摘  要：在植物響應紫外線 B(Ultraviolet-B，UV-B)的過程中，UV-B 光受體 UVR8(UV Resistance Locus 8)對植物的光形態(tài)建成和生長代謝等過程具有重要調(diào)控作用。為探究羅布麻屬植物 UV-B 光受體信息，該研究通過羅布麻（Apocynum venetum）和大麻狀羅布麻(A. cannabinum)全基因組數(shù)據(jù)進行 UV-B 光受體 UVR8 的篩選與生物信息學分析，同時利用轉錄組數(shù)據(jù)分析 UV-B 脅迫處理下的 UVR8 基因表達模式。結果表明：（1）羅布麻有 6個 UVR8 基因，大麻狀羅布麻有 5 個 UVR8 基因，前者分布在 1、7、9 和 11 號染色體上，后者分布在 1、8 和9 號染色體上。（2）UVR8 蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白，定位在細胞核，不存在跨膜結構和信號肽，二級結構主要由延伸鏈、無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉角構成。AvUVR8b 和 AcUVR8a 蛋白三級結構與擬南芥 UVR8(AtUVR8)最為類似，且與小?？Х?CaUVR8)和伊德斯種咖啡(CeUVR8)的親緣關系最近。該研究發(fā)現(xiàn)，羅布麻 AvUVR8b和大麻狀羅布麻 AcUVR8a 基因和蛋白結構與 AtUVR8 基因及蛋白高度相似。（3）當以一定劑量 UV-B(17.52kJ·m-2·d-1)處理兩種羅布麻植株時，AvUVR8b 和 AcUVR8a 的表達量上調(diào)。據(jù)此推測在響應 UV-B 時，AvUVR8b基因在羅布麻中起主要作用，AcUVR8a 基因在大麻狀羅布麻中起主要作用。（4）順式作用元件分析結果表明，UVR8 的表達受光照、溫度、水分、氧氣和激素等因素的調(diào)控。該研究將為進一步研究羅布麻屬 UVR8 的基因功能奠定基礎，同時為解析羅布麻屬植物適應 UV-B 的分子機制提供線索。

 

關鍵詞：羅布麻，大麻狀羅布麻，UVR8 基因，表達量分析，生物信息學分析

 

太陽光不僅是光合作用的能量來源，也是調(diào)控植物生長發(fā)育、晝夜節(jié)律、代謝物合成等的重要環(huán)境因子（Frohnmeyer et al.， 2003；Jenkins， 2014a，b）。紫外線（ultraviolet， UV）作為太陽光的組成部分，按其波長可分為長波紫外線（UV-A， 320~400 nm），中波紫外線（UV-B， 280~320 nm）和短波紫外線（UV-C， 100~280 nm）（劉明雪等，2012；陳慧澤等，2021）。UV-A 可穿過大氣層直接到達地表，但不會對生物造成顯著影響；UV-C可使大部分植物迅速死亡，但因其波長較短和穿透率差等因素，在到達地表之前就已被大氣層吸收；UV-B 大部分可被臭氧層吸收，作為生物有效輻射的 UV-B 具有雙重效應。高強度 UV-B 是逆境脅迫因子，破壞細胞的DNA、蛋白質和脂類等生物大分子，甚至導致植物死亡；低強度 UV-B 是細胞信號傳導的調(diào)控因子，對植物的光形態(tài)建成和代謝等生理過程具有重要作用（Frohnmeyer， 2003；Shamala et al.， 2020）。

早在2002年篩選對UV-B超敏感的擬南芥突變體（uvr8-1）中鑒定到了光受體UVR8（Kliebenstein et al.， 2002），并于 2011 年證實 UVR8 為感受 UV-B 的特異性光受體（Rizzini et al.， 2011）。目前，對 UVR8 結構和功能研究在擬南芥中進行的較多，研究結果表明，UVR8 蛋白為鹽橋鏈接的同源二聚體結構，其單體由 7 個片狀結構首尾相連的β螺旋縱向排列圍成的環(huán)形結構（Christie et al.， 2012；鮑思元，2016）。高度保守的 UVR8 色氨酸殘基（W）具有維持其蛋白結構穩(wěn)定、接收和傳遞 UV-B 信號等功能（Jenkins， 2014a；張宏江等，2019；Li et al.， 2020），AtUVR8 直接通過其 W233 和 W258 接收 UV-B 而無需借助其他輔助因子作為發(fā)色團（Rizzini， 2011；O'Hara et al.， 2012；Jenkins， 2014b；Yang et al.， 2018）。當植株未照射 UV-B 時，UVR8 以二聚體形式存在于細胞質；照射 UV-B 時，其鹽橋斷裂形成單體并轉移到細胞核（Wu et al.， 2012）與解離自 CUL4-DDB1(cullin4damaged DNA binding protein 1) E3 泛素連接酶的 COP1-SPA（constitutively photomorphogenic 1-suppressor of phyA-105）形成 UVR8-COP1-SPA 新復合體（Rizzini， 2011；Huang et al.， 2013；Vanesa et al.， 2019），從而減少COP1 對 HY5(Long Hypocotyl 5)的降解（Huang， 2013），同時促進 HY5、HYH(HY5 Homolog)和 MYB 等轉錄因子表達，刺激黃酮類化合物合成過程中相關酶基因的轉錄（Hartmann et al.， 2005；錢崇禎，2019；Shamala， 2020；凌成婷等，2021）。當 UVR8 介導的下游基因過度表達時啟動其負反饋機制，如激活 RUP1(repressor of UV-Bphotomorphogenesis 1)/RUP2 和 STO/BBX24（Salt Tolerance/BBX24）等轉錄（Jenkins， 2014b；Parihar et al.， 2015；李國良等，2015）。UVR8 與 RUP1/RUP2 相互作用促進其二聚體化（Cloix et al.， 2012；Hideg et al.， 2013），使 UVR8 可及時響應 UV-B 光信號。

羅布麻（Apocynum venetum）和大麻狀羅布麻（A. cannabinum）為夾竹桃科羅布麻屬多年生宿根草本或半灌木植物，具有耐旱、鹽堿、貧瘠等強抗逆性（王東清等，2012）；擁有“野生纖維之王”的美譽，其紡織物具有透氣保暖、抗靜電和紫外線防護等功能；作為藥用植物，可全株入藥，發(fā)揮降血壓、血脂、血糖和抗衰老等作用（Li et al.， 2018），其葉還可制保健茶。黃酮類化合物是羅布麻屬植物的主要藥用成分（張洋，2021），其合成途徑復雜，受內(nèi)源基因和外界環(huán)境的影響。在全球氣候變化的背景下，植物面臨著越來越嚴重的紫外線脅迫，探究植物對 UV-B 的響應機制與脅迫反應顯得極其重要。在綠藻、苜蓿、大豆和銀杏等植物中已展開對UV-B 光受體 UVR8 結構和功能的部分研究。目前，對羅布麻屬植物的研究多集中在其抗逆性、藥用成分和纖維開發(fā)利用等方面，對其 UVR8 的研究尚未有報道。本文基于兩種羅布麻的全基因組數(shù)據(jù)篩選 UVR8 基因，依托生物信息學分析，同時借助轉錄組數(shù)據(jù)探究 UVR8 基因表達模式，擬探討以下問題：（1）UVR8 基因結構、順式作用元件和染色體定位；（2）UVR8 保守結構域、蛋白結構和理化性質；（3）UVR8 磷酸化位點和系統(tǒng)進化關系等；（4）UV-B 脅迫下的 UVR8 基因表達模式。通過本研究以期進一步深入解析 UVR8 功能及其在羅布麻屬 UV-B 響應機制和藥用成分合成等方面的研究提供線索。

1材料與方法

1.1材料和數(shù)據(jù)來源

羅布麻和大麻狀羅布麻的 UVR8 基因序列和蛋白序列，均來自本實驗室前期全基因組測序工作所獲得的數(shù)據(jù)（宋立肖等，2019；宋立肖，2020），并從擬南芥（Arabidopsis thaliana）數(shù)據(jù)庫 TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）中下載 AtUVR8 蛋白序列（Protein：AT5G63860.1）。

1.2 方法

1.2.1 兩種羅布麻 UVR8 基因篩選

本研究通過羅布麻和大麻狀羅布麻全基因組的 IPRSCAN、KEGG、NR 和 Swissport 注釋結果，分別篩選出注釋到 UV-B 光受體 UVR8 的基因序列和蛋白序列。利用 BioEdit 軟件進行分析，以 AtUVR8 蛋白序列為種子序列 進 行 本 地 BLAST 比 對 ， E-value<1e-10 ， Identity ≥ 30% ， 篩 選 最 佳 UVR8 蛋 白 序 列 。 然 后 采 用Pfam(https：//pfam.xfam.org/search)和 SMART(http：//smart.emblheidelberg.de/)軟件進行結構域驗證，刪除冗余序列，最終分別獲得羅布麻和大麻狀羅布麻 UVR8 的基因序列和蛋白序列。

1.2.2 兩種羅布麻 UVR8 基因染色體定位

基于兩種羅布麻全基因組注釋文件，獲得 UVR8 基因在染色體上的位置信息，并通過軟件 MG2C（Chao et al.， 2021）(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)在線繪制 UVR8 基因染色體定位圖。

1.2.3 兩種羅布麻 UVR8 基因結構和保守結構域分析

兩種羅布麻 UVR8 基因的外顯子和內(nèi)含子位置信息分別參考基因組注釋 gff3 文件，采用 GSDS 2.0（Hu et al.， 2015）(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)工具對 UVR8 基因結構進行分析，UVR8 蛋白保守結構域利用軟件 MEME（Bailey et al.， 2009）(http：//meme-suite.org/tools/meme)進行預測。

1.2.4 兩種羅布麻 UVR8 蛋白基本理化性質分析

利用在線軟件 ExPASy（Gasteiger et al.， 2003）（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protpara）進行 UVR8蛋白的氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪族氨基酸指數(shù)等分析。

1.2.5 兩種羅布麻 UVR8 蛋白結構分析和亞細胞定位

采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）工具預測 UVR8 蛋白二級結構，以 AtUVR8 蛋白為模板，利用 Phyre2 （ Kelley et al.， 2015 ）

（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）軟件分析蛋白三級結構。通過軟件 Cell PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/CellPLoc-2/），選擇Euk-PLoc 2.0 進行 UVR8 蛋白核定位分析。

1.2.6 兩種羅布麻 UVR8 蛋白跨膜結構預測、信號肽分析和磷酸化位點分析

蛋白跨膜結構利用軟件TMHMM 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行分析，信號肽預測通過SignalP 5.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 ） 進行，并采用軟件NetPhots 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）統(tǒng)計蛋白磷酸化位點種類和數(shù)目。

1.2.7 兩種羅布麻 UVR8 基因順式作用元件分析

利用 TBtools（Chengjie et al.， 2020）軟件獲得 UVR8 基因上游 2 000 bp 序列，作為啟動子序列。通過PlantCARE(http：//bioinformatics.psd.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫對所得序列進行預測，采用 TBtools軟件繪圖，對主要順式元件的位置和數(shù)量進行分析。

1.2.8 兩種羅布麻 UVR8 蛋白系統(tǒng)進化分析

采用在線工具 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 BLASTn 進行同源性搜索，獲得兩種羅布麻 UVR8基因的同源序列。通過 MEGA 11.0 軟件構建系統(tǒng)進化樹，利用 Clustal W 進行多重序列比對，采用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）構建 UVR8 蛋白系統(tǒng)進化樹，Bootstrap method 值設為 1 000，其他參數(shù)采用系統(tǒng)默認值。通過工具 ITQ（https：//itol.embl.de）進行美化。

1.2.9 兩種羅布麻 UVR8 基因表達量分析

本實驗室于 2021 年春季在大棚內(nèi)進行兩種羅布麻的盆栽種植（林下土與營養(yǎng)土按 1∶1 混合），田間常規(guī)化管理。根據(jù) Gao 等（2019）對 UV-B 輻射劑量的等級劃分，結合寧夏銀川地區(qū)夏季晴天的 UV-B 強度和兩種羅布麻的強抗逆性，設自然光照（含 UV-B 強度約 8~11 W·m-2）為對照，在自然光照的基礎上增加 UV-B 輻射處理。對生長至 30~40 cm 的兩種羅布麻冠層上方 0.5 m 處安裝 UV-B 燈管（飛利浦 TL 100W/01），于每天早上10：00 和下午 14：00 開始各處理 4 次，每次處理時長為 10 min，每間隔 10 min 處理一次?？稍诠趯訖z測到增加的 UV-B 輻射劑量是 17.52 KJ·m-2·d-1，強度為 3.65 W·m-2（相當于銀川地區(qū)夏季晴天 UV-B 強度增加33.2%~45.6%左右）。采用 0.1 mm 的醋酸纖維膜覆蓋燈管以屏蔽 280 nm 以下的 UV-C，UV-B 強度由 Lutron 公司的 UV-340A 紫外線輻照計測得。期間分別在 UV-B 處理的第 0 天、0.5 天、1 天、4 天、7 天（d0、d0.5、d1、d4、d7）對植株上部成熟葉片進行取樣，每個樣本均為 3 個生物學重復，-80 ℃保存。本研究借助前期試驗的轉錄組數(shù)據(jù)（暫未公開）對涉及 UVR8 基因的表達量進行分析，通過 TBtools 軟件構建 UVR8 基因表達量熱圖。

2 結果與分析

2.1 兩種羅布麻 UVR8 基因篩選

通過羅布麻和大麻狀羅布麻的全基因組測序數(shù)據(jù)，分別篩選到了 10 個羅布麻 UVR8 蛋白序列和 14 個大麻狀羅布麻 UVR8 蛋白序列。以擬南芥 AtUVR8 蛋白序列為種子序列，將篩選結果進行序列比對及在線結構域分析。最終獲得 6 個羅布麻 UVR8(AvUVR8)基因序列和 5 個大麻狀羅布麻 UVR8(AcUVR8)基因序列，分別命名為AvUVR8a、AvUVR8b、AvUVR8c、AvUVR8d、AvUVR8e、AvUVR8f 和 AcUVR8a、AcUVR8b、AcUVR8c、AcUVR8d、AcUVR8e。

表1 兩種羅布麻 UVR8 基因測序序列識別號和基因 ID

  

2.2 兩種羅布麻 UVR8 基因染色體定位

兩種羅布麻的全基因組各有 11 條染色體，采用 MG2C 軟件繪制 UVR8 基因染色體定位圖，分析結果（圖 1）顯示，UVR8 基因間無串聯(lián)重復現(xiàn)象，大麻狀羅布麻 AcUVR8 基因不均勻地分布在 3 條染色體上，其中 AcUVR8e分布在 8 號染色體，1 和 9 號染色體則各分布有 2 個 AcUVR8 基因，分別是 AcUVR8b 和 AcUVR8c，AcUVR8a和 AcUVR8d；羅布麻 AvUVR8 基因分布在 4 條染色體上，其中 AvUVR8d 和 AvUVR8c 分別分布在 7 和 11 號染色體，1 和 9 號染色體則各分布有 2 個 AvUVR8 基因，分別是 AvUVR8f 和 AvUVR8a，AvUVR8b 和 AvUVR8e。

  

圖1 兩種羅布麻 UVR8 基因的染色體定位

2.3 兩種羅布麻 UVR8 基因結構和蛋白保守結構域分析

通過兩種羅布麻基因組注釋 gff3 文件，采用 GSDS 2.0 軟件對 UVR8 基因結構進行分析。結果表明，UVR8基因皆含上、下游非編碼區(qū)、內(nèi)含子和外顯子，但基因長度不同，外顯子數(shù)也存在差異（圖 2）。AvUVR8 基因長度為 5 115~12 672 bp，外顯子數(shù)在 6~16 個，其中 AvUVR8c 外顯子數(shù)最高（16 個），AvUVR8a 外顯子數(shù)最低（6 個）；AcUVR8 基因長度為 5 876~11 585 bp，AcUVR8 外顯子數(shù)在 6~15 個，其中 AcUVR8d 外顯子數(shù)最高（15個），AcUVR8b 外顯子數(shù)最低（6 個）。此外，利用 MEME 軟件分析 UVR8 蛋白保守結構域（motif），motif設為 7，其他參數(shù)為默認值。結果（圖 3）顯示，AvUVR8 的 motif 數(shù)為 4~7 個，其中 AvUVR8b、AvUVR8e 和AvUVR8f 的 motif 數(shù)最多（7 個），AvUVR8c motif 數(shù)最少（4 個）；AcUVR8 的 motif 數(shù)為 6~7 個，其中 AcUVR8b的 motif 數(shù)最少（6 個），其他 4 個 AcUVR8 則各有 7 個 motif。同種羅布麻的 UVR8 motif 之間存在一定差異，但兩種羅布麻的 UVR8 之間具有一定相似性，如 AvUVR8a 與 AcUVR8b，AvUVR8b 與 AcUVR8a，AvUVR8e與 AcUVR8d，AvUVR8f 與 AcUVR8c motif 的數(shù)目、位置和氨基酸組成等兩兩相似。

   

2.4 兩種羅布麻 UVR8 蛋白質理化性質分析

采用 ExPASy 工具對 UVR8 蛋白理化性質進行預測，結果（表 2）表明，AvUVR8 蛋白長度為 420~534 aa，相對分子質量在 45 846.10~56 827.20 Da，理論等電點在 5.55~8.41 之間。其中 AvUVR8c 的氨基酸數(shù)、相對分子質量和等電點最高，分別為 534 aa、56 827.20 Da 和 8.41；AvUVR8d 的氨基酸數(shù)和相對分子質量最小，分別為420 aa 和 45 846.10 Da。當?shù)鞍撞环€(wěn)定指數(shù)>40 時，判定該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；當?shù)鞍撞环€(wěn)定指數(shù)<40 時，判定該蛋白為穩(wěn)定蛋白（夏巧玉，2007）。AvUVR8 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)皆小于 40，為不穩(wěn)定蛋白，其中 AvUVR8b的不穩(wěn)定指數(shù)最高（38.89），AvUVR8d的不穩(wěn)定指數(shù)最低（31.12）。AvUVR8 蛋白脂肪族氨基酸指數(shù)在 63.50~85.17之間，親水性平均值在-0.629~-0.134 之間且小于 0，為親水性蛋白。僅 AvUVR8a、AvUVR8b 和 AvUVR8f 等電點<7，為酸性蛋白，其余 3 個為堿性蛋白。

AcUVR8 蛋白長度為 388~488 aa，相對分子質量在 41 778.96~53 233.19 Da，理論等電點在 5.42~8.08 之間。其中 AcUVR8b 的氨基酸數(shù)、相對分子質量和等電點最高，分別為 488 aa、53 233.19 Da 和 8.08；AcUVR8e 的氨基酸數(shù)、相對分子質量和等電點最小，分別為 388 aa、41 778.96 Da 和 5.42。AcUVR8 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)皆小于 40，為不穩(wěn)定蛋白，其中 AcUVR8a 的不穩(wěn)定指數(shù)最高（37.70），AvUVR8b 的不穩(wěn)定指數(shù)最低（31.56）。AcUVR8 蛋白脂肪族氨基酸指數(shù)在 77.74~82.42 之間，親水性平均值在-0.047~-0.275 之間且小于 0，為親水性蛋白。僅 AcUVR8b 和 AcUVR8d 等電點>7，為堿性蛋白，其余 3 個為酸性蛋白。

表2 兩種羅布麻 UVR8 蛋白理化性質

  

2.5 兩種羅布麻 UVR8 蛋白結構分析和亞細胞定位

利用 SOPMA 軟件分析 UVR8 蛋白二級結構，結果表明，UVR8 蛋白二級結構由α-螺旋(alpha helix)、β-轉角（beta turn）、延伸鏈（extended strand）和無規(guī)則卷曲（random coil）4 部分組成（表 3，圖 4）。其中無規(guī)則卷曲占比最高（45.49%~58.05%），其次為延伸鏈（22.28%~28.04%），β-轉角占比最低（7.40%~9.90%），可見延伸鏈、無規(guī)則卷曲和α-螺旋結構為 UVR8 蛋白二級結構的主要組成部分。另外，本研究通過 Cell PLoc 2.0在線軟件，選擇 Euk-PLoc 2.0 對 UVR8 蛋白進行核定位預測，結果顯示 UVR8 蛋白皆定位在細胞核。

表3 兩種羅布麻 UVR8 蛋白二級結構組成

   

以 AtUVR8 蛋白為模板，采用軟件 Phyre2 預測 UVR8 蛋白三級結構。發(fā)現(xiàn)僅 AvUVR8b 和 AcUVR8a 三級結構同 AtUVR8 相似，單體由 7 個完整的 RCC1 保守基序形成七葉β-折疊結構，而其他 UVR8 蛋白結構因 RCC1保守基序不完整或缺少，無法形成完整的七葉β-折疊結構，表明 AvUVR8b 和 AcUVR8a 在植株響應 UV-B 時發(fā)揮重要作用（圖 5）。

  

2.6 兩種羅布麻 UVR8 蛋白跨膜結構預測、信號肽分析和磷酸化位點分析

UVR8 蛋白跨膜結構利用軟件 TMHMM 2.0 進行分析，信號肽預測采用 SignalP 5.0 軟件，并通過工具NetPhots 3.1 分析蛋白磷酸化位點。UVR8 磷酸化位點預測結果顯示，AvUVR8 存在 35~50 個磷酸化位點，其中有 13~31 個絲氨酸（serine）位點，10~19 個蘇氨酸（threonine）位點和 4~8 個酪氨酸（tyrosine）位點（圖 6）。其中 AvUVR8a 磷酸化位點數(shù)最高（50 個），AvUVR8d 磷酸化位點數(shù)最低（35 個）。AcUVR8 存在 31~51 個磷酸化位點，其中有 12~31 個絲氨酸位點，10~17 個蘇氨酸位點和 2~8 個酪氨酸位點。其中 AcUVR8 磷酸化位點數(shù)最高（51 個），AvUVR8d 磷酸化位點數(shù)最低（31 個）。另外，預測結果表明兩種羅布麻 UVR8 蛋白不存在跨膜結構和信號肽。

  

2.7 兩種羅布麻 UVR8 基因順式作用元件分析

本研究通過 PlantCARE 軟件對 UVR8 基因編碼區(qū)上游 2 000 bp 序列進行順式作用元件分析，結果（圖 7）顯示，除了基礎性元件（TATA-box 和 CAAT-box 等）之外，UVR8 基因順式作用元件主要涉及光誘導、激素反應、逆境脅迫響應、生長發(fā)育響應等。其中，光誘導元件數(shù)量最多（117 個），主要包括 ATC-motif、Box 4、I-box、TCT-motif、GA-motif、GT1-motif、G-box、AT1-motif、ACE 等元件；其次為激素反應元件（44 個），主要有參與赤霉素反應的 TATC-box、GARE-motif 和 P-box，響應茉莉酸甲酯的 CGTCA-motif 和 TGACG-motif，介導水楊酸反應的 TCA-element，涉及脫落酸反應的 ABRE 及與生長素反應相關的 TGA-element；響應逆境脅迫元件（38 個）主要有響應厭氧反應的 ARE，涉及傷口反應的 WUN-motif，參與干旱反應的 MBS，有關低溫脅迫的 LTR 及參與防御和壓力反應的 TC-rich repeats；生長發(fā)育響應元件數(shù)量最少（18 個），主要涉及晝夜節(jié)律調(diào)控元件 circadian，分生組織表達元件 CAT-box，胚乳表達元件 GCN4-motif 和調(diào)節(jié)玉米蛋白代謝的 O2-site元件。以上說明兩種羅布麻 UVR8 基因的表達不僅受光照的影響，還受到溫度、水分、氧氣和內(nèi)源激素等因素的調(diào)控。

  

2.8 兩種羅布麻 UVR8 蛋白系統(tǒng)進化分析

UV-B 光受體 UVR8 最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥（Kliebenstein， 2002），并陸續(xù)在其他植物中發(fā)現(xiàn)。為進一步探究兩種羅布麻 UVR8 蛋白系統(tǒng)進化關系，本研究通過 NCBI 軟件的 BLASTn 進行同源性搜索并下載了 42 種植物的UVR8 基因序列，涉及 94 條 UVR8 基因。借助軟件 MEGA 11.0 的 Clustalw 進行多重序列比對，并采用鄰接法構建 UVR8 蛋白系統(tǒng)進化樹。分析結果顯示，聚類樹分為 3 個亞族，兩種羅布麻的 UVR8 蛋白分布在兩個亞族上，其中 AvUVR8a 和 AcUVR8b 未與 AtUVR8 共處同一亞族且單獨占一亞族，說明其與 AtUVR8 的親緣關系存在一定差距；AvUVR8b 和 AcUVR8a 聚集在一處且與小?？Х龋–aUVR8）和伊德斯種咖啡（CeUVR8）的親緣關系最近，其次與甘菊（ClUVR8）、雷公藤（TwUVR8）、澳洲堅果（MiUVR8）、三裂葉薯（ItUVR8）和牽牛（InUVR8）的親緣關系較近；在兩種羅布麻 UVR8 蛋白主要聚集處，其與擬南芥（AtUVR8）和棗（ZjUVR8）的親緣關系最近，其次與可可（TcUVR8）、榴蓮（DzUVR8）、木槿（HsUVR8）、陸地棉（GhUVR8）、樹棉（GaUVR8）和美洲棉（GrUVR8）的親緣關系較近（圖 8）。說明在兩種羅布麻 UVR8 蛋白主要聚集的亞族上，各物種間 UVR8 蛋白存在明顯的同源關系。

  

. 圖8 UVR8 蛋白系統(tǒng)進化樹

2.9 兩種羅布麻 UVR8 基因表達量分析

利用 TBtools 軟件構建 UV-B 脅迫處理下的 UVR8 基因表達量熱圖，其中 d0 為對照組，羅布麻苗在 0 和 0.5d 處理后，觀測到的表型變化和觀測數(shù)據(jù)不明顯，故對兩組數(shù)據(jù)進行合并處理。結果顯示，在羅布麻中，AvUVR8b、AvUVR8c 和 AvUVR8e 表達量均上調(diào)，其中 AvUVR8b 在 d7 時最高；AvUVR8e 在 d1 時最高，隨后下降；AvUVR8c呈上升趨勢。AvUVR8a、AvUVR8d 和 AvUVR8f 表達量均下調(diào)，其中 AvUVR8a 在 d1 時最高，d4 時最低；AvUVR8d在 d0 時最高，d7 時最低；AvUVR8f 在 d1 時最高，d7 時最低（圖 9）。在大麻狀羅布麻中，AcUVR8a 和 AcUVR8b表達量均上調(diào)，其中 AcUVR8a 呈上升趨勢，AcUVR8b 在 d0.5 時最高。AcUVR8c 和 AcUVR8d 表達量波動較大，其中 AcUVR8c 下降，但從 d0.5 開始呈上升趨勢，其在 d0.5 時最低，d7 時最高；AcUVR8d 在 d1 時最高，d0.5時最低。AcUVR8e 表達量下調(diào)，在 d0 時最高，d4 時最低（圖 10）。表明在植物響應 UV-B 脅迫的過程中，AvUVR8b、AvUVR8c 和 AvUVR8e 在羅布麻中起重要作用；AcUVR8a 和 AcUVR8b 在大麻狀羅布麻中起重要作用。

  

3 討論與結論

隨著人類社會的發(fā)展，臭氧層變薄導致地表 UV-B 增強（Caldwell et al.， 1989），從而影響植物的光合作用速率、代謝和生態(tài)等作用（鮑思元，2016），繼而對生長發(fā)育及作物產(chǎn)量等造成威脅。UVR8 作為 UV-B 的特異性光受體，研究其結構、功能及 UV-B 響應機制等對作物來說是必要的（Wargent et al.， 2013）。在 UV-B 下，uvr8-1 突變體對黃酮類化合物和花青素合成關鍵基因的誘導下降，查爾酮合酶 mRNA 和蛋白表達不再上調(diào)（Kliebenstein， 2002）。當 UVR8 過表達時 UV-B 介導的光形態(tài)建成更顯著，對 UV-B 的適應和耐受能力增強（Favory et al.， 2009）。研究發(fā)現(xiàn)，UVR8 在響應 UV-B 的過程中通過調(diào)控多項生命活動提高植株的適應性和抗逆性（Jenkins， 2014b；Vandenbussche et al.， 2014），其中低劑量 UV-B 輻射抑制下胚軸和根的生長（Frohnmeyer， 2003；Wellmann， 1976），同時促進 UV-B“防曬劑”黃酮類化合物合成等以增強適應性（Winkel-Shirley， 2002；Hartmann et al.， 2005；Gruber et al.， 2010），UV-B 損傷修復主要體現(xiàn)在抗氧化系統(tǒng)和酶修復 DNA 損傷（Jenkins， 2014b）。這為研究羅布麻屬 UVR8 功能及 UV-B 調(diào)控網(wǎng)絡提供線索。

本研究通過羅布麻和大麻狀羅布麻全基因組數(shù)據(jù)篩選 UVR8 蛋白序列，以 AtUVR8 蛋白為種子序列進一步篩選，最終獲得 6 個羅布麻 UVR8 基因和 5 個大麻狀羅布麻 UVR8 基因，并對其進行生物信息學分析，同時利用 UV-B 脅迫處理數(shù)據(jù)分析 UVR8 基因表達模式。研究結果顯示，UVR8 基因不均勻地分布在多條染色體上，且不存在串聯(lián)重復現(xiàn)象。并發(fā)現(xiàn)同一物種的 UVR8 (AvUVR8 或 AcUVR8)蛋白序列存在一定差異，但 AvUVR8 和AcUVR8 之間具有相似性，如 AvUVR8a 與 AcUVR8b，AvUVR8b 與 AcUVR8a 等蛋白保守基序的數(shù)目、位置和種類高度相似。有研究報道，不同物種 UVR8 蛋白的關鍵氨基酸殘基數(shù)目和位置高度相似，暗示 UVR8 蛋白在進化上相對保守（Yang et al.， 2018），即光合生物的紫外線防護作用具有相似的分子功能（Rizzini， 2011）。在本研究中，UVR8 蛋白二級結構組成相似，但環(huán)形三級結構并不完全相同。其中 AvUVR8b 和 AcUVR8a 的三級結構同 AtUVR8 最接近，單體由 7 個完整的 RCC1 保守基序形成七葉β-折疊結構，與報道的 UVR8 結構研究一致（Jenkins， 2014a；鮑思元，2016；張宏江，2019）。而其他 UVR8 蛋白可能在進化過程中逐漸退化，導致 RCC1保守基序不完整或缺少，無法形成完整的七葉β-折疊結構，表明 AvUVR8b 和 AcUVR8a 在響應 UV-B 時可能發(fā)揮主要作用。在兩種羅布麻 UVR8 蛋白磷酸化中，以絲氨酸修飾為主，并涉及蘇氨酸和酪氨酸修飾。且 UVR8蛋白為不穩(wěn)定性親水蛋白，不存在信號肽和跨膜結構，與雨生紅球藻、水稻等其他物種的 UVR8 研究結果相同（鮑思元，2016；張宏江，2019）。有研究表明，親水蛋白含有大量親水氨基酸，過表達時有利于提高植物耐旱、低溫和高鹽等抗逆性（劉盈盈，2019），說明 UVR8 可能參與植物的抗逆過程。

UVR8蛋白系統(tǒng)進化樹主要分為三個亞族，除AvUVR8a和AcUVR8b單獨處一亞族外，其余的AvUVR8和AcUVR8與擬南芥聚集于同一亞族。在AvUVR8/AcUVR8主要集聚處其與擬南芥（AtUVR8）和棗（ZjUVR8）的親緣關系最近，而聚集在該亞族中部的AvUVR8b和AcUVR8a與小粒咖啡（CaUVR8）和伊德斯種咖啡（CeUVR8）的親緣關系最近。表明在兩種羅布麻UVR8主要聚集的亞族上，物種間具有明顯的同源關系。順式作用元件序列位于基因上游通過與轉錄因子結合的方式調(diào)控基因表達，涉及啟動子、增強子、調(diào)控元件和誘導元件等（劉賀等，2022）。本研究通過UVR8基因順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)UVR8基因的表達不僅受光照影響，還受到溫度、水分、氧氣和內(nèi)源激素等因素的調(diào)控，說明UVR8基因參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和抗逆過程。研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)腢V-B輻射劑量對植物生長發(fā)育、品質改善、增強保鮮和抵抗逆境脅迫等存在積極調(diào)控作用（Jenkins， 2009；劉一諾等，2020）。在UV- B預處理后，番茄中超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT) 的基因表達和酶活性顯著升高。當UVR8功能沉默時UV-B激活的SOD和CAT基因表達下調(diào)，抑制UV-B緩解的氧化應激和冷害。表明UVR8參與UV-B誘導的耐寒性，抗氧化酶活性依賴于UVR8（Jiang et al.， 2022）。在UV-B脅迫下的基因表達模式分析中，我們發(fā)現(xiàn)AvUVR8b、AvUVR8c、AvUVR8e、AcUVR8a和AcUVR8b基因表達量上調(diào)，其中AvUVR8c和AcUVR8a表達量隨處理時長的增加呈遞增趨勢，表明這些基因參與植物響應UV-B的過程。

綜上所述，AvUVR8b和AcUVR8a蛋白結構、保守基序等與AtUVR8的相關信息最接近，且在UV-B脅迫下其基因表達量上調(diào)。推測在植物響應UV-B的過程中，AvUVR8b在羅布麻中起主要作用，AcUVR8a在大麻狀羅布麻中起主要作用。以AvUVR8b和AcUVR8a作為重點研究對象，將展開后續(xù)UVR8基因功能分析和UV-B脅迫反應研究，為今后深入探究羅布麻屬UVR8響應UV-B的分子機制和調(diào)控網(wǎng)絡等研究提供線索。

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文章摘自：車金鳳，張慶，李國旗，謝博勛，解盛，趙長海，張柯雨，劉星.羅布麻和大麻狀羅布麻UV-B光受體UVR8基因的鑒定及表達分析[J/OL].廣西植物：1-15[2022-12-06].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1134.Q.20221122.2005.002.html