摘  要：擴展蛋白(Expansin)作為植物細胞壁的重要組成部分，通過調(diào)節(jié)細胞壁組分間松馳度和增強細胞胞壁組分間松馳度和增強細胞壁的柔韌性，對植物的生長發(fā)育和環(huán)境抗性等方面有著至關(guān)重要的作用。為了揭示和探討大麻擴展蛋白基因家族的組成和特征，本研究利用擴展蛋白共有的保守結(jié)構(gòu)域從大麻的全基因組中篩選出32個擴展蛋白基因組成大麻擴展蛋白基因家族，分布在大麻除第4條染色體以外剩下的9條染色體上。分析其結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明大麻擴展蛋白基因家族分為4個亞家族：包含19個基因的EXPA亞家族，含有7個基因的EXPB亞家族，包含5個基因的EXLB亞家族和只含有1個基因的EXLA亞家族。大麻擴展蛋白基因的氨基酸長度范圍為471-212，其等電點平均值為7.48，有信號肽帶領(lǐng)的兩個結(jié)構(gòu)域，大多為疏水蛋白，具有比較好的穩(wěn)定性。本研究通過分析大麻擴展蛋白基因的基本信息，為以后深入研究各植物擴展蛋白基因的生物學(xué)功能和進化特性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大麻；擴展蛋白基因家族；生物信息學(xué)分析；系統(tǒng)進化

 

擴展蛋白基因是位于植物細胞壁上與細胞膨大密切相關(guān)的非酶類蛋白，其功能在于使纖維素微纖維和半纖維素之間連接的氫鍵斷裂來調(diào)節(jié)細胞壁組分間松馳度以及增加細胞壁的柔韌性(Feng et al.,2019)。擴展蛋白廣泛存在于在植物細胞的生長，果實的成熟，果皮破裂，根毛的出現(xiàn)，花粉管進入柱頭和子房，分生組織的生長等植物的生長發(fā)育過程中。因此擴展蛋白在種子萌發(fā)(Yan et al.，2014)、耐鹽(Lu et al.，2013)、抗旱(Chen et al.，2016)、果實成熟(Jiang et al.，2019)和根伸長(Noh et al.，2013)等過程中都發(fā)揮了重要作用。

擴展蛋白家族是一個較原始且保守的大基因家族，據(jù)基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列分析，表明擴展蛋白基因均來源于一個共同的祖先，即目前的擴展蛋白家族一共可以分為4個亞家族：EXPA、EXPB、EXLA和EXLB亞家族。首次在黃瓜中被發(fā)現(xiàn)的命名為EXPA，EXPA亞家族多作用于植物的生長發(fā)育(Choi et al.，2003;Yu et al.，2011)。而在植物花粉中被發(fā)現(xiàn)的EXPB在首次發(fā)現(xiàn)是曾經(jīng)被認為是禾本科花粉過敏原，之后才被證明屬于擴展蛋白家族，這種擴展蛋白亞家族經(jīng)研究表明和生殖系統(tǒng)有著緊密的聯(lián)系(Russell et al.，2008;Tabuchi et al.，2011)。近幾年來，隨著基因組測序的深入和基因組分析的進步，有越來越多物種的擴展蛋白基因得以鑒定分析，如擬南芥(Sampedro et al.，2006)，紅皮柳(楊銳霞等，2021)，銀杏(王瑞雪等，2021)和水稻(施楊等，2014)等。因此擴展蛋白基因在不同物種基因家族中的序列組成、基因數(shù)量和結(jié)構(gòu)功能等方面都有很大的不同(李昊陽等，2014)。

大麻(Cannabis sativa L.)別名火麻，是一年生的大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(Cannabis L.)的植物(Kovalchuk et al.，2021)，因其同時具有很高的藥用價值和豐富的商業(yè)價值而聞名于世。大麻不僅有消炎鎮(zhèn)痛、抗失眠、緩解精神類癥狀和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病等一系列生理功能，還兼具有利尿、抗癌細胞、抗細菌真菌等藥用價值。但同時大麻也可能會引起焦慮、產(chǎn)生認知功能障礙和降低自身的免疫力，所以這類物質(zhì)在日常生活中被嚴格管制(楊柳秀等，2020)。而關(guān)于其擴展蛋白的研究仍然處于空白。因此，本研究以大麻的全基因組為基礎(chǔ)，篩選大麻的擴展蛋白基因，蛋白理化性質(zhì)、染色體分布、家族成員組成、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和不同物種間共線性關(guān)系等生物信息學(xué)分析，獲得得了大麻擴展蛋白基因家族的基本信息，為深入研究大麻的擴展蛋白基因的分子進化與生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1結(jié)果與分析

1.1大麻擴展蛋白基因家族的篩選鑒定及其理化分析

用擬南芥作為基因探針，在大麻基因組中得到32個相匹配的基因序列。利用TBtools v1.098689(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件從Supercann網(wǎng)站(https://gdb.supercann.net/index.php/download)的數(shù)據(jù)庫中對獲取的PF03330和PF01357結(jié)構(gòu)域?qū)λ械拇舐榈鞍仔蛄羞M行篩選，獲得32個大麻的擴展蛋白基因(表1)。其中21個基因都與利用擬南芥作為探針獲取的基因重復(fù)，因此以篩選后的基因作為目的基因進行下一步的分析。通過文獻可知擴展蛋白基因家族的保守結(jié)構(gòu)域在pfam中分別為DPBB_1(PF03330)和Pollen_allerg_1，且都和植物細胞的擴展有關(guān)，通過結(jié)合Pfam和smart分析其保守結(jié)構(gòu)域，找到其中同時含有PF03330和PF01357兩個保守結(jié)構(gòu)域的基因序列，所篩選出的32個基因就是大麻中的擴展蛋白基因。

由大麻擴展蛋白基因組序列的分析可得，大麻擴展蛋白基因共可分為EXPA、EXPB、EXLA和EXLB四個亞家族。19個大麻擴展蛋白組成A亞家族，B亞家族有7個成員，LA亞家族有1個大麻擴展蛋白，LB亞家族則由5個家族成員組成。大麻的擴展蛋白基因數(shù)量與擬南芥(36)、黃瓜(35)和西瓜(32)相近(Hao et al.，2015)。大麻擴展蛋白基因是黃瓜擴展蛋白基因的0.91倍、是水稻擴展基因的0.55倍、是大白菜擴展基因的0.6倍(表2)。

大麻的32個擴展蛋白基因的分子量從23.58 kD到53.3 kD不等，平均值為31.2 kD；等電點范圍從4.82到10.12不等，平均值為7.48；而其中蛋白最長的有471個，短的則有212個氨基酸殘基，平均值為285.49，跨度比較大。通過不穩(wěn)定指數(shù)確定大麻擴展蛋白為穩(wěn)定蛋白并預(yù)測其亞細胞定位信息，由結(jié)果可知這32個大麻擴展蛋白基因都定位于細胞外，這也與已知的擴展蛋白屬于細胞壁蛋白這一結(jié)論吻合。

表1 大麻擴展蛋白基因家族基本信息及特征

 

 

 

表2 不同植物的擴展蛋白及其 4 類亞家族數(shù)目分析

  

1.2大麻擴展蛋白重復(fù)基因分析及其染色體定位

確定了大麻基因組的10條染色體后，通過Supercann網(wǎng)站(https://gdb.supercann.net/index.php/download)數(shù)據(jù)庫獲得大麻基因注釋文件，利用大麻基因注釋文件通過TBtools v1.098689(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件中Gene Location Visualize工具進行染色體定位的繪圖(圖1)。結(jié)果表明，大麻的32個擴展蛋白基因分布在除了4號染色體以外的其余9條染色體上，同時可以看出大麻的擴展蛋白基因在染色體上的分布是非常分散且沒有規(guī)律的(圖1)，其中7號和8號染色體只包含1個擴展蛋白基因，6號和9號染色體都含2個擴展蛋白基因，3號和10號染色體都含3個擴展蛋白基因，1、2、5號染色體分別含4、6、10個基因。其中EXLA亞家族的唯一的基因位于1號染色體上，2號染色體上擴展蛋白最多且EXLB亞家族全部的5個擴展蛋白基因均在2號染色體上并形成了基因簇，這是由于同源基因在同一條染色體上擴增形成的。

在同一個物種中形成許多基因的主要方式有多倍化，片段復(fù)制，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，串聯(lián)重復(fù)四種方法。形成的這些基因之同的功能，但是都有相似的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，有相同的結(jié)構(gòu)域，通過未知基因和已知的基因之間的比對就可以推測未知基因的功能。

通過Tbtools軟件中One Step MCScanX-Super Fast對大麻擴展蛋白基因家族的片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)基因進行分析，并使用Tbtools軟件中Advanced Circos可視化大麻擴展蛋白基因家族中的重復(fù)基因(圖2)。在大麻的32條染色體中有重復(fù)的序列，分別為：第6條染色體上的基因簇中的EXPA12和第9條染色體上的EXPA16，第2條染色體上的EXPA4和第6條染色體上的EXPA13以及第9條染色體上的EXPA15形成了重復(fù)基因間的相互關(guān)系是旁系同源基因，在同一個物種中有相同的祖先基因進化而來或許會展現(xiàn)不同的功能，但是都有相似的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，有相同的結(jié)構(gòu)域，通過未知基因和已知的基因之間的比對就可以推測未知基因的功能。

  

圖1 大麻32個擴展蛋白基因在9條染色體的分布

 

  

圖2 大麻32個擴展蛋白的共線性分析

1.3基因家族的motif分析及其結(jié)構(gòu)分析

通過大麻擴展蛋白的基因結(jié)構(gòu)(圖3)，可以看到大麻擴展基因家族中除了一個基因無內(nèi)含子外，其余成員均含有外顯子和內(nèi)含子，但成員之間仍然有明顯差異，這體現(xiàn)在外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量和位置不同上。基因家族成員中所具有的內(nèi)含子相對較少，其中最多的含有4個內(nèi)含子，最少的為0。基因家族中只有1個成員不含內(nèi)含子，約占整個家族的3%，有2個基因只含有1個內(nèi)含子，約占整個家族的6%，有18個基因含有2個內(nèi)含子，約占整個家族的56%，有8個基因含有3個內(nèi)含子，占整個家族的25%，剩下的3個基因含有4個內(nèi)含子，占整個家族的9%。同時也表明了大麻擴展蛋白基因家族成員具有的基因亞家族特異性顯而易見。每個亞家族的平均內(nèi)含子個數(shù)為EXPA亞族2.1個，EXPB亞族2.57個，EXPLA亞族4個和EXPLB亞族2.6個。

使用Tbtools軟件中Simple MEME Wrapper對篩選的32個大麻擴展蛋白家族成員進行分析，并通過Tbtools軟件中Gene Structure View生成motif保守分析圖(圖3)，通過在線網(wǎng)站MEME分析得到大麻擴展蛋白基因家族得3個保守基序(圖4)。

結(jié)果可得，在大麻的擴展蛋白基因中一共找到了3個預(yù)測的motif，基因家族中的每個成員中分別含有2-3個的motif。大麻擴展蛋白基因家族中的不同基因都有不同的motif，這也說明了擴展蛋白基因家族中基因的多樣性。但在所有的大麻擴展蛋白基因都有幾個相同的motif以及夾雜著特有的motif結(jié)構(gòu)域。PF03330和結(jié)構(gòu)域PF01357包含motif1和motif2。所以大麻擴展蛋白基因的四個亞家族都含有motif1和motif2，而屬于EXPA亞家族的21個成員除了都含有motif1和motif2，還含有該家族所特有的motif3，這是其他三個家族所沒有的。其中共有的motif1、2在不同的大麻擴展蛋白基因中都定位到基本相同的位置，因此可以推測得出共同的motif1、2就是大麻擴展蛋白基因的功能基礎(chǔ)。

  

圖3 大麻擴展蛋白家族進化樹，保守基序，保守結(jié)構(gòu)域，啟動子順式作用元件及基因結(jié)構(gòu)

注：順式元件分布從上到下依次為參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件，參與光響應(yīng)的順式作用元件，響應(yīng)脫落酸的順式作用元件，響應(yīng)茉莉酸甲酯的順式作用元件，參與低溫反應(yīng)的順式作用元件，厭氧誘導(dǎo)的順式作用元件，參與晝夜節(jié)律調(diào)控順式作用元件，參與赤霉素反應(yīng)的順式作用元件，參與生長素反應(yīng)順式作用元件，最大激發(fā)子介導(dǎo)的激活的順式作用元件，種子特異性調(diào)控中的順式作用元件，參與水楊酸反應(yīng)性順式作用元件，MYB干旱誘導(dǎo)性順式作用元件，MYB結(jié)合位點順式元件，玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控中的順式作用元件

 圖4 MEME預(yù)測的3個motifsLOGO

1.4基因家族的進化特性

通過軟件MEGA v7.0對得到的大麻和擬南芥的擴展蛋白基因進行序列比對構(gòu)建N-J進化樹(圖5)，分析擴展蛋白家族成員間的進化關(guān)系，并通過擬南芥擴展蛋白基因的各亞家族和大麻擴展基因在染色體上的位置對其進行命名。由進化樹分析，擴展蛋白基因家族的32個成員被分為四個亞家族：EXPA，EXPB，EXLA和EXLB。其中EXPA亞家族的占比最高，在32個擴展蛋白基因中共有19個，占比約60%。而EXLA亞家族基因占比最小，只有1個亞家族成員基因。大麻擴展蛋白中相應(yīng)的亞家族基因占比率同其他作物的擴展蛋白中基因亞家族的占比率是相似的。

同時為了分析擴展蛋白基因家族在不同物種間的進化關(guān)系，利用擬南芥和大麻的同源關(guān)系，將得到的大麻基和擬南芥的擴展蛋白基因組之間的進行共線性關(guān)系(圖6)，共有12條亮線，代表有12個擴展蛋白基因的同源基因?qū)?，這一結(jié)果表明在單子葉與雙子葉植物分化之前基因家族的基本特征就已經(jīng)形成了。還可以看出成樹之后相同的基因家族聚合到了一起而并非是同種作物之間的基因由于相似較高而聚合到一起，這一結(jié)果表明直系同源基因的相似程度要比旁系同源基因的相似性高。

  

圖5 大麻和擬南芥擴展蛋白基因系統(tǒng)發(fā)育樹

 

  

圖6 擬南芥和大麻的共線性關(guān)系

1.5基因家族的順式元件分析

取大麻擴展蛋白基因序列上游2kb的序列，預(yù)測大麻擴展蛋白基因家族成員的順式作用元件(圖3)。由光響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、脫落酸響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、響應(yīng)茉莉酸甲酯的順式作用元件等主要順式元件組成。其中大麻擴展蛋白家族成員中都存在著光響應(yīng)元件，它的元件數(shù)量也是所有家族成員中元件數(shù)量最多的，共有460個。其次是預(yù)測到的厭氧誘導(dǎo)的順式作用元件，數(shù)量為72個，響應(yīng)茉莉酸甲酯的順式作用元件有48個，響應(yīng)脫赤霉素的順式作用元件12個。含量最少的是最大激發(fā)子介導(dǎo)的激活的順式作用元件，只有2個。而種子特異性調(diào)控中的順式作用元件也含有4個，分別存在于EXPA15、EXPA13、EXPA11和EXPB2的啟動子區(qū)。

2討論

本研究從大麻的全基因組中篩選出了32個基因組成大麻擴展蛋白基因家族，其基因家族成員分布于9條染色體上，通過亞細胞定位分析表明均定位于細胞壁上，與擬南芥等作物的擴展蛋白基因定位結(jié)果十分相符。大麻擴展蛋白作為植物細胞壁中十分重要組成部分且廣泛存在于各細胞器官中，參與植物生長發(fā)育等多個生理過程(郝西等，2015)。擴展蛋白在水稻(Shin et al.，2005)、玉米(Zhang et al.，2014)、大白菜(Krishnamurthy et al.，2015)、陸地棉(張奇艷等，2019)、黃瓜(郝西等，2015)等作物中分別存在34、36、39、46、35個家族成員，可以看出不同物種中的擴展蛋白的數(shù)量有比較大的差別。由擬南芥擴展蛋白基因家族成員系統(tǒng)進化分成的EXPA、EXPB、EXLA和EXLB四個亞家族中，只有EXPB4、EXPB6、EXPLB1和EXPLB2等電點小于7，說明這四個基因可能帶有編碼堿性蛋白質(zhì)。擴展蛋白家族中各亞家族的占比也被發(fā)現(xiàn)存在著明顯不同。例如，EXPB亞家族的成員比例在被子植物和裸子植物中差距過大，在大白菜的玉米等被子植物中分別達到16.98%和54.55%，而屬于裸子植物的銀杏在EXPB亞家族的占比只有3.57%(王瑞雪等，2021)。

通過基因結(jié)構(gòu)域分析大麻擴展蛋白基因家族的32個家族成員都包含PEBP結(jié)構(gòu)域，只有一個家族成員不含內(nèi)含子，其余的家族成員均含有一個或多個內(nèi)含子。而在黃瓜、銀杏和紅皮柳的擴展蛋白中只有黃瓜擴展蛋白基因家族中有一個基因家族成員不含內(nèi)含子。再次說明大麻擴展家族基因分布廣泛，植物中有內(nèi)含子的擴展蛋白基因占比非常高。同時也在基因家族中發(fā)現(xiàn)了許多會參與到光響應(yīng)的順式作用元件、種子特異性調(diào)控中的順式作用元件、根特異性順式作用調(diào)控元件和玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控中的順式作用元件等，表明該基因家族廣泛的影響著大麻的生長發(fā)育過程，并在大麻的種子萌發(fā)和根和莖的發(fā)育等方面有著十分重要的調(diào)控作用(Zimmermann et al.，2010)；而赤霉素、水楊酸、響應(yīng)茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)類順式作用元件的發(fā)現(xiàn)，可推測出大麻擴展蛋白基因會受到各種激素信號分子的誘導(dǎo)(Wang et al.，2009)。

本次研究通過對篩選出的32個大麻擴展蛋白基因進行分類并命名，且對大麻擴展蛋白基因家族開展基因家族的理化性質(zhì)、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化、物種內(nèi)及物種間共線性分析和順式作用元件分析等生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果對大麻擴展基因家族成員的鑒定和深入解析具有深遠的意義。

3材料與方法

3.1大麻擴展蛋白基因家族成員的篩選

從TAIR網(wǎng)站得到擬南芥擴展蛋白家族的基因序列和蛋白序列，將其作為基因探針(Goodstein et al.,2012)。從Supercann網(wǎng)站(https://gdb.supercann.net/index.php/download)獲得大麻的擴展蛋白家族的全基因組和基因注釋文件。利用TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件(Chen et al.，2018)，在已經(jīng)得到的大麻蛋白數(shù)據(jù)庫中利用結(jié)構(gòu)域模型PF01357和PF03330進行搜索，得到同時包含兩個結(jié)構(gòu)域模型的蛋白序列，篩掉相似度比較小的和只含有一個結(jié)構(gòu)域的序列，將兩種方法進行比對重合得到候選序列(郝西等，2015)。

將得到的大麻擴展蛋白基因上傳至網(wǎng)站Pfam隱馬爾可夫模型進行保守的結(jié)構(gòu)域的驗證，排除不包含DPBB_1和Pollen_allerg_1的結(jié)構(gòu)域以及重復(fù)序列，最終確定大麻擴展蛋白基因家族成員和每個家族成員的基因序列(施楊等，2014)。

3.2基因家族蛋白性質(zhì)分析及亞細胞定位

通過網(wǎng)站Prot Paramtool分析大麻擴展蛋白基因家族每個成員的物理與化學(xué)參數(shù)；并用網(wǎng)站Euk-mPLoc2.0來預(yù)測每個大麻擴展蛋白基因家族成員的亞細胞定位信息。

3.3家族基因的進化分析

使用軟件Clustal X2對大麻和擬南芥的所有擴展蛋白基因進行多序列對比分析，通過亞家族和染色體位置為標準對大麻擴展蛋白基因家族的32名成員進行命名，使用MEGA7.0程序中的鄰接法構(gòu)建Neighbor-joiningTree表征大麻與擬南芥的擴展蛋白基因家族系統(tǒng)進化樹(Gascuel and Steel，2006;沙偉等，2011)，通過進化樹看到不同基因間的遠近關(guān)系(Lozano et al.，2015)。

3.4大麻和擬南芥擴展蛋白基因家族共線性分析

從Supercann網(wǎng)站獲得大麻的全基因組及注釋文件，從NCBI網(wǎng)站獲得擬南芥的全基因組序列及注釋文件。TBtools對兩者進行可視化的共線性關(guān)系分析，以此發(fā)現(xiàn)擬南芥和大麻擴展蛋白基因家族間的同源基因?qū)Α?/span>

3.5基因家族染色體定位及重復(fù)基因分析

大麻擴展蛋白基因染色體定位分析使用TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件中Gene Location Visualize工具進行繪圖，從而更直觀地看到擴展蛋白基因在染色體上的分布(李昊陽等，2014)。

基因定位之后通過Tbtools軟件中One Step MCScanX-Super Fast對大麻擴展蛋白基因家族的片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)基因進行分析。用Tbtools軟件中Advanced Circos作圖可視化大麻擴展蛋白基因家族中的重復(fù)基因，以此分析進化過程中擴展蛋白基因的復(fù)制，要求重復(fù)基因的相似度高于75%。

3.6基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域的motif分析和保守motif預(yù)測

大麻擴展蛋白的保守motif預(yù)測通過Tbtools軟件中Simple MEME Wrapper分析完成，其中最大模體數(shù)設(shè)置為10，其他參數(shù)默認。通過在線網(wǎng)站MEME得到大麻擴展蛋白基因家族得3個保守基序。

3.7基因家族的結(jié)構(gòu)分析

大麻擴展蛋白基因結(jié)構(gòu)分析使用TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件中的Gene Structure View工具繪圖得到大麻擴展蛋白家族中族內(nèi)進化樹＋Motifs＋結(jié)構(gòu)域＋啟動子順勢作用元件(上游2kb序列)＋基因結(jié)構(gòu)的多圖合一大圖。

 

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文章摘自：梁子曉，祁宏英，徐洪國．大麻擴展蛋白基因家族的鑒定與生物信息學(xué)分析[J/OL]．分子植物育種