摘  要：采用DTT還原結(jié)合SephadexLH-20葡聚糖凝膠層析的方法分離測(cè)定了漢麻球蛋白3種酶解產(chǎn)物中巰基肽的含量，測(cè)定結(jié)果顯示：堿性蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶。采用LC-MS-MS檢測(cè)并鑒定出3種蛋白酶酶解物中巰基肽的分布和序列，結(jié)果顯示：堿性蛋白酶酶解物中巰基肽數(shù)量為41個(gè)，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中都是31個(gè)，來(lái)源均是Edestin2、Edestin3、清蛋白和非特征蛋白。3種酶酶解獲得的麻仁球蛋白（Edestin）巰基肽大部分為親水性的，分子質(zhì)量主要分布于1000～2000u，其中10個(gè)是3種酶解產(chǎn)物共有的，堿性蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中有4個(gè)相同的來(lái)源于Edestin3的麻仁球蛋白巰基肽。胃蛋白酶酶解得到了一個(gè)獨(dú)有的源于Edestin2的麻仁球蛋白巰基肽。堿性蛋白酶酶解得到了4個(gè)獨(dú)有的源于Edestin3的麻仁球蛋白巰基肽。研究結(jié)論：3種蛋白酶由于作用位點(diǎn)和效力不同得到的麻仁球蛋白巰基肽數(shù)量和分布均有不同，但是堿性蛋白酶酶解漢麻球蛋白可以獲得更多的麻仁球蛋白巰基肽，推測(cè)堿性蛋白酶可以更好地打開漢麻球蛋白中的二級(jí)及以上結(jié)構(gòu)，使二硫鍵更多的暴露出來(lái)。

關(guān)鍵詞：漢麻球蛋白；酶解；麻仁球蛋白；巰基肽；

 

漢麻(Cannabis Sativa L)是大麻科(Cannabaceae)大麻屬(Cannabis)的一年生草本植物，是我國(guó)麻類產(chǎn)業(yè)研發(fā)的主導(dǎo)作物，除其韌皮纖維可以作為紡織原料加以利用外，其種仁也是很好的食品原料^[1]。漢麻仁蛋白營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)合理，易被消化吸收，是運(yùn)動(dòng)員及術(shù)后患者首選的蛋白來(lái)源^[2,3]。已有的研究表明麻仁球蛋白是漢麻仁蛋白中的主要成分^[4]，占漢麻仁總蛋白的65%左右，具有優(yōu)異的氨基酸組成特性，但水溶性較差^[5]。為改善蛋白的加工特性和生理功能，酶水解是有效的常用手段，酶解可以更大地釋放蛋白質(zhì)序列中的生物活性肽段^[6]，使蛋白質(zhì)具有一定的生理調(diào)節(jié)作用^[7-9]，其中含有巰基的蛋白肽有著更高的利用價(jià)值^[10]。巰基又稱氫硫基，以硫醇（SH）形式存在，在堿性條件下以巰基的質(zhì)子化形式存在^[11]，具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，可以作為還原劑清除人體內(nèi)自由基、與體內(nèi)重金屬等有毒物質(zhì)反應(yīng)^[12.13]，從而促進(jìn)其代謝。目前研究最多的是從大豆蛋白中酶解獲得巰基肽，丁秀臻^[14]采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶對(duì)還原大豆11S酶解制備出了巰基肽，并驗(yàn)證其具有一定的重金屬離子結(jié)合能力，王金艷等^[15]采用不同蛋白酶酶解大豆11S蛋白制備巰基肽發(fā)現(xiàn)低溫與低pH對(duì)于巰基肽的制備具有重要意義。李瑞等^[16]酶解亞麻籽粕后采用Thiopropyl Crystarose6 Fast Flow凝膠成功富集制備了亞麻籽巰基肽。而本研究將以麻仁球蛋白為底物，研究了3種蛋白酶水解產(chǎn)物中巰基肽的分子質(zhì)量和親疏水性分布，為探究麻仁球蛋白的三維結(jié)構(gòu)和研究麻仁球蛋白中功能基團(tuán)的構(gòu)效關(guān)系提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

漢麻球蛋白、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二硫蘇糖醇（DTT）、BB-4724Ellman試劑盒、SephadexLH20葡聚糖凝膠、YM-A3508G瓊脂糖凝膠CL-6B；鹽酸，氫氧化鈉，三羧甲基氨基甲烷（Tris），氯化鈉，乙醇，三氯乙酸，丙酮，甘油，甲醛，SDS：分析純。

1.2儀器與設(shè)備

VFD-6000型真空冷凍干燥機(jī)，Epoch酶標(biāo)儀，UV759S型紫外-可見光分光光度計(jì)，QExactive質(zhì)譜儀，EASY-n1000型高效液相色譜儀。

1.3方法

1.3.1巰基肽的還原、分離與含量測(cè)定

漢麻球蛋白質(zhì)量濃度為50g/L，加入堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的質(zhì)量為漢麻球蛋白質(zhì)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別5%、2.4%、10%，酶解pH分別為8.0、5.5～6、1.0，水解溫度分別為50、70、37℃，磁力攪拌時(shí)間分別為6、2、3h。酶解結(jié)束后4000r/min離心半小時(shí)，取上清液凍干得到3種漢麻球蛋白酶解物。酶解物按50g/L溶解在含20mmol/LDTT的pH8.0的10mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，水浴鍋50℃還原30min，結(jié)束后使用2mol/L的HCl調(diào)至pH3.0，10000×g離心15min，過0.22um濾膜。采用SephadexLH-20（40cm×2cm）進(jìn)行凝膠層析，分離巰基肽與DTT，上樣量為10mL，流動(dòng)相為1mmol/L的HCl溶液。接收流動(dòng)相50mL后，使用1.5mL離心管接收分離產(chǎn)物，采用ELLMAN試劑盒進(jìn)行巰基含量的測(cè)定^[14]。

1.3.2 3種蛋白酶解物中巰基肽的分布及含量分析

3種蛋白酶解物進(jìn)行了LC-MS-MS質(zhì)譜鑒定。鑒定條件如下：

1.3.2.1色譜分離

液相所用的A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。

液相色譜柱(0.15mm×150mm，RP-C18)以95%的A液進(jìn)行平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Zorbax300SB-C18肽阱，再經(jīng)過液相色譜柱分離，相關(guān)液相梯度設(shè)置如下：

0～50min，B液線性梯度從4%到50%；

50～54min，B液線性梯度從50%到100%；

54～60min，B液維持在100%。

1.3.3.2質(zhì)譜鑒定

酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用QExactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時(shí)長(zhǎng)：60min。檢測(cè)方式：正離子。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(fullscan)后采集10個(gè)碎片圖譜(MS2scan)。

1.3.3.3數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜測(cè)試原始文件(RawFile)用軟件MaxQuant1.5.5.1檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到蛋白質(zhì)鑒定及定量分析結(jié)果，查庫(kù)所用相關(guān)參數(shù)和說明見表1。

表1 MaxQuant查庫(kù)所用參數(shù)

  

  

根據(jù)Gravy值（在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站上完成）來(lái)預(yù)測(cè)親疏水性，Gravy值的范圍在2與-2之間，正值表明此蛋白為疏水性蛋白，負(fù)值表明為親水蛋白^[18]。

2結(jié)果與分析

2.1漢麻球蛋白酶解物中巰基肽的分離與含量測(cè)定

多肽中含有巰基是多肽高抗氧化性的原因之一^[15]。由圖1可見，3種蛋白酶水解的漢麻球蛋白還原酶解物經(jīng)過SephadexLH-20葡聚糖凝膠層析都可以很好的分成兩個(gè)部分，其中第一個(gè)峰為漢麻球蛋白酶解物中的巰基肽，第二個(gè)峰為DTT，說明使用DTT還原后結(jié)合SephadexLH-20葡聚糖凝膠層析分離是測(cè)定漢麻球蛋白酶解物中游離巰基的有效方法。以堿性蛋白酶酶解的漢麻球蛋白為例，經(jīng)過還原之后，酶解物中的游離巰基從0.0048mmol/L提高到了1.907mmol/L，提高了397倍。采用同樣的方法，丁秀臻等^[19]測(cè)定的還原大豆球蛋白中的巰基含量約為1.4mmol/L。3種蛋白酶解物中巰基的含量分別為：堿性蛋白酶1.907mmol/L，木瓜蛋白酶0.791mmol/L，胃蛋白酶0.866mmol/L。還原的堿性蛋白酶漢麻球蛋白酶解物的中的巰基含量較其它兩種酶解產(chǎn)物中的高2倍還多，說明堿性蛋白酶可以更好地打開漢麻球蛋白中的二級(jí)及以上結(jié)構(gòu)，使二硫鍵更多的暴露出來(lái)。

  

圖1 3種蛋白酶酶解物中巰基肽的分離及含量

2.2 3種蛋白酶解物中巰基肽的分布及含量分析

分別采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)分級(jí)的漢麻球蛋白進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物進(jìn)行了LC-MS-MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在3種處理中，堿性蛋白酶酶解獲得的漢麻球蛋白巰基肽數(shù)量最多，為41個(gè)，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中巰基肽均為31個(gè)。

  

  

麻仁球蛋白（Edestin）分子是由酸性亞基和堿性亞基通過二硫鍵連接組成的六聚體，Svedberg等^[20]通過超速離心法測(cè)得漢麻籽蛋白分子質(zhì)量為300ku，其中酸性亞基分子質(zhì)量為33.0ku，堿性亞基分子質(zhì)量為20.0ku。通過對(duì)黑龍江省科學(xué)院大慶分院自主選育的漢麻品種——火麻一號(hào)種子蛋白進(jìn)行組學(xué)鑒定與定量分析后發(fā)現(xiàn)^[21]，麻仁球蛋白包括由ede1A、CsEde1A、CsEde1B、ede1C基因編輯的Edestin1，ede2B基因編輯的Edestin2，以及CsEde3A和CsEde3B基因編輯的Edestin3。對(duì)3種漢麻球蛋白酶解物的質(zhì)譜分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在Osborne分離過程中，漢麻仁球蛋白中包含了除了麻仁球蛋白以外的清蛋白及非特征蛋白。因此有必要對(duì)麻仁球蛋白中的巰基來(lái)源和含量分布進(jìn)行分析：其中堿性蛋白酶酶解獲得的麻仁球蛋白巰基數(shù)量是最多的，為18個(gè)。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解獲得的的漢麻球蛋白巰基肽雖然數(shù)量相同，但胃蛋白酶酶解獲得的麻仁球蛋白巰基肽數(shù)量更多一些。3種酶解物中巰基肽來(lái)源比較的結(jié)果說明，堿性蛋白酶對(duì)水解麻仁球蛋白獲得巰基肽的效力更高，其次是胃蛋白酶，最次是木瓜蛋白酶。

2.3 3種蛋白酶解物中麻仁球蛋白巰基肽的分子質(zhì)量和親疏水性分布

采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解得到的麻仁球蛋白巰基肽一共有18個(gè)，其中12個(gè)巰基肽的分子質(zhì)量分布于1000～2000u，5個(gè)巰基肽的分子質(zhì)量分布于2000～3000u，僅有1個(gè)大于3000u的巰基肽。肽的親疏水性與其氨基酸組成、比例及結(jié)構(gòu)相關(guān)，親疏水性的計(jì)算結(jié)果表明，采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解得到的麻仁球蛋白巰基肽有13個(gè)都是親水性的，僅有5個(gè)有疏水傾向，說明巰基結(jié)構(gòu)的存在可能對(duì)巰基肽的親水性有貢獻(xiàn)。

采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解得到的麻仁球蛋白巰基肽一共有10個(gè)，其中7個(gè)巰基肽的分子質(zhì)量分布于1000～2000u，2個(gè)巰基肽的分子質(zhì)量分布于2000～3000u，僅有1個(gè)大于3000u的巰基肽。親疏水性的計(jì)算結(jié)果與堿性蛋白酶的結(jié)果相似，采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解得到的麻仁球蛋白巰基肽8個(gè)都是親水性的，同樣可以說明巰基結(jié)構(gòu)的存在可能對(duì)巰基肽的親水性有貢獻(xiàn)。

采用胃蛋白酶進(jìn)行酶解得到的麻仁球蛋白巰基肽一共有15個(gè)，其中10個(gè)巰基肽的分子質(zhì)量分布于1000～2000u，4個(gè)巰基肽的分子質(zhì)量分布于2000～3000u，僅有1個(gè)大于3000u的巰基肽。親疏水性的計(jì)算結(jié)果與堿性蛋白酶的結(jié)果相似，有11個(gè)是親水性的。

  

圖2 不同蛋白酶解物中麻仁球蛋白巰基肽的分子質(zhì)量和親疏水性分布

2.4 不同蛋白酶酶解后獲得的麻仁球蛋白巰基肽比較分析

從圖2可見，3種蛋白酶酶解后獲得麻仁球蛋白巰基肽有相同的部分，也有不同的部分。但是大部分麻仁巰基肽均為親水性的肽，且分子質(zhì)量分布于1000～2500u。表3中列出了分別在3種酶解物中均檢出的10個(gè)麻仁球蛋白巰基肽，由表可見，3種酶獲得的麻仁球蛋白巰基肽相同的部分有4個(gè)均來(lái)源于Edestin2，6個(gè)來(lái)源于Edestin3，沒有來(lái)源于Edestin1的巰基肽。

表3 3種蛋白酶解物中相同的麻仁球蛋白巰基肽

  

表4是堿性蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中檢出的相同的麻仁球蛋白巰基肽（除3種酶解產(chǎn)物中相同巰基肽以外），共4個(gè)，均來(lái)源于Edestin3，由此推斷，在水解麻仁球蛋白Edestin3時(shí)，堿性蛋白酶與胃蛋白酶有相似的位點(diǎn)和效力。但是胃蛋白酶在水解麻仁球蛋白時(shí)得到了一個(gè)獨(dú)有的源于Edestin2的麻仁球蛋白巰基肽，其序列為LHCAGVETARHTIQRRGLL，分子質(zhì)量約為2131.472，這體現(xiàn)了胃蛋白酶特有的水解位點(diǎn)。

表4 堿性蛋白酶和胃蛋白酶解物中相同的麻仁球蛋白巰基肽

  

堿性蛋白酶中檢測(cè)到4個(gè)源于Edestin3的獨(dú)有的麻仁球蛋白巰基肽（表5），說明在酶解麻仁球蛋白獲得巰基肽時(shí)，堿性蛋白酶相較于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶有著更多的作用位點(diǎn)和效價(jià)。

表5 堿性蛋白酶酶解物中特有的麻仁球蛋白巰基肽

  

3結(jié)論

3種蛋白酶酶解物中的巰基肽含量測(cè)定結(jié)果顯示：堿性蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶，巰基肽主要來(lái)源于蛋白質(zhì)中含硫氨基酸為肽末端的分解，含硫氨基酸主要包括蛋氨酸和半胱氨酸^[22]，從課題組之前對(duì)漢麻蛋白分級(jí)產(chǎn)物的研究中可見漢麻球蛋白中蛋氨酸和半胱氨酸之和是大豆分離蛋白的4.5倍，推測(cè)這也是漢麻球蛋白測(cè)得巰基含量高于大豆球蛋白的原因之一，這意味著漢麻球蛋白在清除自由基、結(jié)合重金屬方面比大豆球蛋白有著更好的效果。LC-MS-MS鑒定結(jié)果顯示，堿性蛋白酶酶解的漢麻球蛋白巰基肽數(shù)量最多（41個(gè)，其中麻仁球蛋白巰基肽18個(gè)），木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物均為31個(gè)（其中麻仁球蛋白巰基肽分別為10個(gè)和15個(gè)），說明在酶解麻仁球蛋白獲得巰基肽時(shí)，堿性蛋白酶相較于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶有著更多的作用位點(diǎn)和效價(jià)。3種酶解產(chǎn)物中巰基肽的來(lái)源均是Edestin2、Edestin3、清蛋白和非特征蛋白，沒有來(lái)源于Edestin1的巰基肽，可能是由于Osborne分級(jí)時(shí)損失了Edestin1，也有可能是Edestin1酶解后含硫氨基酸位于N端或C端，從而未被檢出。部分來(lái)源于清蛋白和非特征蛋白的巰基肽被檢測(cè)出來(lái)，可能是源于Osborne分離時(shí)的殘留。3種酶酶解得到的大部分麻仁球蛋白巰基肽均為親水性肽，說明巰基結(jié)構(gòu)的存在可能對(duì)巰基肽的親水性有貢獻(xiàn)。3種酶酶解獲得的麻仁球蛋白巰基肽分子質(zhì)量主要分布于1000～2000u，僅有少量的巰基肽分子質(zhì)量分布于2000～3000u，有1個(gè)共有的巰基肽分子質(zhì)量大于3000u。

 

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文章摘自：石杰,魏連會(huì),張正海,宋淑敏,楊慶麗,董艷.漢麻球蛋白酶解產(chǎn)物中巰基肽的含量及分布研究[J/OL].中國(guó)糧油學(xué)報(bào):1-9[2022-06-29].