摘  要：【目的】研究水楊酸（SA）引發(fā)對(duì)鹽脅迫下紅麻生長(zhǎng)及生理響應(yīng)，并揭示SA引發(fā)對(duì)紅麻中逆境相關(guān)基因的誘導(dǎo)模式，為紅麻耐鹽性研究提供理論依據(jù)。【方法】以2個(gè)不同耐鹽性紅麻品種（鹽抗性材料為CP018，鹽感性材料為CP047）為研究對(duì)象，將種子引發(fā)處理后進(jìn)行水培試驗(yàn)，分析SA引發(fā)對(duì)紅麻種子萌發(fā)及150mmol·L-1NaCl脅迫下幼苗農(nóng)藝性狀及生理方面的影響，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析SA引發(fā)逆境相關(guān)基因的表達(dá)模式。【結(jié)果】鹽抗性品種CP018經(jīng)過(guò)0.2mmol·L-1SA引發(fā)后，能顯著提升種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，分別提高34.78%、31.30%和58.07%；鹽感性材料CP047也有一定的提高，分別提高7.50%、10.56%和6.23%，但是未達(dá)到顯著水平。在鹽脅迫條件下，經(jīng)SA引發(fā)（S1）與未引發(fā)（N1）相比，株高抑制率在鹽抗性和鹽感性品種中分別顯著降低4.07%（CP018）和3.91%（CP047），干重抑制率在2個(gè)品種中分別顯著降低15.50%（CP018）和15.68%（CP047）；鮮重抑制率在鹽感性品種CP047中顯著降低4.46%，但在鹽抗性品種CP018中未達(dá)到顯著水平。根系掃描分析表明，根長(zhǎng)抑制率在鹽抗性和鹽感性材料中分別顯著下降10.74%（CP018）和10.77%（CP047）；根表面積抑制率在鹽抗性和鹽感性品種中分別下降5.09%（CP018）和2.95%（CP047），僅在鹽抗性品種CP018中達(dá)到顯著水平；而根系活力抑制率在鹽感性品種CP047中降低46.21%，在鹽抗性品種CP018中降低6.56%，僅在鹽感性品種CP047中達(dá)到顯著水平?；疑P(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)根系活力是對(duì)影響植株干重最重要的因素。SA引發(fā)能降低鹽脅迫下紅麻葉片的MDA含量，提高POD和SOD酶活性。對(duì)12個(gè)逆境相關(guān)基因的表達(dá)量分析結(jié)果表明，ACCD、APX2、SOS1、ARR2、PAL、ERF.C3、CHIT和TIFY11表達(dá)水平在SA引發(fā)處理下均顯著上調(diào)，而ERF9、ERS1、MYC2和XTH22在2個(gè)材料中的表達(dá)模式存在差異，其中，XTH22在CP047中顯著上調(diào)，在鹽抗性品種CP018中無(wú)顯著變化，ERS1和MYC2在鹽抗性品種CP018中顯著上調(diào)，在鹽感性品種CP047中卻顯著下降，而ERF9在2個(gè)品種中的趨勢(shì)則與此相反。【結(jié)論】適宜濃度的SA引發(fā)可以顯著緩解紅麻在鹽脅迫下的生長(zhǎng)，且對(duì)不同紅麻種質(zhì)資源的影響程度和方式存在差異，SA可能通過(guò)影響生理過(guò)程如抗氧化酶系統(tǒng)，并通過(guò)誘導(dǎo)特異基因的表達(dá)調(diào)節(jié)紅麻植株對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：紅麻（Hibiscus cannabinus L.）；種子引發(fā)；水楊酸；抗氧化酶活；鹽脅迫

 

0引言

【研究意義】紅麻（Hiniscus cannabinus L.）是錦葵科木槿屬重要的纖維作物，具有快速生長(zhǎng)、耐鹽堿、抗?jié)?、抗旱、纖維產(chǎn)量高和質(zhì)量好等優(yōu)良特性^[1]，是改善鹽堿地和研究作物對(duì)非生物脅迫反應(yīng)的理想材料^[2]。提高紅麻的耐鹽性對(duì)提高紅麻產(chǎn)量和合理利用鹽堿地，具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)生態(tài)效應(yīng)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】世界范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力受到各種環(huán)境壓力的不利影響，如土壤鹽堿化是限制作物種植面積，以及作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素^[3]。中國(guó)的鹽堿地面積約為3.6×107hm²，其中，具有農(nóng)業(yè)利用潛力的鹽堿地面積達(dá)1.3×107hm²，約占總耕地面積的10%^[4]。土壤溶液中鹽分的積累會(huì)引起植物代謝紊亂、離子失衡、滲透脅迫、有毒離子積累、氧化損傷，最終導(dǎo)致作物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收減少^[5]。過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）積累會(huì)導(dǎo)致代謝功能的改變，不可避免地會(huì)引起植物蛋白質(zhì)氧化、膜質(zhì)過(guò)氧化、酶抑制以及DNA和RNA損傷等^[6]。與此同時(shí)，植物已經(jīng)進(jìn)化出各種適應(yīng)機(jī)制以抵抗脅迫環(huán)境^[7]。植物可以通過(guò)產(chǎn)生超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase,POD）和過(guò)氧化氫酶（catalase,CAT）等抗氧化酶來(lái)清除過(guò)量的ROS^[8]。種子引發(fā)是一項(xiàng)通過(guò)緩控種子吸水和逐步回干的處理技術(shù)^[9]。種子引發(fā)受多種因素調(diào)控，關(guān)鍵因素有引發(fā)劑種類^[10]、引發(fā)時(shí)間^[11]、引發(fā)溫度^[11]和引發(fā)濃度^[12]等。具體的引發(fā)技術(shù)通過(guò)調(diào)控溫度和水勢(shì)，使種子停留在吸脹吸水的第二階段，在胚根突破種皮前完成細(xì)胞器、細(xì)胞膜和DNA的修復(fù)，使生物酶得到活化，促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)大，提高出苗率^[13]。很多學(xué)者通過(guò)外源物質(zhì)種子引發(fā)的方法來(lái)緩解植株的逆境脅迫^[14]。水楊酸（salicylic acid,SA）作為一種內(nèi)源性生理調(diào)節(jié)劑，廣泛存在于各類植物體內(nèi)^[15]。研究表明，水楊酸可以參與調(diào)節(jié)植物（生長(zhǎng)發(fā)育、氣孔調(diào)節(jié)、酶生物合成、膜保護(hù)和植物開(kāi)花等）多種生理生化活動(dòng)^[16]。SA引發(fā)可提高植株的抗氧化酶活性，且在玉米^[17]、小麥^[18]、豌豆^[19]等植物上已得到證實(shí)。已有研究發(fā)現(xiàn)50mg·L^-1的SA可以提高小麥在鹽脅迫下的發(fā)芽勢(shì)、苗高和鮮重^[20],0.2mmol·L^-1SA引發(fā)24h對(duì)棉花種子發(fā)芽率提高效果最好^[21]；王鐵兵等^[22]采用0.1mmol·L^-1SA處理老化的玉米種子，發(fā)現(xiàn)SA引發(fā)能促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，修復(fù)老化膜損傷；有研究表明，10-6和10-5mol·L^-1的SA引發(fā)處理可增加擬南芥在鹽脅迫下的SOD、GST和GPOX活性，降低H₂O₂和MDA積累，At GSTU19和At GSTU24的表達(dá)均有所增強(qiáng)，該研究者認(rèn)為SA引發(fā)可以通過(guò)調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵的ROS和抗氧化物酶來(lái)減少鹽脅迫引起的氧化損傷，而酶活性的改變可能源自一些關(guān)鍵解毒基因（如GST）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控^[23]。【本研究切入點(diǎn)】紅麻作為鹽堿地修復(fù)的重要作物，目前，通過(guò)種子引發(fā)提高紅麻植株耐鹽性的研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以未經(jīng)引發(fā)作為對(duì)照，通過(guò)對(duì)SA對(duì)不同耐鹽性紅麻種子的萌發(fā)及幼苗在鹽脅迫下的形態(tài)與生理指標(biāo)的測(cè)定與分析，探究SA對(duì)紅麻耐鹽性的影響，以期為種子引發(fā)提高紅麻耐鹽機(jī)理的研究提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試品種：采用廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室陳鵬課題組前期鑒定的2個(gè)具有不同鹽脅迫耐受能力的品種，閩紅964（鹽抗性品種CP018）和7804（鹽感性品種CP047）。取當(dāng)年新收獲的種子晾干備用。水楊酸（SA）和氯化鈉分別購(gòu)自天津博迪化工有限公司和天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)于2021年3—9月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院綜合樓實(shí)驗(yàn)室以及溫室大棚進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

引發(fā)處理：挑選籽粒飽滿的紅麻種子，用1.5%次氯酸鈉消毒10min，蒸餾水沖洗3次；分別將0.2mmol·L^-1SA浸種和未浸種（對(duì)照）的種子置于16℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24h。浸種后的種子用蒸餾水沖洗3次，并自然風(fēng)干，選擇露白一致的種子均勻平鋪在發(fā)芽盒中，置于培養(yǎng)箱（白天26℃14h/黑夜25℃10h）中培養(yǎng)，60粒/盒，3個(gè)重復(fù)，每天定量添加蒸餾水，觀察其生長(zhǎng)情況，測(cè)定種子萌發(fā)期間的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。

幼苗培育：用蒸餾水將發(fā)芽4d后的幼苗根系沖洗干凈，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移植到1/4Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的育苗盤中，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，培育至兩葉一心時(shí)，用150mmol·L^-1（預(yù)試驗(yàn)確定）濃度的NaCl對(duì)其進(jìn)行處理，以不加NaCl的1/4Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照。試驗(yàn)共設(shè)置8個(gè)處理（表1），每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每2d更換一次處理液，處理8d后開(kāi)始取樣進(jìn)行測(cè)定。

表1 不同處理組合的設(shè)置

 

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1發(fā)芽情況的統(tǒng)計(jì)

種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率（germination rate,GR,%)=(4d內(nèi)發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）×100%;

發(fā)芽勢(shì)（germination potential,GP,%)=(2d內(nèi)發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）×100%;

發(fā)芽指數(shù)（germination index,GI，%）=∑（Gt/Dt），其中，Gt為第t天的新增發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽的天數(shù)。

1.3.2農(nóng)藝性狀的測(cè)定

將紅麻幼苗的根系用去離子水清洗干凈后吸干表面水分，用直尺測(cè)量幼苗的株高，天平稱量整株鮮重。采用EPSON 11000XL掃描儀對(duì)紅麻幼苗根系進(jìn)行掃描，利用WinRHIZO2013根系分析系統(tǒng)獲取根表面積和根長(zhǎng)。將植株整株置于烘箱105℃殺青30 min,80℃烘干至恒重，天平稱量干重。

1.3.3生理指標(biāo)的測(cè)定

采用抑制NBT光還原比色法、愈創(chuàng)木酚法和過(guò)氧化氫紫外線法分別測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性；采用硫代巴比妥酸法（2-thiobarbituric acid,TBA）測(cè)量丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，采用氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride,TTC）法測(cè)定根系活力。

1.3.4qRT-PCR分析

運(yùn)用改進(jìn)的異硫氰酸胍法提取總RNA[2]，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（NanoDrop,2000）檢測(cè)RNA濃度。然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（南京諾唯贊，貨號(hào)：R232-01），采用SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊）試劑進(jìn)行qRT-PCR分析，PCR反應(yīng)體系為10µL qPCR Master Mix、0.4µL正向引物和反向引物（表2）、1µL模板和8.2µL去離子水。3次生物學(xué)重復(fù)。以18SrRNA(18S）作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法^[24]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量水平。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

 

1.4灰色關(guān)聯(lián)度分析及數(shù)據(jù)處理

參照李桂榮等^[25]方法進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，植株干重為參考數(shù)列Xo,5個(gè)性狀參數(shù)設(shè)為比較數(shù)列Xi，參數(shù)Xi與Xo的關(guān)聯(lián)系數(shù)和各因素的關(guān)聯(lián)度分別為：

  

式中，εi(k)為Xi對(duì)Xo在k點(diǎn)的關(guān)聯(lián)系數(shù)，ρ為灰色關(guān)聯(lián)的分辨系數(shù)，（ρ在（0,1）內(nèi)取值，ρ越小，關(guān)聯(lián)系數(shù)間差異越大，區(qū)分能力就越強(qiáng)），ρ通常取0.5；

為兩級(jí)最小差絕對(duì)值；

為兩級(jí)最大差的絕對(duì)值；

根據(jù)關(guān)聯(lián)度γ的大小確定比較數(shù)列與參考數(shù)列的關(guān)聯(lián)程度，關(guān)聯(lián)度越大，說(shuō)明兩序列間的相關(guān)水平越高，即該比較序列對(duì)參考序列的影響越明顯（本研究以抑制率作為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析）。

采用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法（least significant difference,LSD），對(duì)不同處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)（顯著性水平為0.05）。用GraphPad Prism7.00軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)制表。

2結(jié)果

2.1種子引發(fā)對(duì)紅麻種子萌發(fā)的影響

從圖1可知，在紅麻品種CP018中，與未引發(fā)處理（N0）相比，SA引發(fā)處理（S0）顯著提高了種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，分別提高34.78%、31.30%和58.07%。在CP047中，SA引發(fā)處理（S0）提高了種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，分別提高7.50%、10.56%和6.23%，但并沒(méi)有達(dá)到顯著性。表明SA對(duì)于不同品種引發(fā)效果存在差異。

2.2種子引發(fā)對(duì)NaCl脅迫下紅麻農(nóng)藝性狀及干物質(zhì)積累的影響

由圖2-A和2-B可看出鹽脅迫使各處理的紅麻幼苗植株高度降低，且未經(jīng)引發(fā)處理的葉片有稍微卷曲，由圖3-A可看出，2個(gè)品種的株高在鹽脅迫下都受到顯著抑制。未經(jīng)引發(fā)鹽脅迫處理（N1）時(shí)，2個(gè)品種的鹽脅迫株高抑制率分別為28.02%(CP018）和29.20%(CP047），經(jīng)SA引發(fā)鹽處理（S1）的2個(gè)品種株高抑制率分別為23.95%(CP018）和25.29%(CP047），與N1相比，抑制率降低4.07%(CP018）和3.91%(CP047），且都達(dá)到了顯著差異。說(shuō)明SA種子引發(fā)可以緩解鹽脅迫，從而顯著提高紅麻幼苗在鹽脅迫下的株高。

由圖3-B可看出，2個(gè)品種的幼苗鮮重在引發(fā)條件下都有所提高。未經(jīng)引發(fā)鹽脅迫處理（N1）的幼苗鮮重在鹽脅迫下抑制率分別為45.22%(CP018）和49.86%(CP047），而SA引發(fā)處理（S1）的幼苗鮮重抑制率為43.36%(CP018）和45.40%(CP047），與N1相比，下降1.86%(CP018）和4.46%(CP047），在CP047中達(dá)到顯著差異，而在CP018中未達(dá)到顯著差異。說(shuō)明水楊酸能一定程度地減輕紅麻鹽脅迫下受到的傷害，提高紅麻幼苗的鮮重。

由圖3-C可看出，2個(gè)紅麻品種在引發(fā)條件下植株的干重都有所提高。鹽脅迫下（N1）幼苗的干物質(zhì)積累量抑制率為42.91%(CP018）和43.19%(CP047）。引發(fā)后的幼苗在鹽脅迫下（S1）干物質(zhì)積累的抑制率都有所下降，分別為27.41%(CP018）和27.51%(CP047），與N1相比，顯著下降15.50%(CP018）和15.68%(CP047）。說(shuō)明水楊酸有助于提高紅麻鹽脅迫下的干物質(zhì)積累。

  

圖1 SA種子引發(fā)對(duì)紅麻種子萌發(fā)的影響

  

圖2 紅麻SA種子引發(fā)后在鹽脅迫下的苗期形態(tài)

  

圖3 紅麻SA種子引發(fā)后在鹽脅迫下的農(nóng)藝性狀

2.3種子引發(fā)對(duì)NaCl脅迫下紅麻根系的影響

由圖4可看出，在鹽脅迫條件下，根長(zhǎng)都受到了不同程度的抑制。與未經(jīng)引發(fā)處理相比，SA引發(fā)條件下紅麻的根長(zhǎng)有所提高（圖5）。2個(gè)品種在未經(jīng)引發(fā)的鹽脅迫N1下根長(zhǎng)抑制率分別為28.62%(CP018）和31.78%(CP047），而S1處理下2個(gè)品種的根長(zhǎng)抑制率降低為17.88%(CP018）和21.01%(CP047），與未引發(fā)（N1）相比，分別下降10.74%(CP018）和10.77%(CP047），達(dá)到顯著差異水平。

引發(fā)條件處理可以提高紅麻根表面積，且可以緩解鹽脅迫對(duì)根表面積的抑制。2個(gè)品種在未經(jīng)引發(fā)（N1）處理下的根表面積抑制率分別為17.76%(CP018）和18.42%(CP047),SA引發(fā)（S1）條件下根表面積抑制率降低為12.67%(CP018）和15.47%(CP047），與N1相比，分別降低5.09%(CP018）和2.95%(CP047），在品種CP018中達(dá)到了顯著差異，而在CP047中未表現(xiàn)出顯著的差異。

由圖6可以看出，種子引發(fā)可以提高根系活力，且可以緩解鹽脅迫對(duì)紅麻幼苗根系活力的抑制。未經(jīng)引發(fā)（N1）的紅麻幼苗在鹽脅迫下的根系活力抑制率為24.26%(CP018）和73.65%(CP047）。SA引發(fā)條件下（S1）的根系活力抑制率降低為17.70%(CP018）和27.44%(CP047），相對(duì)于N1分別下降6.56%(CP018）和46.21%(CP047),CP047中具有顯著差異，在CP018中未表現(xiàn)出顯著的差異，說(shuō)明SA引發(fā)對(duì)供試紅麻2個(gè)品種的幼苗在鹽脅迫下根系活力具有明顯的促進(jìn)作用，且鹽感性品種中促進(jìn)作用更加顯著。

  

圖4 SA種子引發(fā)后NaCl脅迫下紅麻根系掃描

 

 

圖5 SA種子引發(fā)后NaCl脅迫下紅麻根系分析

 

 

圖6 SA引發(fā)對(duì)NaCl脅迫下紅麻根系活力的影響

2.4各農(nóng)藝指標(biāo)間灰色關(guān)聯(lián)度分析

根據(jù)各指標(biāo)的抑制率進(jìn)行種子引發(fā)各指標(biāo)灰色關(guān)聯(lián)度分析，其順序依次為根系活力>鮮重>根表面積>株高>根總長(zhǎng)度（表3），說(shuō)明根系活力、鮮重、根表面積對(duì)植株干重（生物量）的影響較大，其中，根系活力與干重的灰色關(guān)聯(lián)度最高，表明根系活力可以作為衡量SA種子引發(fā)對(duì)NaCl脅迫下紅麻幼苗階段緩解效應(yīng)的指示指標(biāo)。

表3 SA種子引發(fā)對(duì)NaCl脅迫下紅麻種子各指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)度分析

  

2.5SA引發(fā)對(duì)Na Cl脅迫下紅麻抗氧化酶活性的影響

未經(jīng)引發(fā)鹽脅迫（N1）顯著增加了紅麻幼苗葉片中的MDA含量，分別增加205.95%(CP018）和106.48%(CP047），但SA引發(fā)可以降低這種趨勢(shì)。與N1相比，CP047品種在S1處理下的MDA含量顯著降低20.01%,CP018中的MDA含量在S1處理下降低10.54%，但與N1相比未達(dá)到顯著性（圖7-A）。

與未經(jīng)鹽脅迫處理（S0和N0）相比，鹽脅迫下SOD活性在各處理中均有所下降，但與未經(jīng)引發(fā)N1相比，SA引發(fā)處理的SOD活性有所提高，S1處理?xiàng)l件下SOD活性分別提高12.14%(CP018）和40.68%(CP047），在CP047中達(dá)到顯著水平（圖7-B）。

本研究中，POD活性（圖7-C）在鹽脅迫下顯著增加，表明鹽脅迫促使紅麻葉片產(chǎn)生POD消除過(guò)量的過(guò)氧化氫，2個(gè)品種中SA引發(fā)（S1）與N1之間有顯著差異，與N1相比，POD活性在2個(gè)品種中分別顯著提高44.37%(CP018）和47.2%(CP047）。

與對(duì)照未施加鹽脅迫（S0和N0）相比，在鹽脅迫下，未經(jīng)引發(fā)（N1）的葉片CAT活性（圖7-D）呈上升趨勢(shì)，與N1相比，經(jīng)過(guò)SA引發(fā)后（S1）的2個(gè)品種葉片CAT活性卻有所下降。

綜上所述，SA引發(fā)可以顯著降低鹽脅迫下紅麻幼苗的MDA含量，顯著增加幼苗的SOD和POD活性，從而緩解過(guò)量ROS對(duì)紅麻幼苗的傷害。而這種作用在CP047中比較顯著，說(shuō)明SA引發(fā)對(duì)鹽脅迫下紅麻鹽感性品種的抗氧化酶活緩解作用具有顯著影響。

 

圖7 SA種子引發(fā)對(duì)NaCl脅迫下紅麻葉片MDA含量及抗氧化酶活性的影響

2.6逆境響應(yīng)相關(guān)基因q RT-PCR分析

為分析種子引發(fā)對(duì)相關(guān)基因在鹽脅迫下表達(dá)的影響，挑選12個(gè)逆境響應(yīng)相關(guān)的基因分別在2個(gè)品種中進(jìn)行了qRT-PCR分析（圖8）。乙烯響應(yīng)基因ERF9、ERF.C3和乙烯受體ERS1都是參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控因子，ERF9和ERF.C3在CP018品種中S1處理下分別顯著上調(diào)0.45和4.05倍，在CP047中ERF.C3顯著上調(diào)90.84倍，ERF9在CP047中卻下調(diào)0.25倍；ERS1與ERF9在2個(gè)品種中呈相反的趨勢(shì)，ERS1在CP047中顯著上調(diào)4.61倍，在CP018中下調(diào)0.70倍。幾丁質(zhì)酶CHIT和苯丙氨酸解氨酶PAL在2個(gè)品種S1處理下的表達(dá)趨勢(shì)一致，CP018中分別上調(diào)1.25和1.04倍，CP047分別上調(diào)1.74和1.81倍，抗壞血酸過(guò)氧化物酶APX2和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶基因ACCD在2個(gè)品種中趨勢(shì)一致，分別顯著上調(diào)3.07和3.22倍（CP018）、1.62和2.78倍（CP047），且都達(dá)到了顯著差異水平；木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移/水解酶XTH22在CP018品種的S1處理下顯著上調(diào)21.66倍，在CP047中無(wú)顯著變化。TIFY11在2個(gè)品種中的S1處理下分別顯著上調(diào)5.98(CP018）和4.18倍（CP047),MYC2在CP047中顯著上調(diào)3.47倍，在CP018品種中顯著下調(diào)0.75倍。細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子ARR2和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1在2個(gè)品種中S1處理下的趨勢(shì)也是一致的，分別顯著上調(diào)1.59和1.16倍（CP018）、1.57和1.02倍（CP047）。

 

圖8 逆境相關(guān)基因的qRT-PCR分析

3討論

3.1SA引發(fā)影響了紅麻種子的發(fā)芽以及苗期對(duì)鹽脅迫的耐受性

種子引發(fā)是許多植物種類如糧食作物、某些蔬菜、花卉作物種子等的常用播前處理技術(shù)^[26]，其原理是通過(guò)控制種子的吸水作用至一定水平，允許種子在細(xì)胞膜、細(xì)胞器、DNA修復(fù)、準(zhǔn)備發(fā)芽等過(guò)程的酶活化代謝作用進(jìn)行，但防止胚根的伸出^[14]，進(jìn)而提高種子的萌發(fā)和抗逆能力。楊小環(huán)等^[27]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)引發(fā)處理可不同程度地促進(jìn)鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)，減輕幼苗的鹽害作用，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，SA引發(fā)相對(duì)于未引發(fā)顯著提高了CP018品種紅麻種子萌發(fā)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)。經(jīng)過(guò)SA引發(fā)的紅麻幼苗在鹽脅迫下的株高、干物質(zhì)積累和根長(zhǎng)的抑制率在2個(gè)品種中均達(dá)到顯著降低水平，根表面積抑制率在CP018中顯著降低，鮮重抑制率在CP047中顯著降低，且對(duì)指標(biāo)間的灰色關(guān)聯(lián)度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，根系活力、鮮重和根表面積指標(biāo)與植株干重的關(guān)聯(lián)度最大，這表明根系活力對(duì)于紅麻種子經(jīng)SA引發(fā)后在鹽脅迫下生物量積累的影響最大，這與何奇江等^[28]結(jié)果相似。而由于根系活力和根表面積的關(guān)聯(lián)度大于易于觀測(cè)的株高指標(biāo)，推測(cè)是由于SA對(duì)地下部分的影響高于地上部分的影響。

植物的耐鹽性評(píng)價(jià)是各種指標(biāo)對(duì)遭受鹽脅迫時(shí)的綜合反應(yīng)結(jié)果，而外源物質(zhì)緩解鹽害的評(píng)價(jià)亦需要多方面的驗(yàn)證。本研究中，SA引發(fā)顯著提高了紅麻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，在2個(gè)品種中分別顯著提高的株高、鮮重、干重、根長(zhǎng)、根表面積和根系活力能有效反映出SA引發(fā)對(duì)鹽脅迫的緩解作用。其中，根系活力與植株干重的灰色關(guān)聯(lián)度最高，是最能反映SA引發(fā)對(duì)鹽脅迫緩解效果的指標(biāo)，這與王立紅等^[29]結(jié)果也是一致的。

3.2SA引發(fā)改變了紅麻鹽脅迫下的抗氧化酶活

植物在逆境條件下會(huì)導(dǎo)致ROS過(guò)度積累而引起脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA是膜質(zhì)過(guò)氧化的主要副產(chǎn)物，通常被作為植物細(xì)胞受損程度的指示物^[30]。本研究中，未經(jīng)引發(fā)時(shí)鹽脅迫下紅麻葉片MDA含量上升，而經(jīng)過(guò)SA引發(fā)處理的葉片MDA含量在鹽脅迫下有所下降，在CP047中與未經(jīng)引發(fā)處理的N1具有顯著差異。SOD可將植物組織中的O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2,POD是一類氧化還原酶，它可以催化H2O2氧化胺類和酚類化合物，具有消除過(guò)量H2O2，保護(hù)細(xì)胞的作用^[8]，本研究中，SOD活性和POD活性在SA引發(fā)下都有提高，POD活性在2個(gè)品種中均顯著上調(diào)，SOD在CP047品種中顯著上調(diào)，說(shuō)明SA可能通過(guò)提高鹽脅迫下紅麻抗氧化等能力，從而緩解過(guò)量ROS對(duì)幼苗的傷害。

結(jié)合2個(gè)品種在SA引發(fā)后的發(fā)芽情況、鹽脅迫下的農(nóng)藝性狀與生理等指標(biāo)，推測(cè)在CP018品種中，0.2 mmol·L-1SA主要作用于前期發(fā)芽時(shí)期，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的顯著提高說(shuō)明SA對(duì)紅麻種子發(fā)芽情況有顯著的影響，到了苗期鹽脅迫下的株高、根長(zhǎng)、根表面積、干物質(zhì)積累量和POD活性達(dá)到了顯著水平，但鮮重、根系活力、MDA含量和SOD活性的抑制率并沒(méi)有顯著降低，推測(cè)0.2 mmol·L-1SA可能并不是CP018苗期時(shí)所需的最佳濃度；而CP047品種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)沒(méi)有達(dá)到顯著水平，苗期根長(zhǎng)、株高、干物質(zhì)積累量、鮮重、MDA含量和SOD活性的抑制率等大部分指標(biāo)達(dá)到了顯著水平，推測(cè)0.2 mmol·L-1SA在苗期對(duì)CP047品種有顯著的影響，但對(duì)種子萌發(fā)時(shí)期并不是最佳濃度。

3.3SA引發(fā)誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)參與紅麻鹽脅迫響應(yīng)

近年來(lái)，一些研究表明，外源SA可能通過(guò)影響相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控植株在鹽脅迫下的響應(yīng)^[19,23]。本研究發(fā)現(xiàn)APX2、ACCD、TIFY11在2個(gè)品種的SA引發(fā)條件下表達(dá)量顯著升高。抗壞血酸過(guò)氧化物酶APX參與響應(yīng)植物的鹽脅迫過(guò)程^[31],ACC脫氨酶基因ACCD的重要作用之一是可以抑制植物體內(nèi)乙烯的生物合成^[32]，也有研究認(rèn)為ACC脫氨酶主要參與植物根毛的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)^[33]。TIFY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的，可能參與植物應(yīng)對(duì)鹽害的過(guò)程^[34]。這些基因在2個(gè)品種中SA引發(fā)下均顯著上調(diào)表達(dá)，表明SA引發(fā)可能通過(guò)影響這些基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控紅麻對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。近年來(lái)，木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移/水解酶XTH22已被證明在調(diào)節(jié)植物高鹽脅迫方面發(fā)揮重要作用^[35]，也有研究表明外源SA可緩解高溫對(duì)XTHs基因的抑制作用^[36]，本研究中，XTH22在CP018品種中S1處理下表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明外源SA可能緩解了鹽脅迫對(duì)CP018中XTH22的抑制。MYC2和ERF.C3被證明共同參與JA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，ERF.C3在此途徑作為MYC2下游基因，植物遭受到外界刺激后激活JA信號(hào)，啟動(dòng)并級(jí)聯(lián)放大此信號(hào)，從而產(chǎn)生有效的防御機(jī)制^[37]，本研究中這兩個(gè)基因在CP047中SA處理時(shí)均顯著上調(diào)，推測(cè)這兩個(gè)基因可能在CP047品種中參與到JA信號(hào)傳遞過(guò)程以促進(jìn)植株積極應(yīng)對(duì)外界刺激。乙烯轉(zhuǎn)錄因子基因ERF9可能參與負(fù)向調(diào)節(jié)植物對(duì)低氧脅迫的響應(yīng)^[38,39]，在施加外源激素Me JA、ABA和SA時(shí)ERF9的表達(dá)在不同組織中不盡相同^[40]，推測(cè)ERF9的誘導(dǎo)表達(dá)具有時(shí)效性，且不同物種，甚至同一物種不同組織之間的表達(dá)也是有差異的，乙烯轉(zhuǎn)錄因子基因ERS1也參與到乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究中ERF9和ERS1在2個(gè)品種中的表達(dá)水平是不一致的，說(shuō)明SA引發(fā)可能對(duì)這兩個(gè)品種的ERF9和ERS1具有不同的影響。細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子ARR2可能通過(guò)作用于TGA3/NPR1依賴的SA信號(hào)通路促進(jìn)植物產(chǎn)生防御機(jī)制^[41],Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SOS參與植物抵御鹽害^[42]，苯丙氨酸解氨酶PAL和幾丁質(zhì)酶CHIT在植物應(yīng)對(duì)逆境方面具有重要作用^[43,44]，這些基因在2個(gè)品種中SA作用的鹽脅迫下均顯著上調(diào)，推測(cè)外源SA可能參與到鹽脅迫下紅麻植株中SA信號(hào)通路、鹽離子運(yùn)輸途徑以及次級(jí)代謝途徑等進(jìn)而影響植株的耐鹽性。

4結(jié)論

SA能顯著緩解鹽脅迫對(duì)紅麻幼苗生長(zhǎng)的影響，可能是由于SA引發(fā)可以提高SOD、POD等抗氧化酶活性，從而減輕過(guò)量活性氧對(duì)幼苗的傷害。SA引發(fā)導(dǎo)致一些抗逆基因差異表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控紅麻鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。

 

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文章摘自：胡亞麗,聶靖芝,吳霞,潘姣,曹珊,岳嬌,羅登杰,王財(cái)金,李增強(qiáng),張輝,吳啟境,陳鵬.水楊酸引發(fā)對(duì)紅麻幼苗耐鹽性的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2022,55(14):2696-2708.