2015,59(2):149-161

[14]徐碩,徐文峰,鄺詠梅,金鵬飛.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定羅布麻葉中6個(gè)黃酮類成分的含量[J].藥物分析雜志,2019,39(7):1217-1228[Xu XN,Xu WF, Kuang YM, Jin PF.Determination of six flavanoids in Apocyni veneti folium by quantitative analysis of multi-components by single marker[J].Chin J Pharm Anal,2019,39(7):1217-1228]

[15]李茹玉,柴薇薇,郭曉農(nóng),王雪梅,韋良貞,韋興英,徐瑛.鹽處理對(duì)羅布麻(Apocynum venetum)幼苗滲透調(diào)節(jié)的影響[J].分子植物育種,2020,18(12):4105-4110[Li RY,Chai WW,Guo XN,Wang XM,Wei LZ,Wei XY,Xu Y.Effect of salt treatment on osmotic adjustment of Apocynum venetum seedlings[J].Mol Plant Breed,2020,18(12):4105-4110]

[16]郭曉農(nóng),柴薇薇,柏家林,馬忠仁.羅布麻黃酮醇合成酶基因克隆及其生物信息學(xué)分析[J].分子植物育種,2019,17(15):4978-4985[Guo XN,Chai WW, Bai JL,Ma ZR. Cloning and bioinformatics analysis of AvFLS gene from Apocynum venetum[J].Mol Plant Breed,2019,17(15):4978-4985]

[17]彭麗云,王云,孫雪麗,趙春麗,王曉,賴鐘雄,劉生財(cái).莧菜AmMYB2基因密碼子偏好性與進(jìn)化分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2019,25(3):679-686[Peng LY,Wang Y,Sun XL, Zhao CL,Wang X,Lai ZX, Liu SC.Codon bias and evolutionary analysis of the AmMYB2gene in Amaranthus tricolor L.[J].Chin J Appl Environ Biol,2019,25(3):679-686]

[18]趙耀,劉漢梅,顧勇,黃玉碧.玉米waxy基因密碼子偏好性分析[J].玉米科學(xué),2008(2):16-21[Zhao Y,Liu HM, Gu Y, Hang YB. Analysis of characteristic of codon usage in waxy gene of Zea mays[J].J Maize Sci,2008(2):16-21]

[19]Rice P,Longden I,Bleasby A.EMBOSS:the european molecular biology open software suite[J].Trends Genet,2000,16(6):276-277

[20]趙春麗,彭麗云,王曉,陳家蘭,王樂(lè),陳何,賴鐘雄,劉生財(cái).莧菜AtGAI基因密碼子偏好性與進(jìn)化分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2019,24(12):10-22[Zhao CL,Peng LY,Wang X,Chen JL,Wang L,Chen H,Lai ZX,Liu SC.Codon bias and evolution analysis of AtGAI in Amaranthus tricolor L.[J].J Chin Agric Univ,2019,24(12):10-22]

[21]Chen C,Chen H,Zhang Y,Thomas HR,Frank MH,He YH,XIA R.TBtools:an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J].Mol Plant,2020,13(8):1194-1202

[22]Kawabe A, Miyashita NT. Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species[J].Genes Genet Syst,2003,78(5):343-352

[23]Zhang WJ,Zhou J,Li ZF,Wang L,Gu X, Zhong Y.Comparative analysis of c odon usage pat ter ns among mitochondr ion,chloroplast and nuclear genes in Triticum aestivum L.[J].J Integr Plant Biol,2007,49(2):246-254

[24]王國(guó)超,喬軍,孟慶玲,劉昱成,楊海波,賀志昊,彭葉龍,謝堃,陳創(chuàng)夫.瘟病毒屬3種病毒多聚蛋白酶基因同義密碼子偏愛(ài)性分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,43(1):7-13[Wang GC,Qiao J,Meng QL,Liu LC,Yang HB, He ZH,Peng YL, Xie K,Chen CF. Analysis of synonymous codon preferences of poly protease genes in three viruses of flaviviridae pestivirus genus[J].J NW Sci-Tech Univ Agric For(Nat Sci Ed),2015,43(1):7-13]

[25]李平,白云鳳,馮瑞云,王原媛,張維鋒.籽粒莧蘋(píng)果酸酶(NAD-ME)基因密碼子偏好性分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2011,17(1):12-17[Li P,Bai YF,Feng RY,Wang YY,Zhang WF. Analysis of codon bias of NAD-ME gene in Amaranthus hypochondriacus[J].Chin J Appl Environ Biol,2011,17(1):12-17]

[26]Sharp PM,Li WH. An evolutionary perspective on synonymous codon usage in unicellular organisms[J].J Mol Evol,1986,24(1):28-38

[27]李蓉,謝析穎,王雪晶,蘇立遙,林玉玲,郭容芳,陳裕坤,賴鐘雄,徐涵.蘭科植物FNR基因的密碼子偏好性分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2018,39(6):1137-1145[Li R, Xie XY, Wang XJ, Su LY, Lin YL,Guo RF,Chen YK,Lai ZX,Xu H.Codon usage bias of ferredoxinNADP+oxidoreductase(FNR)in orchidaceae[J].Chin J Trop Crops,2018,39(6)1137-1145]

[28]王曉,趙春麗,彭麗云,賴鐘雄,劉生財(cái).莧菜藍(lán)光受體基因AmCRY1密碼子使用模式及分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2020,26(1):135-143[Wang X,Zhao CL,Peng LY,Lai ZX,Liu SC.Codon usage patterns and analysis of blue light receptor gene AmCRY1 in Amaranthus tricolor L.[J].Chin J Appl Environ Biol,2020,26(1):135-143]

[29]楊國(guó)鋒,蘇昆龍,趙怡然,宋智斌,孫娟.蒺藜苜蓿葉綠體密碼子偏好性分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2015, 24(12):171-179[Yang GF,Su KL, Zhao YR, Song ZB,Sun J.Analysis of codon usage in the chloroplast genome of Medicago truncatula[J].Acta Pratac Sin,2015,24(12):171-179]

[30]陳哲,胡福初,王祥和,范鴻雁,張治禮.菠蘿密碼子使用偏好性分析[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2017,34(8):946-955[Chen Z,Hu FC,Wang XH,Fan HY,Zhang ZL.Analysis of codon usage bias of Ananas comosus with genome sequencing data[J].J Fruit Sci,2017,34(8):946-955]

[31]Chakraborty S,Yengkhom S,Uddin A.Analysis of codon usage bias of chloroplast genes in Oryza species codon usage of chloroplast genes in Oryza species.2020,252(4):10.1007/s00425-020-03470-7

[32]Wright F.The effective number of codons used in a gene[J].Gene,1990,87(1):23-29

[33]Wang LJ,Roossonck MJ.Comparative analysis of expressed sequences reveals a conserved pattern of optimal codon usage in plants[J].Plant Mol Biol,2006, 61(4):699-710

[34]Liu QP,Dou SJ,Ji ZJ,Xue QZ.Synonymous codon usage and gene function are strongly related in Oryza sativa[J].BioSystems,2005,80(2):123-131

[35]賴瑞聯(lián),馮新,陳瑾,韋曉霞,陳義挺,吳如健.橄欖查爾酮異構(gòu)酶基因CHI的密碼子偏好模式[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2017,23(5):945-951[Lai RL,Feng X,Chen J,Wei XX,Chen YT,Wu RJ.Codon usage pattern of chalcone isomerase gene(CHI)in Canarium album(Lour.)Raeusch[J].Chin J Appl Environ Biol,2017,23(5):945-951]

[36]晁岳恩,吳政卿,楊會(huì)民,何寧,楊攀.11種植物psbA基因的密碼子偏好性及聚類分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2011,25(5):927-932[Chao YE,Wu ZQ,Yang HM,He N, Yang P.Cluster analysis and codon usage bias studies on psbA genes from 11 plant species[J]. Acta Agric Nucl Sin,2011,25(5):927-932]

[37]Gustafsson C, Minshull J, Govindarajan S, Ness JE, Villalobos A,Welch M.Engineering genes for predictable protein expression[J].Protein Expr Purif,2012,83(1):37-46

[38]Maertens B,Spriestersbach A, Von GU, Roth U, Kubicek J,Gerrits M, Graf M,Liss M, Daubert D,Wagner R, Schäfer F.Gene optimization mechanisms:a multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli[J].Protein Sci,2010,19(7):1312-1326

[39]Selma S,Bernabeorts JM,Vazquezvilar M, Diegomartin B,Ajenjo M,Garciacarpintero V, Granell A, Orzaez D. Strong gene activation in plants with genome-wide specificity using a new orthogonal CRISPR/Cas9-based programmable transcriptional activator[J].Plant Biotechnol J,2019,17:1703-1705

[40]劉曉,路靜,郝玉金,由春香.蘋(píng)果黃酮醇合成酶基因MdFLS1的克隆、生物信息學(xué)分析及催化活性鑒定[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2018,35(8):905-916[Liu X,Lu J,Hao YJ,You CX. Cloning, bioinformatics analysis and catalytic activity identification of MdFLS1 gene in apple[J].J Fruit Sci,2018,35(8):905-916]

[41]齊月英.小麥黃酮醇合成酶基因TaFLS2在植物抗旱和發(fā)育中的作用[D].青島:山東大學(xué),2016[Qi YY. The role of wheat flavonol synthase gene TaFLS2 in drought resistance and development[D].Qingdao:Shandong University,2016]

[42]李艷,李毅,陳章良.轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)源基因與外源基因共抑制問(wèn)題研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),1999(1):3-5[Li Y, Li Y, Chen ZL. Recent advances on cosuppression of transgenes and endogenous genes in transgenic plants[J]Chin J Biol,1999(1):3-5]

[43]范繼業(yè),張靜,李楠,韓繼紅.擬南芥AtCYP1基因亞細(xì)胞定位及生理功能分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2014,33(5):1065-1069[Fan JY,Zhang J,Li N,Han JH.Sub-cellular localization and physiological functional analysis of At-CYP1 in Arabidopsis thaliana[J].Genomics Appl Biol,2014,33(5):1065-1069]

[44]宋中邦,李文正,高玉龍,王丙武,師君麗,余玉珍,陳麗梅,李永平.煙草FLS基因表達(dá)抑制對(duì)類黃酮代謝的影響[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2016,35(12):3501-3506[Song ZB,Li WZ,Gao YL, Wang BW,Shi JL,Yu YZ, Chen LM, Li YP. Suppression of tobacco FLS genes’expression and its effect on flavonoid metabolism[J].Genomics Appl Biol,2016, 35(12):3501-3506]

 

文章摘自：蔡德育,郭曉農(nóng),朱月瀅,趙詩(shī)佳,朱玉雪,柏家林,馬忠仁.羅布麻AvFLS密碼子偏好性與進(jìn)化[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2022,28(02):423-431.DOI:10.19675/j.cnki.1006-687x.2020.11008.