摘 要：為了解析HcPGK基因的功能，本研究以紅麻保持系花藥為材料，克隆HcPGK基因，利用生物信息學對基因序列進行理化性質(zhì)分析，并對該基因的表達模式進行檢測。結(jié)果表明，HcPGK基因最大開放閱讀框（ORF）為1203bp，編碼400個氨基酸。生物信息學結(jié)果表明，PGK蛋白屬于磷酸甘油激酶家族，其等電點為6.06，主要定位在葉綠體上；通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)紅麻和木槿的PGK蛋白序列在進化分支中關系密切。組織特異性表達結(jié)果表明，HcPGK基因在葉片中表達量最高，且顯著高于根和葉，而該基因在紅麻的根和莖中的表達量無顯著差異。自激活實驗分析表明，該基因不存在自激活現(xiàn)象，可用于酵母雙雜交實驗。本研究為解析HcPGK基因的功能提供一定的參考。
關鍵詞：紅麻；HcPGK基因；基因克隆；生物信息學分析
紅麻（Hibiscus cannabinus L.）是錦葵科木槿屬的一年生纖維作物，具有耐鹽、抗旱和耐重金屬等特性。紅麻的莖稈和韌皮部纖維主要用于制作紙制品、建筑材料、牲畜飼料、吸附劑以及生物質(zhì)能源等（Chen et al.，2019；Fan et al.，2019）。由于紅麻具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，全球的紅麻纖維需求量巨大且每年在持續(xù)增長（劉正初，2007；孫進昌等，2010）。種植紅麻不僅能充分利用劣地，在改善土壤和環(huán)境，減少水土流失，具有深遠的環(huán)保意義，而且能夠有效解決我國優(yōu)質(zhì)纖維原料的不足的問題（陳安國等，2011）。
磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase，PGK）是糖酵解途徑（EMP）中的限速酶，對于生物體代謝具有重要作用（郭楠，2014）。在高等植物中主要有兩類PGK，一種被定位于細胞溶質(zhì)（cPGK），另一種定位于質(zhì)體中（pPGK）。在糖酵解中，cPGK的主要功能是催化底物水平磷酸化產(chǎn)生ATP產(chǎn)生，而pPGK主要參與光合碳還原過程和葉綠體糖酵解過程（郭楠，2014）。無論是糖酵解糖異生還是光合作用（碳固定），磷酸甘油酸激酶催化的糖酵解反應都是將一個磷酸基從1，3-二磷酸甘油酸的?；姿徂D(zhuǎn)移到ADP上，從而形成ATP和3-磷酸甘油酸（3-PGA）（Matsubara et al.，2011）。糖酵解過程中ATP的產(chǎn)生需要已糖激酶和磷酸甘油酸激酶的催化，PGK作為所需的兩種酶之一，是一種典型的鉸鏈彎曲酶（Szabo et al.，2008），具有與己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）等代謝激酶類似的底物輔助結(jié)構(gòu)域閉合機（Massange-Sanchez et al.，2020）。每個區(qū)域均由一個中心β層組成，中間夾著兩個由一個靈活的螺旋鉸接在一起的α螺旋層，它們閉合以實現(xiàn)催化作用（Zerrad et al.，2011；Zheng et al.，2012）。
PGK基因在不同植物中已被廣泛研究，它們的功能差異很大。PGKc對維持擬南芥根內(nèi)細胞的pH穩(wěn)態(tài)至關重要（王曉國等，2021）。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了3個PGK基因，分別為At3g12780（AtPGK1）、At1g56190 （AtPGK2）、At1g79550（AtPGK3）（Massange et al.，2020）。AtPGK1僅在于光合組織的葉綠體中表達，AtPGK2在光合和非光合細胞的葉綠體/質(zhì)體中表達，AtPGK3在胞質(zhì)中表達。其中，高鹽度可顯著誘導AtPGK2，且AtPGK2的過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥增強了對鹽脅迫的耐受性（Liu et al.，2015），AtPGK2突變體中會出現(xiàn)程序化細胞死亡（programmed cell death，PCD）的表型，并且隨著植株的生長表現(xiàn)得越來越明顯，最終無法開花結(jié)果（黃小貞等，2017）。植物 PGK可能參與蔗糖和淀粉間碳分配的調(diào)節(jié)等過程，也可參與日葵胚胎發(fā)育階段的脂質(zhì)合成進而導致含油量增加（Adrian Troncoso-Ponce et al.，2009）。PGK轉(zhuǎn)基因油菜發(fā)育種子中含油量也顯著提高（Tan et al.，2011）。PGK基因還可以調(diào)節(jié)植物生理代謝（Rosa et al.，2018）。在紅麻中，目前只發(fā)現(xiàn)了一種PGK基因，其功能還未被研究過，有待深入研究。
本課題組前期對紅麻細胞質(zhì)雄性不育系P3A和及其保持系P3B的花藥進行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)HcPGK基因的相對表達量及其蛋白的乙?；揎椝皆赑3B中都顯著高于P3A（Chen et al.，2019），推測HcPGK基因能在紅麻細胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生過程中發(fā)生重要作用。為了解析HcPGK基因的功能，本研究克隆了紅麻HcPGK基因的，并對其進行生物信息學分析，檢測其在紅麻各組織的表達量，旨在為研究紅麻HcPGK基因的功能提供一定的參考。
1結(jié)果與分析
1.1紅麻HcPGK基因的克隆
提取紅麻保持系P3B花藥中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以此為模板，HcPGK-F和HcPGK-R為上下游引物，進行PCR擴增，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物（圖1）。測序結(jié)果顯示HcPGK基因大小為1203bp，與預測分子量大小一致。紅麻HcPGK基因號為Hc.13G000800.t1，最大開放閱讀框（ORF）編碼400個氨基酸（圖2），該蛋白的結(jié)構(gòu)域為最長ORF全長。
圖1 紅麻HcPGK基因擴增檢測
圖2 紅麻HcPGK基因的預測蛋白序列分析
1.2紅麻HcPGK基因的生物信息學分析
1.2.1紅麻HcPGK蛋白理化性質(zhì)分析及功能域預測
HcPGK蛋白含有400個氨基酸，預測相對分子量為42.35kDa，等電點為6.06。HcPGK蛋白的功能域預測結(jié)果如圖3所示，HcPGK蛋白屬于磷酸甘油激酶家族，其功能域預測結(jié)果如圖3所示。利用網(wǎng)站對HcPGK蛋白進行預測，預測結(jié)果顯示該蛋白定位在葉綠體上。
圖3 紅麻HcPGK蛋白功能域分析
1.2.2紅麻HcPGK高級蛋白結(jié)構(gòu)預測
利用sopma（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和expasys WISS模型（https://www.swissmodel.expasy.org/）預測了HcPGK蛋白質(zhì)的二級（圖4）和三級（圖5）結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，HcPGK蛋白多肽鏈中含有47.88%的α-螺旋，15.71%的延伸鏈，8.98%的β轉(zhuǎn)角，27.43%的無規(guī)則卷曲。由于α-螺旋占比比較多，有利于PGK蛋白穩(wěn)定發(fā)揮作用。
圖4 紅麻HcPGK蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析
紅麻HcPGK蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測如圖5所示，同源建模的模板來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的3-磷酸甘油酸激酶ADP復合物的3-磷酸甘油酸激酶，序列標識度為60.57%，置信度為0.85，因此，預測結(jié)果比較可信。
圖5 紅麻HcPGK蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析
1.2.3紅麻HcPGK氨基酸同源性分析及進化樹構(gòu)建
利用BlastP對HcPGK的氨基酸序列進行比較，篩選出同源性較高的序列（圖6）。經(jīng)過DNAMAN比對后，采用MEGA7.0軟件構(gòu)建進化樹。結(jié)果表明，紅麻和木槿的PGK蛋白序列在進化分支中關系密切（圖7）。
圖6 紅麻與其他植物的HcPGK氨基酸序列多重比對
圖7 不同植物中PGK的系統(tǒng)進化樹
1.3紅麻HcPGK基因基因組織特異性表達分析
對紅麻幼苗時期的根、莖、葉部位進行熒光定量PCR分析，結(jié)果表明，HcPGK在根和莖的的表達量幾乎一致，在葉中的表達量最高，顯著高于根和莖（圖8）。
圖8 紅麻各組織中HcPGK相對表達水平定量分析
注:不同小寫字母表示之間差異顯著（P<0.05）
1.4重組質(zhì)粒pGBKT7-HcPGK的自激活效應檢測
將重組質(zhì)粒pGBKT7-HcPGK、PGBKT7空載質(zhì)粒以及PGBKT7-53和PGADT7-T（陽性對照）轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受細胞點板后發(fā)現(xiàn)，它們均能在SD/-Trp板上生長，但是只有陽性對照PGBKT7-53和PGADT7-T能在SD/-Trp/+X-α-gal/+AbA平板上生長，且菌落為藍色，因此，重組質(zhì)粒pGBKT7-HcPGK不存在自激活效應（圖9）。后續(xù)可用酵母雙雜技術篩選與HcPGK蛋白互作的蛋白。
圖9 HcPGK的轉(zhuǎn)錄自激活檢測
注:1:PGBKT7；2:陽性對照PGBKT7-53和PGADT7-T；3:pGBKT7-HcPGK
2討論
PGK都包含有Phosphoglycerate kinase結(jié)構(gòu)域（郭楠，2014），本研究克隆了HcPGK基因，并通過生物信息學分析對其進行分析和預測。HcPGK基因cDNA全長為1203bp，編碼400個氨基酸，其編碼蛋白的分子量為42.35kD，等電點為6.06，屬于磷酸甘油激酶家族，與其他物種的PGK蛋白的氨基酸序列高度相似。
在高等植物中，PGK基因主要參與光合碳還原和葉綠體糖酵解過程（郭楠，2014）。在煙草、甘藍型油菜和擬南芥中，PGK基因在不同組織中存在差異表達（郭楠，2014；Huang et al.，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)HcPGK基因在根和莖中的表達量較低且無顯著差異，但是在葉中的表達量較高，說明HcPGK在紅麻中的表達也具有一定的組織特異性。此外，亞細胞定位預測HcPGK蛋白表達位置于葉綠體中，這與ZmPgk4蛋白在玉米中的定位位置一致（Massange et al.，2020），而PGK蛋白能催化ATP的產(chǎn)生，故推測這與HcPGK基因在葉綠體基質(zhì)中參與的光合碳循環(huán)的原因有關（郭楠，2014；Massange et al.，2020）。HcPGK基因不會發(fā)生轉(zhuǎn)錄自激活現(xiàn)象，因而在紅麻體內(nèi)只有特定條件下才能發(fā)揮作用，符合酶的特性。
蛋白質(zhì)乙酰化修飾是在乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生的一種可逆的蛋白翻譯后修飾，可以通過改變蛋白的理化性質(zhì)和構(gòu)象，從而調(diào)控蛋白的結(jié)合能力與功能（Choudhary et al.，2009；Kahn，1995）。本課題組前期發(fā)現(xiàn)花藥中HcPGK基因的相對表達量及其蛋白的乙?；揎椝皆诒３窒礟3B中都顯著高于不育系P3A，說明PGK蛋白乙?；揎椏赡苡绊懥思t麻雄性不育的發(fā)生。據(jù)報道甘藍型油菜中，BnPGK在保持系中花蕾的表達量顯著高于不育系，這可能與雄性不育系花蕾敗育有關（郭楠，2014）。因此推測在紅麻中蛋白乙?；揎棇ρ芯?/font>HcPGK基因的表達調(diào)控以及調(diào)控PGK酶活性導致細胞質(zhì)雄性不育的形成具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)HcPGK沒有自激活效應，為利用酵母雙雜技術等技術尋找與HcPGK相互作用蛋白并進行較為深入的分子實驗研究奠定了基礎。
本研究僅做了HcPGK基因在紅麻不育系P3B的根莖葉的特異性表達分析，為了研究蛋白乙酰化修飾是否對PGK蛋白功能產(chǎn)生影響以及是否與細胞質(zhì)雄性不育有關，下一步將收集紅麻不育系P3A和保持系p3B的敗育期花藥，并檢測HcPGK基因在這兩系中的表達情況，再對其進行不育機理的研究，這些后續(xù)的研究具有重要的意義。
3材料與方法
3.1材料
本試驗所用紅麻材料為紅麻保持系P3B，紅麻植株種植于廣西大學試驗田，種植期間進行常規(guī)的田間管理。
3.2紅麻總RNA提取與第一鏈cDNA的合成
使用RNA提取試劑盒（Vazyme，RC101）提取P3B的總RNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用NanoDrop ND-100（凱樂博（北京）科技發(fā)展有限公司）檢測RNA的濃度和純度。使用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R312-01）合成第一鏈cDNA，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/font>
3.3紅麻HcPGK基因的擴增
根據(jù)紅麻轉(zhuǎn)錄組的序列，利用Primer Premier5.0軟件設計擴增HcPGK全長的特異性引物（表1），以P3B花藥cDNA為模板，采用高保真Mix（Vazyme，P520）進行擴增，反應體系參照P520說明書，退火溫度為58度，擴增產(chǎn)物電泳后切膠回收。
3.4紅麻HcPGK基因的克隆載體構(gòu)建
將PCR膠回收產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體上，體系為5μL，25℃反應10min，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)14h，挑取單克隆在液體LB中擴繁，6h后進行PCR鑒定，使用引物為載體上的引物M13F/R（表1），將有目的條帶的菌液送往華大公司進行測序，使用DNAMA比對測序結(jié)果，將結(jié)果正確的菌液加50%甘油，于-20℃保存。
3.5紅麻HcPGK基因的生物信息學分析
把目的基因序列提交到NCBI網(wǎng)站進行基因結(jié)構(gòu)預測，進行DNAMAN軟序列比對，利用Mega7軟件鄰居連接（neighbor joining，NJ）構(gòu)建進化樹。利用ExPASY在線工具分析蛋白的分子量和等電點。利用在線網(wǎng)站對蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)、信號和親水性多肽進行分析。利用sopma網(wǎng)站和expasys WISS模型預測蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)結(jié)果。在http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/網(wǎng)站對HcPGK進行亞細胞定位預測。
3.6紅麻HcPGK基因不同組織表達模式分析
分別取紅麻幼苗時期的根、莖、葉，用試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)基因的全長ORF序列設計引物熒光定量PCR引物（表1），以紅麻Histone3為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCT 法（Li et al.，2021）計算目的基因的相對表達量。
3.7pGBKT7-HcPGK的構(gòu)建
根據(jù)HcPGK編碼序列設計帶有pGBKT7載體序列信息引物HcPGK- pGBKT7 （表1），以重組質(zhì)粒HcPGK-blunt載體為模板，PCR擴增得到含有pGBKT7載體同源臂的目的序列，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ單酶切pGBKT7空載體，膠回收目的序列和線性化載體，用同源重組法將其連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選單克隆，進行PCR鑒定，將有條帶的菌液送往華大公司測序，將測序正確的菌液擴繁，提質(zhì)粒，-20℃保存。
3.8重組質(zhì)粒pGBKT7-HcPGK自激活效應檢測
將重組質(zhì)粒pGBKT7-HcPGK、PGBKT7空載質(zhì)粒以及PGBKT7-53和PGADT7-T（陽性對照）轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受細胞。將轉(zhuǎn)化得到的單克隆酵母進行菌液PCR鑒定，將正確的菌液分別稀釋1、100、1000倍，取2μL點樣在SD/-Trp/+X-α-gal/+AbA平板上，30℃培養(yǎng)3~5d。
表1 實驗所用引物
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引物名稱 Primer name |
引物序列（5'-3'） Primer sequence（5'-3'） |
功能 Function |
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HcPGK-F |
ATGGCTACAAAGAAGAGCGTCG |
基因克隆 Gene clone |
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TGCGTCATCAAGAGCAAGGAC |
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PGK-qPCR-F |
TGTGGCAAATCCCAAGAAGC |
熒光定量 qPCR |
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PGK-qPCR-R |
GGCAGCAAGAGAGAGACCCCT |
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HcPGK- pGBKT7-F HcPGK- pGBKT7-R M13F M13R H3 （Histone3）-F H3 （Histone3）-R |
ATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCTACAAAGAAGAGCGTCG GTCGACGGATCCCCGGGAATTCTGCGTCATCAAGAGCAAGGAC GAGCGGATAACAATTTCACACAGG CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC GTGGAGTCAAGAAGCCTCACAG ATGGCTCTGGAAACGCAAA |
載體構(gòu)建 vector construction PCR檢測 PCR test 熒光定量 qPCR |
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