摘 要：本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種利用紅麻子葉柄作為外植體的的紅麻組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明將紅麻種子經過消毒處后置于MS培養(yǎng)基上生長，12天后切下子葉柄，置于誘導生芽培養(yǎng)基中，待不定芽長大后切下置于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長出根系，再經煉苗與移栽得到得到再生苗。本發(fā)明所提供的方法在各品種間無基因型限制、培養(yǎng)周期短、再生植株生長正常，適合于各種紅麻品種的組織培養(yǎng)。
權利要求書
1.一種利用子葉柄作為外植體的紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：包括如下步驟：
(1)無菌苗的制備：對紅麻種子進行消毒滅菌處理，接種于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至萌發(fā)，得到紅麻無菌幼苗；
(2)愈傷組織與不定芽誘導：取步驟(1)中培養(yǎng)得到的無菌苗的子葉柄作為外植體，接種至誘導生芽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，期間定期更換培養(yǎng)基，獲得不定芽簇；
(3)芽伸長：將(2)獲得的不定芽簇從愈傷組織上剝離，接種至芽伸長培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，期間定期更換培養(yǎng)基，待不定芽長至一定高度時，分開不定芽簇，獲得單個伸長的不定芽苗；
(4)生根誘導：取(3)獲得的單個伸長的不定芽苗，接種至生根誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生根，獲得再生苗；
(5)煉苗與移栽：將(4)中獲得的再生苗進行煉苗，煉苗完成后，取出再生苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽于營養(yǎng)土中，放于溫室培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的紅麻的品種選自福紅952、贊引1號。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的高效紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所有操作均在無菌環(huán)境中進行。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的高效紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(1)中獲得無菌苗的方法為：選取飽滿、干凈的紅麻種子，先用體積分數(shù)75%酒精清洗3min，再用無菌水清洗3min，再用體積分數(shù)50%84消毒液清洗20min，最后用無菌水清洗4次，每次3min，消毒結束；將消毒后的紅麻種子接種于MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)至種子萌發(fā)，即獲得無菌苗；其中，所述的MS培養(yǎng)基的配方為：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，pH=5.8。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的高效紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(2)中獲得不定芽簇的方法為：取步驟(1)萌發(fā)12~14天的無菌苗，用無菌剪刀取下完整的子葉柄作為外植體，接種至誘導生芽培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25℃，16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)45天左右，期間每隔15天更換培養(yǎng)基，即獲得不定芽簇；其中，所述的誘導生芽培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的高效紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(3)中獲得單個伸長的不定芽苗的方法為：將步驟(2)中獲得的不定芽簇從愈傷組織上剝離，轉接至芽伸長培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)，期間每隔15天更換培養(yǎng)基，待不定芽長到3 5cm高時，分開不定芽簇，即獲得單個伸長的不定芽苗；其中，所述的芽伸長培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的高效紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(4)中獲得再生苗的方法為：將單個伸長的不定芽苗轉接至生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)至生5~6條須根，即獲得再生苗；其中，所述的生根培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的高效紅麻組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(5)煉苗與移栽的方法具體為：將培養(yǎng)步驟(4)中再生苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，于室溫、自然光照下放置3h，隨后往培養(yǎng)瓶中添加25 30ml自來水，繼續(xù)于室溫、自然光照下放置12h，煉苗結束；煉苗結束以后，將培養(yǎng)瓶中的再生苗取出，用自來水將再生苗基部附著的培養(yǎng)基洗凈，移栽到營養(yǎng)土中，放于溫室中在溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)，按常規(guī)肥水管理至長成成品苗，出圃；其中，所述的營養(yǎng)土在使用前需與自來水按照5:1的質量比混合使其完全潤濕。
9.如權利要求1所述的一種利用子葉柄作為外植體的紅麻組織培養(yǎng)方法在規(guī)?；嘤t麻中的應用。
技術領域
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種利用子葉柄作為外植體的紅麻組織培養(yǎng)方法。
背景技術
紅麻(Hibiscus)為錦葵科木槿屬一年生纖維作物，是繼棉花和黃麻之后的世界上第三大天然纖維作物，具有抗旱、耐鹽堿、適應性廣、生物量大等特性，在造紙、紡織、建筑材料、復合材料、水土保持、吸附劑、飼料等方面有良好的應用價值廣泛，在亞熱帶和熱帶地區(qū)種植。由于紅麻韌皮部纖維具有抑菌、透氣、吸濕性好和可降解等特點，被視為21世紀潛在的優(yōu)勢作物。常規(guī)遺傳育種方法雖然能改良紅麻品質、提高抗病性等重要農藝性狀，但周期較長，并且還要投入大量的人力與物力。借助植物轉基因技術向紅麻中導入控制有效性狀的外源基因或者對基因組進行定向靶向修飾，將會是紅麻分子育種的高效途徑之一。植物轉基因技術離不開高效穩(wěn)定的遺傳轉化體系，而制約紅麻遺傳轉化的關鍵因素是缺乏高效的離體再生體系。
目前較多主要農作物已建立穩(wěn)定高效的離體再生體系，而紅麻卻未見相關報道。大多數(shù)植物已報道的再生體系外植體為子葉、下胚軸和莖尖，與子葉相比子葉柄在再生過程中更不易白霜化；與下胚軸相比子葉柄是具有更強分裂能的細胞聚集區(qū)，其細胞更具轉化為胚性細胞的潛質；與莖尖相比子葉柄在遺傳轉化體系中更易獲得純合植株，而不是嵌合體。因此與子葉、下胚軸還有莖尖相比，子葉柄有更高的再生率、周期更短和能產生更多不定芽等優(yōu)點，能為再生體系的建立奠定基礎。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種以子葉柄為外植體的紅麻組織培養(yǎng)方法，通過產生不定芽簇，能夠在較短時間內獲得大量的再生苗，實現(xiàn)紅麻離體再生。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
一種利用子葉柄作為外植體的紅麻組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
(1)無菌苗的制備：對紅麻種子進行消毒滅菌處理，接種于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至萌發(fā)，得到紅麻無菌幼苗；
(2)愈傷組織與不定芽誘導：取步驟(1)中培養(yǎng)得到的無菌苗的子葉柄作為外植體，接種至誘導生芽培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，期間定期更換培養(yǎng)基，獲得不定芽簇；
(3)芽伸長：將(2)獲得的不定芽簇從愈傷組織上剝離，接種至芽伸長培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，期間定期更換培養(yǎng)基，待不定芽長至一定高度時，分開不定芽簇，獲得單個伸長的不定芽苗；
(4)生根誘導：取(3)獲得的單個伸長的不定芽苗，接種至生根誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生根，獲得再生苗；
(5)煉苗與移栽：將(4)中獲得的再生苗進行煉苗，煉苗完成后，取出再生苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽于營養(yǎng)土中，放于溫室培養(yǎng)。
進一步的，上述的紅麻的品種選自福紅952和贊引1號。
進一步的，上述的所有操作均在無菌環(huán)境中進行。
進一步的，上述的步驟(1)中獲得無菌苗的方法為：選取飽滿、干凈的紅麻種子，先用體積分數(shù)75%酒精清洗3min，再用無菌水清洗3min，再用體積分數(shù)50%84消毒液清洗20min，最后用無菌水清洗4次，每次3min，消毒結束；將消毒后的紅麻種子接種于MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)至種子萌發(fā)，即獲得無菌苗；其中，所述的MS培養(yǎng)基的配方為：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，pH=5.8。
進一步的，上述的步驟(2)中獲得不定芽簇的方法為：取步驟(1)萌發(fā)12~14天的無菌苗，用無菌剪刀取下子葉柄作為外植體，接種至誘導生芽培養(yǎng)基中在培養(yǎng)溫度25℃，16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)45天左右，期間每隔15天更換培養(yǎng)基，即獲得不定芽簇；其中，所述的誘導生芽培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
進一步的，上述的步驟(3)中獲得單個伸長的不定芽苗的方法為：將步驟(2)中獲得的不定芽簇從愈傷組織上剝離，轉接至芽伸長培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)，期間每隔15天更換培養(yǎng)基，待不定芽長到3 5cm高時，分開不定芽簇，即獲得單個伸長的不定芽苗；其中，所述的芽伸長培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
進一步的，上述的步驟(4)中獲得再生苗的方法為：將單個伸長的不定芽苗轉接至生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)至生5~6條須根，即獲得再生苗；其中，所述的生根培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。
進一步的，上述的步驟(5)煉苗與移栽的方法具體為：將培養(yǎng)步驟4）中再生苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，于室溫、自然光照下放置3h，隨后往培養(yǎng)瓶中添加25 30ml自來水，繼續(xù)于室溫、自然光照下放置12h，煉苗結束；煉苗結束以后，將培養(yǎng)瓶中的再生苗取出，用自來水將再生苗基部附著的培養(yǎng)基洗凈，移栽到營養(yǎng)土中，放于溫室中在溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)，按常規(guī)肥水管理至長成成品苗，出圃；其中，所述的營養(yǎng)土在使用前需與自來水按照5:1的質量比混合使其完全潤濕。
進一步的，上述一種利用子葉柄作為外植體的紅麻組織培養(yǎng)方法可應用于規(guī)?；嘤t麻。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：
本發(fā)明為國內首個紅麻離體再生方案。一是，本發(fā)明使用無菌苗子葉柄作為外植體是實現(xiàn)紅麻高效離體再生的核心之一；二是，本發(fā)明使用同一培養(yǎng)基對紅麻子葉柄進行愈傷組織誘導、不定芽分化以及不定芽伸長，得到的不定芽數(shù)量較多，最終生根率可達到90.3%；三是，本發(fā)明操作簡單，具有投入少，產出高的特點。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內容而非限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1
(1)無菌苗的制備：在無菌環(huán)境中，選取成熟飽滿的“福紅952”紅麻種子（圖1），先用體積分數(shù)75%酒精清洗3min，再用無菌水清洗3min，再用體積分數(shù)50%84消毒液清洗20min，最后用無菌水清洗4次，每次3min，完成消毒。將消毒滅菌后的種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)至種子萌發(fā)，獲得無菌苗；其中，所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其配置方法為：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，將培養(yǎng)基pH值調至5.8。
(2)愈傷組織與不定芽誘導：在無菌環(huán)境中，將(1)中萌發(fā)12 14天的無菌苗用無菌手術剪剪下完整的子葉柄（圖2），接種于不定芽誘導培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)45天左右，期間每隔15天繼代一次，獲得不定芽簇（圖3），統(tǒng)計得到不定芽誘導率（32.1%）；其中，所述的不定芽誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了濃度為0.1mg/L的噻苯隆(TDZ)和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸(2，4 D)，其中MS培養(yǎng)基配制方法為：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，將培養(yǎng)基pH值調至5.8
(3)不定芽伸長：在無菌環(huán)境中，將(2)中得到的不定芽簇用無菌手術剪從愈傷組織上剪下，轉接至不定芽伸長培養(yǎng)基中，每隔15d繼代一次，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)30天左右、不定芽長高至3 5cm（圖4）時，分開不定芽簇，即獲得單個伸長的不定芽苗；其中，所述的不定芽伸長培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了濃度為0.1mg/L的噻苯隆(TDZ)和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸(2，4 D)，其中MS培養(yǎng)基配制方法為：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，將培養(yǎng)基pH值調至5.8。
(4)生根誘導：在無菌環(huán)境中，將(3)獲得的單個伸長的不定芽苗轉接至不定芽誘導生根培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)至長出5 6條須根，即獲得再生苗（圖5）；其中，所述的生根誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，不添加任何激素，其配制方法為添加MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8。
(5)煉苗與移栽：將培養(yǎng)(4)中已經生根5 6條須根的生根苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，于室溫、自然光照下放置3h，隨后往培養(yǎng)瓶中添加25 30ml自來水（圖6），繼續(xù)于室溫、自然光照下放置12h，煉苗結束；煉苗結束以后，將培養(yǎng)瓶中的再生苗取出，用自來水將再生苗基部附著的培養(yǎng)基洗凈，移栽到營養(yǎng)土中（圖7），放于溫室中在溫度25℃、16h光照與8h黑暗交替處理、2000Lux條件下培養(yǎng)，按常規(guī)肥水管理至長成成品苗，出圃；其中，所述的營養(yǎng)土在使用前需與自來水按照5:1的質量比混合使其完全潤濕。
附圖說明
圖1 成熟飽滿的“福紅952”紅麻種子
圖2 無菌苗子葉柄
圖3 不定芽簇
圖4 伸長30天的不定芽
圖5 生根的再生苗
圖6 煉苗示意圖
圖7 移栽到營養(yǎng)土中的紅麻組培苗
摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：張立武，徐益，何青垚，陳思遠，祁建民，張列梅，
申請?zhí)枺?/font>202210216212.8，申請日：2022.03.07
