摘 要：鈣調(diào)素是一類鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白，參與植物的生長發(fā)育、抗逆脅迫等多種生物學過程。本課題組前期通過蛋白質(zhì)乙?；揎椊M學研究發(fā)現(xiàn)，紅麻鈣調(diào)素蛋白7的乙?；揎梾⑴c了紅麻花粉的發(fā)育調(diào)控。為研究其參與抗逆性的機制，本研究以紅麻保持系P3B雙核期的花藥為材料，使用PCR法克隆了鈣調(diào)素基因HcCaM7，最大開放閱讀框(openreadingframe，ORF)為450bp，其由149個氨基酸組成，編碼相對分子質(zhì)量16.85kD的蛋白；亞細胞定位結果顯示，HcCaM7蛋白的表達主要定位在細胞質(zhì)和細胞膜中；利用病毒誘導的基因沉默技術沉默HcCaM7基因，導致紅麻沉默植株的生長受到抑制；進一步在體外采用基因密碼子擴展技術對發(fā)生乙酰化修飾氨基酸位點進行突變，成功獲得具有體外乙?；揎椢稽c的蛋白HcCaM7mut，并成功誘導表達了無乙?；揎椀牡鞍譎cCaM7，結果表明HcCaM7蛋白發(fā)生乙酰化修飾后可以顯著促進NADK(NAD激酶)活性；用點板法檢測含有HcCaM7蛋白和HcCaM7mut蛋白的重組菌在鹽(400mmolL-1和500mmolL-1NaCl)、干旱(400mmolL-1和600mmolL-1甘露醇)、重金屬(30mmolL-1和50μmolL-1CdCl2)及低溫脅迫后(利用液氮反復凍融模擬)在LB固體培養(yǎng)基上的存活率發(fā)現(xiàn)，含有HcCaM7蛋白的重組菌存活率顯著高于空載對照菌，而含有乙?；揎椀腍cCaM7mut蛋白的重組菌存活率進一步提升，表明HcCaM7蛋白能夠提高大腸桿菌對非生物脅迫的耐受性，并且乙酰化修飾后效果更佳。因此，HcCaM7基因可以調(diào)控紅麻生長發(fā)育和響應非生物脅迫，乙?；揎椏梢源龠MHcCaM7蛋白發(fā)揮作用。
關鍵詞：紅麻；鈣調(diào)素蛋白7；蛋白乙酰化修飾；病毒誘導的基因沉默；基因密碼子擴展技術；非生物脅迫
紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維作物，以采收莖稈和韌皮部纖維為主要栽培目的，主要用途包括紙制品、建筑材料、吸附劑、牲畜飼料、汽車內(nèi)飾以及生物質(zhì)能源等[1,2]。紅麻具有耐鹽、耐旱和耐重金屬等特性，因此被視為環(huán)境治理應用方面的潛力作物[3,4]。
鈣調(diào)素(CaM)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)且自身沒有酶活性的鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白[5,6]，屬三大鈣感受器蛋白(CaM/CML,CDPK和CBL蛋白)之一[5,6,7]。鈣調(diào)素經(jīng)過Ca2+激活與其靶蛋白結合，將鈣信號向下游傳遞，并與下游響應因子結合，從而調(diào)控植物細胞分裂、生長發(fā)育、抗逆等生物學過程[8,9]。植物中，已有較多有關CaM蛋白對增強植物抗逆性的研究報道：在擬南芥中，過表達AtCaM1或AtCaM4基因都能夠顯著提高擬南芥的抗鹽能力[10]，過表達AtCaM3基因能夠顯著提高擬南芥抗高溫能力[11]，過表達AtCaM2基因能夠顯著提高擬南芥的抗冷脅迫能力[12]，過表達GmCaM4基因增強擬南芥鹽脅迫耐受性[13]，OsCaM1-1在擬南芥中異位超表達能顯著提高擬南芥的耐熱性[14]；在水稻中，OsCaM1-1蛋白能夠提高水稻的耐鹽能力和促進側根的生長[15]；在煙草中，異源超表達一種南極抗凍魚(Antarctic notothenioid fish)的CaM基因，能夠增強其耐冷能力[16,17]。相關試驗研究果表明，CaM蛋白在植物抗逆方面的作用十分豐富，甚至一種蛋白具有多種抗逆境作用，但是在紅麻中，有關CaM7功能的報道甚少，研究其功能對于紅麻抗逆研究具有重要意義。
蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)在很大程度上決定了蛋白質(zhì)的活性、功能發(fā)揮、細胞定位、穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)之間的相互作用等生物學功能，對蛋白質(zhì)功能起著精細的調(diào)節(jié)作用[18]。細胞內(nèi)存在多種蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控方式，如泛素化、磷酸化、乙?；?，它們都對細胞蛋白質(zhì)發(fā)揮正常的生物學功能有著至關重要的作用[19]。近年來，賴氨酸乙酰化作為一種動態(tài)可逆的翻譯后修飾，引起了廣泛的關注，它主要包括組蛋白乙?；头墙M蛋白乙?；?/font>[20,21,22]。在植物中，乙?；揎椩诳鼓嫘宰饔眠^程中扮演重要角色，蛋白質(zhì)去乙酰化可調(diào)控生物逆境與非生物逆境相關基因的表達來適應環(huán)境，如AtHDA19是最早被研究并被證明和植物抗逆相關的去乙?；富?/span>[23]，轉基因擬南芥植物中，AtHD2C基因的過表達顯著增強了擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性[24]。有研究表明，組蛋白的乙?；揎椏梢哉{(diào)控茉莉酸的合成和信號途徑，從而提高多種植物的抗旱能力[25]。當水稻去乙酰化酶基因HDT702缺失以后，水稻的抗脅迫能力增強[26]；當番茄受到鹽脅迫以后，SlHDA1、SlHDA3、SlHDA9和SlSRT1表達上調(diào)，SlHDA4和SlHDT1表達下調(diào)[27]，從而增強了番茄的耐鹽能力。HcCaM7蛋白在P3A中的乙酰化水平顯著低于P3B，因此推測CaM7蛋白及其乙酰化修飾參與調(diào)控紅麻細胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生以及紅麻非生物脅迫抗性[1]。
近幾年來，非天然氨基酸(unnatural amino acid，ncAAs)的基因編碼技術成為了研究蛋白質(zhì)功能的有效手段，基因密碼子擴展技術(genetic code expansion strategy)的原理是使用一對正交的氨基酰基-tRNA合成酶(aaRS)和tRNA來指導非天然氨基酸與一個新的功能群結合，以響應蛋白質(zhì)中精確控制位置的特定密碼子[28]。此項技術主要使用aaRS(aminoacyl-tRNA synthetase)/tRNA正交系統(tǒng)在發(fā)生無義突變的位點通讀突變密碼子, 達到翻譯全長蛋白的目的[29,30]，因此，基因密碼子擴展技術成為了研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要手段。
HcCaM7蛋白是紅麻CaM家族中的一員，目前還沒有HcCaM7蛋白及其乙?；揎梾⑴c紅麻生長發(fā)育及逆境脅迫調(diào)控作用的相關報道。本研究克隆了HcCaM7基因，對其進行生物信息學分析和亞細胞定位；采用VIGS基因沉默技術研究了其在紅麻自然生長條件下的功能；并進一步利用基因密碼子擴展技術和體外表達分析了乙?；揎棇cCaM7蛋白功能發(fā)揮的作用。該研究結果為明確HcCaM7基因及其蛋白乙?；揎椩谡{(diào)控紅麻生長、發(fā)育及逆境脅迫響應等功能方面提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
本試驗所用紅麻材料為不育系P3A和保持系P3B，紅麻植株種植于廣西大學試驗田(108°22'E,22°48'N)，種植期間進行常規(guī)的田間管理。菌種GV3101、DH5α、BL21(DE3)等均由本實驗室保存。
1.2紅麻總RNA提取與第一鏈cDNA的合成
使用RNA提取試劑盒(Vazyme，RC101)提取P3B雙核期花藥的總RNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用NanoDrop ND-100檢測RNA的濃度和純度。使用諾唯贊反轉錄試劑盒(R312-01)合成第一鏈cDNA，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/font>
1.3HcCaM7基因的克隆、表達分析
根據(jù)紅麻基因組的序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計擴增HcCaM7(基因號為Hc.16G007630.t1)全長的特異性引物HcCaM7(表1)，以P3B花藥cDNA為模板，采用高保真Mix (Vazyme，P520)進行擴增。擴增產(chǎn)物電泳后切膠回收并連接到克隆載體pEASY-Blunt，轉入大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆進行測序。分別以紅麻不育系P3A和保持系P3B的根、莖、葉的cDNA為模板，以紅麻Histone3為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR研究HcCaM7基因在P3A和P3B不同組織中的表達差異。
1.4 HcCaM7基因的生物信息學分析
分別在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和DNAMAN軟件中對HcCaM7進行基因結構預測和序列比對；利用MEGA7軟件的neighbor joining (NJ)構建進化樹。用expasys WISS網(wǎng)站(https://www.swissmodel.expasy.org/)預測蛋白質(zhì)的二級和三級結構。
1.5 HcCaM7蛋白亞細胞定位分析
設計HcCaM7-GFP引物(表1)，擴增目的基因編碼區(qū)序列。利用重組法(Vazyme,C112)將目的基因與帶有GFP標簽的pRTVcGFP載體進行連接，將融合表達載體轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑選測序正確的克隆子提取質(zhì)粒。通過原生質(zhì)體瞬時轉染技術將HcCaM7-GFP重組質(zhì)粒轉化到擬南芥原生質(zhì)體，避光和室溫條件下孵育12h。用剪口槍頭向載玻片中加入少量原生質(zhì)體溶液，將蓋玻片從一端輕輕蓋在載玻片上，盡量避免出現(xiàn)氣泡，激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光以研究目的蛋白的亞細胞定位情況，并拍照記錄。
1.6病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)分析
根據(jù)HcCaM7編碼序列設計帶有pTRV2載體序列信息引物HcCaM7- pTRV2 (表1)，擴增262bp片段，連接到pTRV2載體，測序成功后提取質(zhì)粒轉化到農(nóng)桿菌GV3101中。選擇pTRV1、pTRV2空載體和重組質(zhì)粒HcCaM7-pTRV2單克隆農(nóng)桿菌轉化子，在含50mgL-1卡那霉素和50mgL-1利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃ 220轉min-1振蕩過夜，使OD600值到1.0左右，7000´g離心5min收集菌液，用重懸液(10mmolL-1 2-甲基乙酸磺酸鹽、200μmolL-1乙酰丁香酮、10mmolL-1 MgCl2)重懸菌體至OD600=0.8~1.0，之后將pTRV2分別與pTRV2空載體和HcCaM7-pTRV2按體積比1∶1混合，室溫下暗置2~3h。隨后用1mL注射器注射紅麻葉片背面，注射面積達到90%，24℃暗培養(yǎng)24h，轉入正常光培養(yǎng)14d左右，取單株葉片，提取RNA并進行熒光定量檢測相對表達量。以注射了pTRV2菌液的植株為對照，篩選出表達量降低的沉默植株，并進行表型觀察。
1.7HcCaM7基因和HcCaM7蛋白在紅麻P3A和P3B花藥中表達差異分析
為判斷HcCaM7基因與HcCaM7蛋白在紅麻P3A和P3B花藥中表達量差異是否導致HcCaM7蛋白乙酰化修飾水平的差異，根據(jù)HcCaM7的全長序列設計引物熒光定量PCR引物HcCaM7-qPCR (表1)，以紅麻Histone3為內(nèi)參基因，紅麻不育系P3A為對照，利用2-ΔΔCT法[31]計算目的基因的相對表達量。
將純化的HcCaM7蛋白制備Rabbit anti-HcCaM7抗體(抗體由南京金斯瑞公司制備)。將Rabbit anti-HcCaM7作為一抗，HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(Sangon Biotech)作為二抗，Western-blot檢測HcCaM7蛋白在紅麻P3A和P3B中的表達量。
1.8基于基因密碼子擴展技術的乙?；稽c定點突變
本研究通過運用基因密碼子擴展技術進行體外誘導具有乙?；揎椀?/font>HcCaM7mut蛋白，研究乙?；揎棇cCaM7蛋白功能的影響。本研究中所用的pTECH-MbAcK3RS(IPYE)質(zhì)粒是編碼MbAcK3RS (IPYE)和pylT的表達質(zhì)粒[32,33,34]，運用該質(zhì)粒就能夠識別終止密碼子TAG并將乙酰賴氨酸(AcK)攜帶到TAG處，進行翻譯。根據(jù)課題組前期的蛋白組數(shù)據(jù)，找出HcCaM7的乙酰化修飾位點，將其突變成為終止密碼子TAG，之后運用基因密碼子擴展技術[35]，將乙酰化賴氨酸引入到TAG位點上。具體操作如下：利用CE design設計HcCaM7點突變引物HcCaM7mut(表1)，乙?；揎椢稽c來自課題組前期研究[1]，以1.3中的HcCaM7-pEASY-Blunt質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化處理后進行膠回收，將回收產(chǎn)物用重組酶連接成環(huán)，轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，提取質(zhì)粒測序。最終HcCaM7編碼賴氨酸的密碼子AAG成功被突變成TAG，提取重組質(zhì)粒HcCaM7mut-pEASY-Blunt。
1.9蛋白表達及純化
設計引物HcCaM7-PET32α(表1)，分別以HcCaM7-pEASY-Blunt和HcCaM7mut-pEASY-Blunt為模板進行擴增，利用無縫克隆的方法將它們連接到pET32α。BL21(DE3)菌株的蛋白乙?；斤@著低于大腸桿菌K12衍生菌株，故將其作為表達宿主[36]，將重組質(zhì)粒HcCaM7-PET32α和HcCaM7mut-pET32α分別與含有ACK結合系統(tǒng)的pTECH質(zhì)粒一起轉入大腸桿菌BL21(DE3)中。選擇HcCaM7和HcCaM7mut單克隆菌落接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，置于37℃、220轉min-1搖床中搖菌培養(yǎng)過夜。次日，將菌液接種到100mL含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，接種比例為1∶100。將培養(yǎng)液置于37℃、220轉min-1的搖床上，搖至OD600達到0.6~0.8。取菌液冰浴30 min后，加入終濃度為20mmolL-1的NAM(煙酰胺，去乙?；敢种苿?、10mmolL-1的ACK (乙酰賴氨酸)和0.4mmolL-1的IPTG，在28℃條件下誘導蛋白表達。重組蛋白用Ni-IDA 6 FF Sefinose(TM) Resin Kit(Sangon Biotech)純化，并將含有融合蛋白的上清樣品加入鎳柱中，鎳柱用結合緩沖液平衡。收集流出來的液體，上柱重復1~2次。用含60mmolL-1咪唑的洗滌液以至少5~10倍的柱床體積沖洗雜蛋白。然后用0.5倍柱床體積、含有250mmolL-1咪唑的蛋白緩沖液連續(xù)洗脫融合蛋白6次。
1.10Western-blot檢測
取純化后的蛋白，經(jīng)裂解變性后進行SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍染色和western-blot分析。用一抗Anti-6×His Tag mouse monoclonal antibody (Sangon Biotech)和二抗AP-conjugated Goat Anti-mouse IgG (Sangon Biotech)檢測是否含有His標簽；用一抗Ac-lysine Antibody (Santa Cruz Biotechnology)和二抗AP-conjugated Goat Anti-mouse IgG (Sangon Biotech)檢測乙酰化修飾水平。剩余的蛋白用液氮冷凍，放在-80℃冰箱下保存，備用。
1.11HcCaM7蛋白的乙?；揎棇t麻NADK酶活的影響
用磷酸鹽緩沖溶液分別將無乙?；揎椀牡鞍?/font>HcCaM7和發(fā)生了乙?；揎椀牡鞍譎cCaM7mut配制為蛋白濃度為0.4mgmL-1的溶液(pH5.5)。用NAD激酶試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)提取紅麻NADK酶液，蛋白溶液按照體積比1∶10添加到紅麻NADK酶液中，以紅麻NADK酶液為空白組，按照NAD激酶試劑盒說明書檢測NADK酶活，并將其 NADK酶活力定義為100%，評價HcCaM7和HcCaM7mut對紅麻NADK活力的影響，從而分析乙?；揎棇cCaM7的影響。
1.12CaM7乙酰化修飾對大腸桿菌響應非生物脅迫的影響
對照菌pET32α以及1.7中的含有HcCaM7蛋白、HcCaM7mut蛋白的重組菌，當OD600達到0.6，加入終濃度為0.4mmolL-1的IPTG，28℃、200轉min-1 6 h誘導培養(yǎng)，將3種菌稀釋至相同濃度(OD600=1.2)，進行不同非生物脅迫抗性檢測存活率，試驗重復3次。
氯化鈉、甘露醇、重金屬Cd抗性檢測：通過預試驗確定氯化鈉的處理濃度為400mmolL-1和500mmolL-1，甘露醇的處理濃度為400mmolL-1和600mmolL-1，CdCl2的處理濃度為30mmolL-1和50μmolL-1，取6μL3種經(jīng)梯度稀釋后的菌液分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基(含有0.4mmolL-1的IPTG和NaCl/甘露醇/CdCl2)上，37℃，倒置培養(yǎng)12h，統(tǒng)計存活率。
低溫抗性檢測：取1mL的3種菌液于液氮中反復凍融6次，然后取經(jīng)梯度稀釋后取6μL分別垂直加到LB固體培養(yǎng)基(含有0.4mmolL-1 IPTG)上，37℃，倒置培養(yǎng)12h，統(tǒng)計存活率。
表1 研究所用引物列表
2結果與分析
2.1HcCaM7基因的克隆及在不同組織表達分析
以紅麻花藥RNA反轉錄獲得cDNA為模板，進行PCR擴增，ORF長度為450 bp (圖1-A)，經(jīng)序列比對，測序結果為目的序列。通過qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，HcCaM7基因在P3A根部的表達量顯著高于P3B，在莖中兩者表達量幾乎一致，在P3B的葉片中，HcCaM7基因表達量顯著高于P3A(圖1-B)。
圖1 HcCaM7基因的克隆及表達分析
A：HcCaM7的PCR擴增產(chǎn)物；M：DL 2000 Marker；1：HcCaM7 ORF擴增。B：HcCaM7基因在紅麻P3A和P3B不同組織中表達分析。數(shù)據(jù)為3個生物學重復±標準差。柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
2.2HcCaM7的生物信息學分析
HcCaM7基因ORF編碼149個氨基酸殘基的蛋白。理化性質(zhì)分析表明，HcCaM7蛋白的相對分子量為16.85 kD，理論等電點為4.11。蛋白功能域預測結果顯示(圖2-A)，HcCaM7蛋白是PTZ00184 super family成員，其三級結構為EF結構(圖2-B)。從HcCaM7與其他物種的氨基酸序列進行進化樹構建可知，紅麻的CaM7蛋白和木槿的CaM7蛋白親緣關系最近，其次為陸地棉CaM7蛋白(圖2-C)。
圖2 HcCaM7的生物信息學分析
A：HcCaM7蛋白保守結構域的預測；B：HcCaM7蛋白三級結構預測結果；C：HcCaM7蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析。
2.3HcCaM7蛋白亞細胞定位
觀察轉入HcCaM7-pRTVcGFP融合表達載體的原生質(zhì)體發(fā)現(xiàn)，HcCaM7-pRTVcGFP在細胞質(zhì)和細胞膜發(fā)出明顯綠色熒光(圖3)，表明HcCaM7蛋白定位在細胞質(zhì)和細胞膜上，這與網(wǎng)站在線預測的結果相一致。
圖3 HcCaM7蛋白亞細胞定位
A：Mcherry通道；B：GFP通道；C：明場；D：融合場。
2.4HcCaM7基因VIGS沉默分析
研究表明，當植物中的基因通過VIGS沉默后表達水平降低到40%以下時，植株表型一般會有顯著差異[31]。本研究用qPCR檢測到了9株注射HcCaM7- pTRV2載體的植株，其表達量均低于注射pTRV2空載體(對照)的植株的40%以上(圖4-A)。結果顯示，與空白對照CK和空載對照pTRV2植株相比，HcCaM7- pTRV2植株的生長受到明顯的抑制，其中鮮重和株高分別比空載對照pTRV2植株顯著下降31.1%和18.4%(圖4-B，C)。沉默HcCaM7后，紅麻植株的生長整體受到了顯著抑制作用，表明HcCaM7在紅麻正常生長發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的作用。
圖4 基因VIGS沉默分析
A：轉基因植株的qRT-PCR分析，pTRV2空載為對照，1~9代表HcCaM7基因沉默植株；B：沉默HcCaM7植株的表型分析；C：CaM7-pTRV2紅麻植株鮮重；D：CaM7-pTRV2紅麻植株株高。數(shù)據(jù)為3個生物學重復±標準差； 不同小寫字母表示之間差異顯著 (P<0.05)。
2.5HcCaM7基因及其蛋白相對表達量分析
對紅麻不育系P3A和保持系中的P3B雙核期花藥中HcCaM7基因的相對表達量分析(圖5-A)表明，HcCaM7在兩者花藥中表達量相近，沒有顯著差異；在紅麻P3A和P3B花藥中，HcCaM7蛋白表達量也幾乎一致(圖5-B)。表明在紅麻P3A和P3B中CaM7蛋白的乙酰化修飾差異不是由HcCaM7基因表達量差異導致的。
圖5 紅麻P3A和P3B花藥中HcCaM7基因和其蛋白在表達水平定量分析
A：HcCaM7在紅麻P3A和P3B花藥中相對表達量；B：HcCaM7蛋白在紅麻P3A和P3B花藥中表達水平，1：P3A的花藥，2：P3B的花藥。數(shù)據(jù)為3個生物學重復±標準差； 不同小寫字母表示之間差異顯著(P<0.05)。
2.6HcCaM7基因定點突變
由圖5可知，在紅麻P3A和P3B中，HcCaM7蛋白乙酰化修飾水平差異不是由基因表達量和蛋白表達量差異造成，因此，運用基因密碼子擴展技術進行體外誘導具有乙?；揎椀腍cCaM7mut蛋白，研究乙?；揎棇cCaM7蛋白功能的影響。
根據(jù)課題組前期的蛋白組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HcCaM7蛋白的乙?；揎椢稽c只有一個，在第59位置的賴氨酸殘基上，命名其為K59。對K59進行定點突變，將測序結果和原序列比對，發(fā)現(xiàn)K59的AAG成功被突變?yōu)榻K止密碼子TAG (圖6)。將突變后的HcCaM7mut連接到pEt-32α載體后，與pTECH質(zhì)粒共轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導具有乙?；揎椀腍cCaM7mut蛋白。
圖6 HcCaM7蛋白乙酰化修飾位點定點突變
2.7HcCaM7蛋白及其點突變蛋白誘導純化及western-blot檢測分析
誘導蛋白發(fā)現(xiàn)，在28℃、6h的條件下，可以得到較多的可溶性蛋白。上清液經(jīng)Ni-IDA親和層析純化分析，洗脫可以獲得較高濃度的蛋白帶。pET-32α空載體能誘導出20kD大小的蛋白，因此，目標蛋白大小為36.8kD(圖7-A，B)。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，HcCaM7蛋白和HcCaM7mut蛋白都有His標簽，可以確定為重組蛋白(圖7-C)。進一步的經(jīng)乙?；贵w孵育結果顯示，HcCaM7蛋白不存在乙?；揎?，而HcCaM7mut蛋白存在較高水平的乙?；揎?圖7-D)。
圖7 HcCaM7蛋白及其點突變蛋白純化結果及His標簽和乙酰化修飾檢測
A：HcCaM7mut蛋白純化結果，1、2、3為純化結果；B：HcCaM7蛋白純化結果，1、2、3為純化結果；C：His-Tag Western blot檢測結果，1是HcCaM7mut蛋白，2是HcCaM7蛋白；D：蛋白乙?；揎梂estern blot檢測結果，1是HcCaM7mut蛋白，2是HcCaM7蛋白。
2.8HcCaM7蛋白乙酰化修飾促進了NADK活性
CaM可以與NADK結合并促進NADK的活性；將無乙?；揎椀牡鞍缀陀幸阴；揎椀牡鞍追謩e加入到紅麻NADK酶液中，通過分析NADK酶活的變化來看探討乙?；瘜cCaM7功能的影響。結果顯示，NADK酶液中加入了HcCaM7蛋白之后，其活性顯著提高；加入具有乙?；揎椀腍cCaM7mut蛋白后活性進一步提高，比加入HcCaM7蛋白高了11.37%(圖8)。表明HcCaM7蛋白能夠提高紅麻NADK的活性，推測乙?；揎桯cCaM7蛋白后可以進一步促進HcCaM7蛋白發(fā)揮作用。
圖8 HcCaM7乙?；揎棇ADK酶活的影響
數(shù)據(jù)為3個生物學重復±標準差。不同小寫字母表示之間差異顯著(P<0.05)。
2.9HcCaM7蛋白及其乙酰化修飾在大腸桿菌相應非生物脅迫中的作用
采用點板法對轉HcCaM7蛋白和乙?；揎椀腍cCaM7mut蛋白重組菌和空載體對照菌進行了NaCl抗性、甘露醇抗性、重金屬鎘抗性和冷脅迫抗性檢測，統(tǒng)計稀釋了104倍的菌落數(shù)，結果表明，對照菌和重組菌在空白LB基本固體培養(yǎng)基上生長良好，沒有顯著差異；但在400mmolL-1和500mmolL-1 NaCl(圖9-A，圖9-a)、400mmolL-1和600mmolL-1的甘露醇(圖9-B，圖9-b)、30mmolL-1和50μmolL-1的CdCl2(圖9-C，圖9-c)、液氮反復凍融6次(圖9-D，圖9-d)處理后，含有HcCaM7蛋白的重組菌存活率顯著高于空載對照菌，且含有HcCaM7mut的重組菌存活率比含有HcCaM7蛋白的重組菌顯著提高，表明HcCaM7蛋白使大腸桿菌對鹽脅迫、甘露醇脅迫、重金屬鎘脅迫以及冷脅迫的抗性增強，HcCaM7mut蛋白能夠使大腸桿菌對這些非生物脅迫的抗性進一步增強。
圖9 HcCaM7在大腸桿菌中應對非生物脅迫的抗性檢測
A：鹽脅迫；B：甘露醇脅迫；C：CdCl2脅迫；D：冷脅迫；a,b,c,d：脅迫后稀釋了104倍的菌落存活數(shù)。數(shù)據(jù)為3個生物學重復±標準差。不同小寫字母表示之間差異顯著(P<0.05)。
3討論
3.1HcCaM7基因及其蛋白乙酰化修飾參與調(diào)控了紅麻生長發(fā)育
Ca2+作為植物體內(nèi)的一種信號載體，是調(diào)節(jié)植物發(fā)育進程的第二信使，植物體內(nèi)通過Ca2+濃度變化來傳遞信號從而進行調(diào)節(jié)和控制著一系列細胞和生理反應[37,38]。目前，植物CaM是被研究的最清楚的一類鈣感受器蛋白，在植物生長發(fā)育過程中的參與的多種調(diào)控路徑及發(fā)揮的作用也已經(jīng)陸續(xù)被報導[39]。有研究者認為，NAD激酶、NADP磷酸酶與植物的種子萌發(fā)、抗逆性以及育性等多種生理過程密切相關[40]。因此，CaM可以通過調(diào)節(jié)與其相互作用的酶等來影響植物體生長發(fā)育、育性以及抗逆[41]。本研究基于實驗室前期蛋白質(zhì)組學研究結果，成功從紅麻中克隆得到了HcCaM7基因，得知其編碼149個氨基酸，它是CaM家族中的一員。亞細胞定位結果顯示，HcCaM7定位在細胞膜和細胞質(zhì)上，因而猜想，當受到外界刺激的時候，能夠很快接觸到信號并做出反應。通過VIGS技術發(fā)現(xiàn)，當紅麻幼苗的HcCaM7基因被沉默以后，紅麻幼苗生長顯著受到了抑制，具體表現(xiàn)在株高、鮮重方面，因此，HcCaM7在紅麻生長方面具有十分重要的作用。
乙酰化修飾有時會對蛋白產(chǎn)生巨大的影響，甚至使酶活發(fā)生顯著提升或者下降[20]，因而研究乙?；揎棇τ谘芯康鞍坠δ苁种匾⒕哂幸阴；揎椀?/font>HcCaM7mut蛋白和無乙酰化修飾的HcCaM7蛋白與紅麻NADK酶液混合后發(fā)現(xiàn)，NADK的活性均提高了，表明HcCaM7蛋白對NADK活性具有促進作用；之后發(fā)現(xiàn)具有乙酰化修飾的HcCaM7mut蛋白對酶活的提高大于無乙?；揎椀腍cCaM7蛋白，證明了乙?；揎椖軌虼龠MHcCaM7發(fā)揮作用，對HcCaM7具有正調(diào)控作用。據(jù)報道，經(jīng)過活化的CaM可以通過直接與NADK結合來發(fā)揮作用[5]，因此推測乙?；揎椏赡芡ㄟ^改變了HcCaM7蛋白的構象來促進其與NADK結合，從而增加了NADK的活性。在紅麻P3A和P3B的雙核期花藥中，HcCaM7的表達量幾乎一致，但是P3B花藥中HcCaM7蛋白乙酰化水平高于P3A，由此推測，HcCaM7蛋白的乙酰化修飾差異導致對紅麻花藥的生命活動如能量代謝等產(chǎn)生了影響，從而影響紅麻的育性。
3.2乙?；揎椩鰪奌cCaM7蛋白應對逆境脅迫能力
目前，已經(jīng)有上百種非天然氨基酸可以經(jīng)過基因密碼子擴展技術在翻譯過程中被特異的整合到蛋白質(zhì)特定位置[42]，從而得到含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。該技術已經(jīng)在不少研究中被使用過，已經(jīng)比較成熟[34,43]，基因密碼子擴展技術還使位點特異性標記的細胞蛋白的活細胞和超分辨率成像成為可能[44]。賴氨酸殘基可逆乙?；且环N廣泛存在于自然界的翻譯后修飾，如細胞信號轉導和能量代謝過程中，乙?；揎椏梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)相關酶的活性、蛋白質(zhì)的結構等來調(diào)節(jié)生命活動。乙酰輔酶a合成酶1 (Acetyl-coA synase 1, ACSS1)和乙酰輔酶a合成酶2 (ACSS2)分別位于細胞質(zhì)基質(zhì)和線粒體中，乙酰化修飾抑制了ACSS1和ACSS2的活性，而SIRT1和SIRT3介導的去乙酰化恢復了ACSS1和ACSS2的活性[45]。本研究中，基因密碼子擴展技術利用改造后的Methanosarcina barkeri pyrrolysyl-tRNA合成酶[32]和優(yōu)化后的同源tRNA pyl [28]，將乙酰賴氨酸引入到經(jīng)過定點突變的HcCaM7基因中的TAG終止密碼子上，從而在K59上產(chǎn)生乙?；揎椀腍cCaM7mut突變體。運用基因密碼子擴展技術和原核表達，成功得到了具有乙?；揎桯cCaM7mut蛋白和無乙?；揎椀腍cCaM7蛋白。本研究通過非生物脅迫試驗發(fā)現(xiàn)，HcCaM7蛋白提高了大腸桿菌的抗甘露醇、鹽、重金屬Cd以及冷脅迫的能力，當HcCaM7蛋白經(jīng)過乙?；揎椧院?，使大腸桿菌對非生物脅迫的抗性得到進一步的加強。我們推測，乙?；揎椖軌蛟鰪奌cCaM7蛋白的活性或者使HcCaM7蛋白的構象發(fā)生改變，更利于其與抗逆境相關的酶、物質(zhì)結合，促進相關代謝，從而增強植株抗逆性。
4結論
本研究克隆了紅麻HcCaM7基因，其表達主要于細胞質(zhì)和細胞膜中，參與了紅麻的生長調(diào)控。HcCaM7蛋白乙酰化修飾差異不是由其本身基因及其蛋白表達水平的差異導致的。利用密碼子擴展技術研究表明體外表達的HcCaM7蛋白可以增強大腸桿菌的非生物脅迫的抗性，發(fā)生乙?；揎椇螅@種作用更加明顯。因此，HcCaM7蛋白可能參與紅麻生長發(fā)育和在逆境脅迫發(fā)揮重要作用，乙?；揎椖軌?qū)cCaM7蛋白的作用進行正調(diào)控，促進其進一步發(fā)揮功能。
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文章摘自：黃震,吳啟境,陳燦妮,吳霞,曹珊,張輝,岳嬌,胡亞麗,羅登杰,李赟,廖長君,李茹,陳鵬.鈣調(diào)素基因(HcCaM7)及其蛋白乙?；揎梾⑴c紅麻響應非生物脅迫的作用[J/OL].作物學報:1-15[2022-08-07].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220701.1635.002.html
