摘 要：黃麻黃脈病毒（Corchorus yellow vein virus，CoYVV）屬于菜豆金色花葉病毒屬病毒，含有DNA-A和DNA-B兩個組分。本研究利用同源重組法和酶切連接法分別對該病毒DNA-A和DNA-B進行了侵染性克隆的構建，利用農(nóng)桿菌介導的植物接種法將其接種于黃麻植株，可產(chǎn)生花葉、黃脈等典型癥狀，并且通過PCR和Southern blot均檢測到了病毒DNA組分。以上結果表明CoYVV侵染性克隆構建成功，也驗證了黃麻黃脈病的病原是CoYVV。CoYVV侵染性克隆的構建可為病毒致病機制的解析奠定基礎。
關鍵詞：黃麻黃脈病毒；侵染性克隆；菜豆金色花葉病毒；黃麻
菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）病毒是雙生病毒中分布最廣泛、種類分化最多和危害程度最大的一類病毒，給煙草、番茄、棉花等經(jīng)濟作物帶來重大經(jīng)濟損失[1，2，3，4，5，6]。根據(jù)病毒的基因組類型，雙生病毒可以分為單組分（僅DNA-A）和雙組分（含DNA-A和DNA-B）；根據(jù)病毒的進化關系，雙生病毒分為新世界病毒（New World virus）與舊世界病毒（Old World virus），新世界病毒主要為雙組分病毒，舊世界病毒主要為單組分病毒，常伴有衛(wèi)星分子，但也有少數(shù)是雙組分病毒[7，8]。其中，DNA-A的正義鏈上編碼2個開放閱讀框（open reading frame，ORF）（AV1和AV2），互補鏈上編碼4個ORF（AC1～AC4），DNA-B病毒鏈和互補鏈各編碼1個ORF（BV1和BC1）。在DNA-A和DNA-B非編碼區(qū)存在一個共同區(qū)（common region，CR）或基因間隔區(qū)（intergenic region，IR），該區(qū)域包含一個序列、位置和結構上高度保守的核苷酸序列（TAATATT/AC），含有病毒復制起始位點[7，8]。雙生病毒侵染性克隆的構建必須包括2個完整的IR區(qū)[9]。
黃麻（Corchorus capsularis），又稱為綠麻、火麻等，是椴樹科（Tiliaceae）黃麻屬（Corchorus）重要的纖維作物，種植量和用途的廣泛度僅次于棉花，在長江以南被廣泛栽培，為精準扶貧做出了重要的貢獻[10，11]。黃麻黃脈病毒（Corchorus yellow vein virus，CoYVV）最早于2006年在越南的黃麻上被發(fā)現(xiàn)[12]；本課題組于2015年在我國福建省福州地區(qū)的黃麻上鑒定到該病毒[13]。CoYVV屬于菜豆金色花葉病毒屬，可侵染黃麻并造成花葉、黃脈、植株矮化等癥狀，影響黃麻產(chǎn)量與品質，對我國黃麻產(chǎn)業(yè)具有潛在威脅。其基因組為雙組分，作為舊世界病毒，CoYVV還具有典型的新世界雙生病毒特征，即不編碼AV2蛋白。本研究擬構建CoYVV的侵染性克隆，驗證福州黃麻花葉病的病原，以期為CoYVV基因組功能及其致病機制的研究奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
感病黃麻的總DNA由本實驗室提取和保存，其中含有CoYVV DNA-A（NCBI登錄號：KX101212）和CoYVV DNA-B（NCBI登錄號：KX101213）。
pTOPO-BamHⅠ克隆載體、pBINPLUS雙元表達載體、GV3101農(nóng)桿菌菌株由本實驗室保存；大腸桿菌T1感受態(tài)購自北京全式金生物技術有限公司。
膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；質?？焖傩√嵩噭┖?、MarkerⅢ（MD103）購自天根生化科技（北京）有限公司；StarMarker D15k購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；Trans2k Plus DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。
1.2DNA-A侵染性克隆的構建
DNA-A侵染性克隆的構建采用同源重組法。以感病黃麻總DNA為模板，利用引物CoYVV-DNA-A-F1（5′-caggtcgactctagaggatccACCGTGCAGCAGCCCCGC-3′）/CoYVV-DNA-A-R1（5′-GGCTGCTGCACGGTAATATTATAGGCGTGCAGCAGCG-3′）、CoYVV-DNA-A-F2（5′-AATATTACCGTGCAGCAGCCCCGC-3′）/CoYVV-DNA-A-R2（5′-aattcgagctcggtacccgggTGACCTTCCCTGTATGAGCA-3′）（小寫字母代表與載體反向互補的同源臂序列）分別對DNA-A進行擴增，獲得長度為2.7kb左右的片段A和0.5kb左右的片段B。擴增體系：總DNA1μL，正向引物（10μmol·L-1）1μL，反向引物（10μmol·L-1）1μL，dNTP Mix0.5μL，2×Phanta Max Buffer12.5μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme）1μL，ddH2O 8μL。反應程序：95℃預變性3min，95℃變性15s，52℃退火15s，72℃延伸100s，35個循環(huán)，72℃終延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)1%（質量分數(shù)）瓊脂糖凝膠回收。利用FastDigest BamHⅠ和FastDigest SmaⅠ（以下所用內切酶均為FastDigest）對pBINPLUS載體進行雙酶切，酶切體系：質粒DNA1μg，BamHⅠ1μL，SmaⅠ1μL，10×FastDigest Green Buffer2μL，ddH2O補至20μL，37℃反應30min。載體酶切產(chǎn)物標記為pBINPLUS-SB，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠回收。
按照多片段無縫克隆試劑盒（MultiS One Step Cloning Kit）的說明書（Vazyme），將片段A和片段B以及酶切產(chǎn)物pBINPLUS-SB，按一定比例的摩爾數(shù)進行混合。反應體系：5×CE MultiS Buffer 4μL，Exnase® MultiS 2μL，片段A 54ng，片段B 10ng，酶切產(chǎn)物pBINPLUS-SB 240ng，ddH2O補至20μL，37℃反應30min。轉化大腸桿菌后，提取質粒，BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切驗證陽性克隆，標記為pBINPLUS-CoYVV-1.2A（圖1A）。利用電擊法將其轉入農(nóng)桿菌GV3101菌株。
1。3DNA-B侵染性克隆的構建
DNA-B侵染性克隆的構建采用傳統(tǒng)的酶切連接法。以感病黃麻總DNA為模板，根據(jù)φ29DNA聚合酶試劑盒（GE Healthcare）的說明書進行滾環(huán)擴增，擴增產(chǎn)物利用BamHⅠ酶切得到2.7kb左右的片段，將其連接于pTOPO-BamHⅠ載體，即為pTOPO-DNA-B。利用BamHⅠ和SmaⅠ對pTOPO-DNA-B進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收較小的2.6kb左右的片段C。將片段C連接至pBINPLUS-SB，連接體系：片段C 6μL，pBINPLUS-SB 2μL，T4 Ligase（Promega）1μL，10×T4 Ligase Buffer1μL，4℃反應過夜。轉化大腸桿菌后，提取質粒，利用BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切驗證陽性克隆，標記為pBINPLUS-DNA-B-SB。利用BamHⅠ對pBINPLUS-DNA-B-SB進行單酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收后，進行去磷酸化處理，去磷酸化體系：單酶切載體片段17.5μL，10×CIAP緩沖液2μL，CIAP （TaKaRa）0.5μL，37℃反應30min，過柱純化即可。
利用BamHⅠ對pTOPO-DNA-B進行單酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收較小的2.7kb左右的片段D。將片段D與上一步去磷酸化的載體連接，轉化大腸桿菌后，提取質粒，利用引物B-F570（5′-GACGAACCGTCACGTGCATCCACG-3′）/B-R570（5′-TGTCGACAGCAAAGCACTCTGTTG-3′）檢測插入片段及其方向，陽性克隆標記為pBINPLUS-CoYVV-2.0B（圖1B）。利用電擊法將其轉入農(nóng)桿菌GV3101菌株。
圖1CoYVV侵染性克隆構建示意圖
A.CoYVV DNA-A侵染性克隆構建；B.CoYVV DNA-B侵染性克隆構建。AC1～AC4、AV1、BC1、BV1:CoYVV開放閱讀框；IR:基因間隔區(qū)；LB、RB:載體左、右臂。
1.4農(nóng)桿菌接種及檢測
農(nóng)桿菌接種方法參考文獻[9]。使用醫(yī)用去除針頭的1mL一次性注射器，吸取等比例混合的DNA-A和DNA-B侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌液，接種于剛長出2～3片真葉的黃麻葉片，接種的黃麻置于防蟲溫室（16h光照/8h黑暗）中培養(yǎng)，同時設置未接種的空白對照，每隔3d觀察一次植株癥狀。接種30d后，采集黃麻葉片，采用CTAB法提取其總DNA，利用引物A-F534（5′-AGGATCTATCGGACCTATAGGTCC-3′）/A-R534（5′-AGGATTAGAGGCATGAGTACATGC-3′）和B-F673（5′-ACGAATATCGTCTGACTCATGACC-3′）B-R673（5′-TCCAGCATACTTGTGCTGAGTCTG-3′）分別對病毒兩個組分進行PCR檢測，擴增產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析；接種60d后，采集黃麻葉片約0.5g，提取其總DNA進行Southern blot檢測（Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ）。
2結果與分析
2.1侵染性克隆的構建
圖2CoYVV侵染性克隆載體鑒定
M.分子質量標準；A.CoYVV DNA-A侵染性克隆載體酶切分析；B.CoYVV DNA-B侵染性克隆載體PCR分析。
將同源重組獲得的重組載體pBINPLUS-CoYVV-1.2A進行雙酶切驗證，得到12kb左右的載體片段和3.3kb左右的片段（圖2A），表明DNA-A侵染性克隆載體構建成功。將傳統(tǒng)酶切連接獲得的重組載體pBINPLUS-CoYVV-2.0B進行特異性引物檢測，得到0.5kb左右的片段（圖2B），表明DNA-B侵染性克隆載體構建成功。
2.2農(nóng)桿菌接種結果
接種CoYVV侵染性克隆30d后，黃麻產(chǎn)生黃脈、花葉、斑駁、卷葉等癥狀（圖3）。PCR檢測結果顯示，接種黃麻植株均可見DNA-A和DNA-B的特異性條帶，而健康植株無任何條帶（圖4）；測序表明，該條帶確實是病毒基因組序列，說明所構建的侵染性克隆已成功侵染黃麻。Southern blot檢測結果顯示，接種黃麻植株可見病毒DNA-A組分的積累，而健康黃麻植株無任何特異性條帶（圖5），表明病毒已在黃麻體內大量復制。
圖3黃麻接種CoYVV侵染性克隆30d后的癥狀
CK.健康黃麻；DNA-A+DNA-B。接種病毒侵染性克隆的黃麻。
圖4黃麻接種CoY VV侵染性克隆30d后的PCR檢測
M．分子質量標準；1～3。DNA-A；4～6。DNA-B；CK．健康黃麻．
圖5黃麻接種CoY VV侵染性克隆60d后的Southern blot檢測
1．接種病毒的黃麻；CK．健康黃麻。
3討論
病毒侵染性克隆不僅是病毒病病原鑒定的基礎，也是病毒基因功能及其與寄主植物互作研究的重要前提[14，15]。目前，雙生病毒侵染性克隆的構建策略已經(jīng)成熟[16，17，18，19]。Ha et al[12]早在2006年即鑒定了CoYVV，雖然利用本氏煙（Nicotiana benthamiana）NT1細胞證明了CoYVV DNA-A AC1/AC2/AC3可以起始DNA-B的復制，但未能構建其侵染性克隆。本研究構建了CoYVV的侵染性克隆，將其接種于健康黃麻植株，能引起與田間發(fā)病類似的癥狀，并且從接種的植株上檢測到了CoYVV基因組組分，完成了科赫氏法則的驗證。本研究對接種黃麻植株進行Southern blot檢測時，DNA-A組分顯示病毒已積累，但是對DNA-B組分的多次檢測均未能得到較好的結果，推測可能的原因是雜交探針設計不夠特異，然而，PCR的結果可以證實DNA-B組分的存在。已知雙生病毒DNA-A與病毒的復制和介體傳播有關，很多雙組分雙生病毒DNA-A單獨存在可以系統(tǒng)侵染寄主，但不能誘導典型的病害癥狀；而DNA-B組分對于誘導典型的病害癥狀是必需的，并能增加DNA-A組分的積累量，且必須依賴DNA-A組分進行復制[9，16，20]。本研究中，DNA-A具有較高的積累量，且黃麻癥狀明顯，表明CoYVV侵染性克隆構建成功。
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文章摘自：林文忠，李景遠，彭詩山，韓星，翟盈盈，杜振國，張潔，吳祖建.黃麻黃脈病毒侵染性克隆的構建及應用[J].福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2022，51（03）:317-321.
