摘 要：本研究以漢麻分離蛋白（Hemp Protein Isolate，HPI）為原料，通過超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì)HPI進(jìn)行改性，以溶解度和水解度為判定指標(biāo)篩選酶解改性反應(yīng)最佳條件，并探究超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì)酶解產(chǎn)物溶解性、起泡性、乳化性、持水性、持油性的影響。結(jié)果表明，HPI酶解反應(yīng)最適條件為：加酶量（復(fù)合蛋白酶）5000U/g、酶解改性pH8.0、酶解改性溫度55℃、酶解改性時(shí)間50min。以HPI為對(duì)照，當(dāng)壓力為200MPa時(shí)，酶解產(chǎn)物的溶解度、起泡性、乳化性、持油性最高，壓力為100MPa時(shí)，泡沫穩(wěn)定性最好，酶解后的乳化穩(wěn)定性存在不同程度的下降，壓力為0.1MPa時(shí)其持水性達(dá)到最大值。綜上所述，超高壓技術(shù)能夠有效促進(jìn)HPI的酶解改性反應(yīng)，且壓力為200MPa時(shí)，酶解產(chǎn)物的理化性質(zhì)最好。
關(guān)鍵詞：漢麻分離蛋白（HPI），超高壓（UHP），酶解，理化性質(zhì)
漢麻（Cannabis sativa L.），又名火麻、大麻等，在我國(guó)是一種傳統(tǒng)的藥食同源桑科植物，由漢麻葉、籽、莖稈等部分組成[1]，漢麻籽中富含的漢麻分離蛋白（hemp protein isolate，HPI）氨基酸種類及含量豐富，消化率高且致敏性低，具有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、降血糖、維持腸道菌群平衡等作用，是一種極具價(jià)值的多功效植物蛋白資源[2，3]。但漢麻蛋白質(zhì)溶解度較低，功能性質(zhì)較差[9]，導(dǎo)致其難以作為原輔料應(yīng)用于食品及營(yíng)養(yǎng)保健品生產(chǎn)中，因此，有必要通過某些技術(shù)手段改善其功能特性以更好的開發(fā)利用漢麻蛋白，提升其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
目前，常用的蛋白質(zhì)改性技術(shù)有物理改性技術(shù)、化學(xué)改性技術(shù)、酶解改性技術(shù)等，其中物理改性技術(shù)如熱處理易產(chǎn)生熱聚集使蛋白質(zhì)的利用率降低，化學(xué)改性技術(shù)會(huì)使得酸堿試劑有殘留，降低蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不利于消化吸收。酶解改性技術(shù)主要是指利用蛋白酶在適宜條件下水解蛋白質(zhì)使肽鍵斷裂，導(dǎo)致可電離基團(tuán)數(shù)量增加、被掩蓋的疏水片段暴露，從而改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[4]。酶解反應(yīng)過程十分溫和、副產(chǎn)物較少且無毒、蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值破壞程度小，改性后蛋白質(zhì)與原始蛋白質(zhì)相比，具有更低的分子量和更好的功能特性。此外，酶解之后產(chǎn)生的多肽還具有一定的生物活性，如降血壓、降血糖、抗氧化活性等，因此酶解改性是改善蛋白質(zhì)功能特性的首選方法[5，6]。但酶解改性同時(shí)也存在酶解過程隨機(jī)、酶利用率低和酶解效率低等問題[10]。故有必要尋找能夠解決酶解反應(yīng)上述問題的技術(shù)方法，從而擴(kuò)大酶解改性技術(shù)的應(yīng)用范圍。
超高壓技術(shù)（Ultra-High Pressure processing，UHP）是指將待處理物品置于高壓腔體中，在一定溫度和時(shí)間范圍內(nèi)，以水為介質(zhì)傳遞壓力進(jìn)行高壓（100-1000MPa）處理，使食品中蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)變性或微生物滅活，以達(dá)到改變理化和功能特性、滅菌保藏、延長(zhǎng)產(chǎn)品保存期等目的[7，8]。故超高壓技術(shù)可促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和酶解作用的發(fā)生，從而達(dá)到改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)、提高酶解效率的目的[11]。關(guān)海寧[12]等人利用超高壓協(xié)同酶法制備不同分子量大豆分離蛋白水解肽，其乳化性及抗氧化性均得到顯著提高。
本研究以漢麻分離蛋白酶解改性為支撐點(diǎn)，輔助以超高壓技術(shù)，著重研究漢麻分離蛋白高效的改性措施，旨在獲得更加優(yōu)質(zhì)的漢麻蛋白質(zhì)產(chǎn)品，為漢麻蛋白產(chǎn)品的深度研發(fā)與應(yīng)用提供相關(guān)的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持，對(duì)植物蛋白質(zhì)資源的高值化利用具有深遠(yuǎn)意義。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
漢麻分離蛋白（96%）食品級(jí)黑龍江省大慶市星火牧場(chǎng)；復(fù)合蛋白酶（100000U/g桿菌蛋白酶復(fù)合體，主酶是堿性蛋白酶）試劑級(jí)北京Solarbio科技有限公司；堿性蛋白酶（200000U/g）試劑級(jí)北京Solarbio科技有限公司；木瓜蛋白酶（100000U/g）試劑級(jí)北京Solarbio科技有限公司；中性蛋白酶（200000U/g）試劑級(jí)北京Solarbio科技有限公司；胰蛋白酶（250NFU/mg）試劑級(jí)北京Solarbio科技有限公司；氫氧化鈉分析純天津凱通化學(xué)試劑有限公司；鹽酸分析純天津凱通化學(xué)試劑有限公司；甲醛溶液分析純寶雞正源化工科技股份有限公司；大豆油食品級(jí)九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司。
HHP-400超高壓設(shè)備沈陽人和機(jī)電工程設(shè)備有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；Sartorius BSA223S型電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PHS-3C型pH計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司；DF-1集熱式磁力攪拌器金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；T50高速剪切機(jī)德國(guó)IKA公司；721型分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司；UVS-4型漩渦振蕩儀濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī)美國(guó)SIM公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 漢麻分離蛋白酶解改性工藝
配制50g/L的漢麻蛋白溶液，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至最適值。隨后加入蛋白酶與上述溶液混勻，將此蛋白溶液密封在聚氯乙烯袋中，放入HHP-400超高壓設(shè)備中于不同壓力（0.1~300MPa）下，在設(shè)定溫度中進(jìn)行酶解改性反應(yīng)單因素試驗(yàn)，以溶解度及水解度為判定指標(biāo)，篩選出最適酶解反應(yīng)條件。水解物經(jīng)FD5-3型冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干得到蛋白樣品。
1.2.2 酶解反應(yīng)條件篩選單因素試驗(yàn)
1.2.2.1 蛋白酶選擇
選用以下五種蛋白酶分別在各自最適條件下對(duì)漢麻分離蛋白進(jìn)行酶解改性40min，反應(yīng)完成后滅酶處理（85℃水浴30min），測(cè)定其水解度及溶解度以篩選酶解改性反應(yīng)最佳酶制劑。
表1 不同蛋白酶的酶解條件
1.2.2.2加酶量確定
固定改性pH7.5，改性溫度55℃，改性時(shí)間40min，在不同壓力（0.1~300MPa）下酶解，探究不同加酶量（2000、3000、4000、5000、6000U/g）對(duì)溶解度及水解度的影響。
1.2.2.3酶解改性pH確定
固定改性溫度55℃，改性時(shí)間40min，加酶量5000U/g，在不同壓力（0.1~300MPa）下酶解，探究不同改性pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對(duì)溶解度及水解度的影響。
1.2.2.4酶解改性溫度確定
固定改性pH8.0，改性時(shí)間40min，加酶量5000U/g，在不同壓力（0.1~300MPa）下酶解，探究不同改性溫度（45、50、55、60、65℃）對(duì)溶解度及水解度的影響。
1.2.2.5酶解改性時(shí)間確定
固定改性pH8.0，改性溫度55℃，加酶量5000U/g，在不同壓力（0.1~300MPa）下酶解，探究不同改性時(shí)間（20、30、40、50、60min）對(duì)溶解度及水解度的影響。
1.2.3水解度測(cè)定
參考文獻(xiàn)[13]方法，略有改動(dòng)。取5mL漢麻分離蛋白水解液與60mL蒸餾水于燒杯中混合均勻，用0.05mol/L NaOH標(biāo)液滴定至pH為8.2；加入10mL中性甲醛溶液與上述溶液混勻，再用0.05mol/L NaOH標(biāo)液滴至pH9.2，記錄消耗NaOH的量。將蛋白質(zhì)水解液換成等量蒸餾水作為空白試驗(yàn)，總氮含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]。氨基氮含量及水解度含量計(jì)算公式如下：
式中：X表示氨基氮含量，g/mL；V1表示酶解液加甲醛溶液后滴至pH9.2時(shí)NaOH消耗量，mL；Vo表示空白加甲醛溶液后滴至pH9.2時(shí)NaOH消耗量，mL；V表示取樣體積，mL；C表示NaOH標(biāo)液摩爾濃度，mol/L；0.014表示與1mL NaOH標(biāo)定溶液[CNaOH=1mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；X1表示總氮含量，g/mL。
1.2.4溶解度測(cè)定
參考文獻(xiàn)[14]方法，略有改動(dòng)。稱取0.5g經(jīng)冷凍干燥的蛋白質(zhì)樣品于燒杯中，加入50mL蒸餾水，利用0.5mol/L NaOH溶液和0.5mol/LHCI溶液調(diào)節(jié)溶液pH為2.0-10.0，25℃恒溫?cái)嚢?0min，移入離心管中，4000r/min離心10min后收集上清液，利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，總蛋白含量通過凱氏定氮法測(cè)定。通過以下公式計(jì)算溶解度：
式中：X表示上清液蛋白質(zhì)量，g/mL；X1表示樣品中總蛋白質(zhì)量，g/mL。
1.2.5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)定
蛋白起泡性（FAI）及泡沫穩(wěn)定性（FSI）測(cè)定參考Agyare[15]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。稱取1g凍干蛋白質(zhì)樣品置于離心管中，加入50mL蒸餾水，記總體積為V0，然后使用高速剪切機(jī)10000r/min均質(zhì)2min，迅速倒入帶有刻度的量筒中，量取總體積記為V1，均質(zhì)停止30min后再次量取總體積，記為V2。利用下列公式計(jì)算起泡性及泡沫穩(wěn)定性：
式中：V0表示起始溶液在量筒中的高度，mL；V1表示經(jīng)高速均質(zhì)后液體總高度，mL；V2表示高速均質(zhì)停止30min后液體總高度，mL。
1.2.6乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定
蛋白乳化性（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI）測(cè)定參考Pearce等人[16]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。配制1%的蛋白質(zhì)樣品溶液與食用大豆油以3：1的比例混勻，使用高速剪切機(jī)10000r/min均質(zhì)2min形成均勻乳狀液，立即吸取100μL，加入5mL 0.1%SDS溶液，500nm處測(cè)定吸光值記為A0，靜置10min后同樣測(cè)定吸光值記為A10。利用下列公式計(jì)算乳化性及乳化穩(wěn)定性：
式中：T表示渾濁度，2.303；C表示蛋白質(zhì)溶液原始濃度，g/mL；Ø表示溶液中油的體積分?jǐn)?shù)（0.25）；N表示稀釋倍數(shù)；A0表示0min時(shí)的吸光值。
式中：A0表示0min時(shí)的吸光值；A10表示10min時(shí)的吸光值。
1.2.7 持水性測(cè)定
蛋白質(zhì)持水性測(cè)定參考Wang等人[17]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。稱1g凍干蛋白質(zhì)樣品于離心管中，加入30mL蒸餾水于漩渦振蕩儀上振勻，靜置20min后，25℃下離心（6000r/min）10min，對(duì)沉淀樣品稱重，利用下列公式計(jì)算持水性：
式中：W1表示離心后殘留物質(zhì)量，g；W0表示樣品質(zhì)量，g。
1.2.8 持油性測(cè)定
蛋白持油性測(cè)定參考Chen等人[18]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。稱1g凍干蛋白質(zhì)樣品于離心管中，加入10mL大豆油，于漩渦振蕩儀上振勻，25℃下離心（6000r/min）10min，對(duì)沉淀樣品稱重，利用下列公式計(jì)算持油性：
式中：M1表示離心后殘留物質(zhì)量，g；M0表示樣品質(zhì)量，g。
1.3數(shù)據(jù)處理
采用IBM SPSSS tatistics26進(jìn)行顯著性分析（P<0.05）；利用Statistic8、Origin 2019 Pro軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及繪圖，所有實(shí)驗(yàn)組均進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 漢麻分離蛋白超高壓輔助酶解反應(yīng)最適條件研究
2.1.1 蛋白酶選擇
本實(shí)驗(yàn)選擇復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶對(duì)漢麻分離蛋白在各自最適酶解pH和溫度下進(jìn)行酶解反應(yīng)，以溶解度及水解度為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選最佳酶制劑，其結(jié)果如下表2所示。
表2 不同蛋白酶對(duì)HPI改性效果影響
2.1.2加酶量確定
不同加酶量在不同壓力下對(duì)HPI溶解度的影響如圖1（a）所示，由圖可知，隨著復(fù)合蛋白酶用量增加，HPI水解產(chǎn)物溶解度逐漸增大，當(dāng)加酶量超過5000U/g時(shí)，溶解度稍有下降，可能是隨著酶量增加，酶與底物結(jié)合更加充分，水解反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)為溶解度的上升，而繼續(xù)增加酶量時(shí)，酶與蛋白質(zhì)作用會(huì)產(chǎn)生一部分疏水性多肽，而溶解度的下降可能是疏水性多肽的形成引起的[20]。當(dāng)壓力達(dá)到100、200或300MPa時(shí)，酶解產(chǎn)物溶解度在不同加酶量下均高于0.1MPa，在200MPa時(shí)具有最大值，可推測(cè)出HPI酶解反應(yīng)在壓力超過200MPa時(shí)受到抑制，是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)某邏禾幚硎沟鞍踪|(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)變得伸展、暴露更多酶切位點(diǎn)，促進(jìn)酶解反應(yīng)進(jìn)行，使可溶性蛋白含量增多，而當(dāng)壓力到達(dá)300MPa時(shí)，過高的壓力使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生了聚集或者酶活性降低，抑制了酶解反應(yīng)[21]，導(dǎo)致溶解度下降。
不同加酶量在不同壓力下對(duì)HPI水解度的影響如圖1（b）所示，由圖可知，HPI水解產(chǎn)物水解度隨酶量增加先明顯上升后緩慢上升，說明酶用量增加可以增大酶解程度[22]，但在這個(gè)過程中，蛋白酶逐漸趨向飽和，因此水解度隨后上升緩慢。與溶解度變化趨勢(shì)一致，水解度在200MPa時(shí)達(dá)到最大值。綜上，選擇5000U/g為HPI酶解改性反應(yīng)最適加酶量。
2.1.3 酶解反應(yīng) pH 確定
不同酶解反應(yīng)pH在不同壓力下對(duì)HPI溶解度的影響如圖2（a）所示，隨著pH的增加，不同壓力下HPI水解物溶解度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在pH為8.0時(shí)溶解度達(dá)到最大，原因可能與復(fù)合蛋白酶酶解最佳酸堿環(huán)境有關(guān)，當(dāng)pH過大或過小時(shí)，會(huì)引起酶構(gòu)象的改變且影響酶分子活性部分上有關(guān)基團(tuán)的解離，導(dǎo)致蛋白酶活性減弱，不利于酶作用于底物使可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)生[23]。壓力影響方面，不同pH下溶解度均在200MPa時(shí)達(dá)到最大值。
不同酶解反應(yīng)pH在不同壓力下對(duì)HPI水解度的影響如圖2（b）所示，當(dāng)壓力為200MPa時(shí)蛋白質(zhì)水解度達(dá)到最大，顯著高于其他壓力條件下的水解度（P<0.05），主要是由于超高壓處理可促進(jìn)酶解反應(yīng)進(jìn)行，有效提高水解效率，而壓力過大則會(huì)減弱酶活性以及對(duì)酶解反應(yīng)起到抑制作用[24]，從而使水解度有所降低。當(dāng)pH為8.0時(shí)，在不同壓力作用下水解度均達(dá)到最大值。綜上，選擇pH8.0為HPI酶解改性反應(yīng)最佳pH值。
2.1.4 酶解反應(yīng)溫度的確定
不同酶解反應(yīng)溫度在不同壓力下對(duì)HPI溶解度的影響如圖3（a）所示，由圖可知，不同溫度下，HPI溶解度均在200MPa時(shí)達(dá)到最大值，較高的壓力反而對(duì)酶解反應(yīng)有抑制作用。隨著溫度的增加酶解產(chǎn)物溶解度逐漸增大，在55℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)繼續(xù)升溫時(shí)，溶解度則有所下降。原因是在溫度較低情況下，復(fù)合蛋白酶活性較弱，未能與底物充分作用，不利于可溶性蛋白產(chǎn)生，當(dāng)體系溫度逐漸升高至接近蛋白酶最適溫度時(shí)，酶活性增強(qiáng)，有利于酶解反應(yīng)進(jìn)行[25]，因此HPI溶解度增加，而溫度過高，則會(huì)影響酶分子構(gòu)象，使得酶活性降低，不利于酶促反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致溶解度下降。
不同酶解反應(yīng)溫度在不同壓力下對(duì)HPI水解度的影響如圖3（b）所示，水解度隨溫度的升高先升后降，55℃時(shí)達(dá)到最大。不同溫度下HPI水解度均在200MPa時(shí)具有最大值，這與關(guān)海寧[12]的研究結(jié)果相似，壓力的存在可顯著促進(jìn)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解作用，而當(dāng)壓力超過一定的范圍，則會(huì)抑制酶解反應(yīng)進(jìn)行。綜上，選擇55℃為HPI酶解改性反應(yīng)最適溫度。
2.1.5酶解反應(yīng)時(shí)間的確定
不同酶解反應(yīng)時(shí)間在不同壓力下對(duì)HPI溶解度的影響如圖4（a）所示，由圖可知，HPI在超高壓處理下（100-300MPa）的溶解度均高于0.1MPa處理，200MPa壓力處理下HPI溶解度最大。在20-50min時(shí)間范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物溶解度逐漸增大，50min之后有所下降，但下降幅度較小，這說復(fù)合蛋白酶水解HPI在一定時(shí)間段內(nèi)可起到增溶效果，時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，酶限制性水解蛋白達(dá)到了一定的平衡度，再繼續(xù)水解時(shí)產(chǎn)生了不溶性肽，導(dǎo)致產(chǎn)物溶解度降低[26]。
不同酶解反應(yīng)時(shí)間在不同壓力下對(duì)HPI水解度的影響如圖4（b）所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，HPI水解度先明顯上升而后逐漸平穩(wěn)，可能的原因是隨著時(shí)間的增加，底物與蛋白酶結(jié)合達(dá)到飽和，也可能是酶解產(chǎn)物的產(chǎn)生抑制了酶解反應(yīng)進(jìn)行[27]，因此50min后水解度變化不明顯。不同改性時(shí)間下的水解度均在200MPa時(shí)達(dá)到最大值。綜上，選擇50min為HPI酶解改性反應(yīng)最佳時(shí)間。
2.2 超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì) HPI 理化性質(zhì)的影響
2.2.1 溶解度
溶解度作為蛋白質(zhì)十分重要的一種功能特性，很大程度上決定了蛋白質(zhì)的乳化性、起泡性等性質(zhì)，因此提高溶解度是蛋白質(zhì)改性中一個(gè)重要方面[28]。如圖5所示為在最佳酶解條件下超高壓輔助酶解反應(yīng)產(chǎn)物在不同pH下的溶解度。由圖可知，在pH2.0~10.0范圍內(nèi)，HPI及其水解產(chǎn)物的溶解度隨pH增大呈先下降后上升趨勢(shì)，均在pH4.0時(shí)達(dá)到最小值，可知等電點(diǎn)在4.0附近。
在pH2.0-10.0范圍內(nèi)，HPI水解產(chǎn)物在200MPa時(shí)的溶解度最高，其次是300MPa、100MPa和0.1MPa，均遠(yuǎn)高于改性前HPI的溶解度。溶解度的提升主要有兩方面的原因，一方面，酶解反應(yīng)使HPI致密的空間被破壞，分子發(fā)生重排，親水性區(qū)域暴露，改變了親水與疏水性基團(tuán)的排列與分布；另一方面，大分子蛋白變成小分子量肽段，使蛋白質(zhì)表面親水基團(tuán)與水的接觸面積增大，從而增大了酶解產(chǎn)物的溶解度[9]。由此可以看出，酶解反應(yīng)可以有效改善HPI溶解度且在酶解反應(yīng)中介入適當(dāng)?shù)膲毫稍鰪?qiáng)這種效應(yīng)，但是，過高的壓力（300MPa）會(huì)使蛋白質(zhì)重新聚集而酶解效率降低，導(dǎo)致溶解度相對(duì)減小。
2.2.2 起泡性
蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過高速剪切攪打后，分子會(huì)吸附到氣-液界面通過分子間相互作用形成粘彈性薄膜，進(jìn)而形成泡沫，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)、水和空氣在一定條件下形成的特殊混合物[29]。如圖6所示為在最佳酶解條件下超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì)HPI起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響，由圖可知，HPI酶解產(chǎn)物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在壓力為200MPa處理時(shí)起泡性最大（49.0%±1.23%），當(dāng)壓力增加到300MPa時(shí)，起泡性反而下降。起泡性的增加主要是由于HPI經(jīng)超高壓輔助酶解改性后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開程度變大，表面電荷增加，可溶性蛋白含量增多，從而使更多蛋白質(zhì)吸附到界面處，有助于液膜的形成[30，31]。然而，當(dāng)體系壓力增加到300MPa時(shí)，可能是壓力過大導(dǎo)致蛋白質(zhì)重新聚集，使溶解度減小，分子間作用力減弱，因此起泡性相對(duì)變差。泡沫穩(wěn)定性在100MPa處理下達(dá)到最大，其增加也與溶解度有關(guān)，當(dāng)體系中可溶性蛋白含量增加時(shí)，有利于泡沫周圍黏性蛋白膜的形成，因此，泡沫穩(wěn)定性得以提高，200MPa及300MPa下泡沫穩(wěn)定性相對(duì)下降是由于隨著酶解進(jìn)程的增加，多肽鏈逐漸縮短且分子量減小導(dǎo)致的，這與Sara[32]等人的研究結(jié)果一致。
2.2.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性
蛋白質(zhì)通常作為表面活性劑應(yīng)用于香腸、湯料等食品中，維持體系乳化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以延長(zhǎng)制品保存期。乳狀液和泡沫形成的原理非常相似，蛋白質(zhì)的溶解性在其中起著重要作用。如圖7所示為在最佳酶解條件下超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響，由圖可知，與HPI相比，在0.1-300MPa處理下，HPI酶解產(chǎn)物乳化性顯著升高（P<0.05），200MPa下乳化性具有最大值為31.56±0.95m2/g?？赡苁浅邏狠o助酶解反應(yīng)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，疏水基團(tuán)暴露，從而提高了分子柔性和表面疏水性，使蛋白質(zhì)分子更易吸附到油水界面[37]；此外，酶解改性后HPI酶解產(chǎn)物溶解度明顯提升且肽段的產(chǎn)生也會(huì)使蛋白質(zhì)分子間電荷作用增強(qiáng)，從而提升其乳化性。而300MPa時(shí)乳化性下降主要是因?yàn)閴毫υ龃髸r(shí)，蛋白質(zhì)分子在氫鍵、疏水及靜電相互作用下重新形成聚集體，表面疏水性降低，因此乳化能力降低[11]。乳化穩(wěn)定性方面，不同壓力處理下HPI酶解產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性均有所降低，可能與小分子多肽的產(chǎn)生，使降低界面張力的能力減弱，不能有效防止油滴聚集有關(guān)，這與崔憲[33]等人的研究結(jié)果一致。綜合來看，蛋白質(zhì)的乳化能力與乳化穩(wěn)定性的好壞并不存在正相關(guān)。
2.2.4 持水性
蛋白質(zhì)的持水性是指蛋白質(zhì)在食品加工中與水的結(jié)合能力，蛋白質(zhì)分子表面親水性及疏水性強(qiáng)弱、分子的物理截留作用以及結(jié)構(gòu)都會(huì)影響持水性，持水性好壞可直接影響食品的嫩度和口感。如圖8所示為在最佳酶解條件下超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物持水性的影響，由圖可知，HPI持水性為3.1±0.17g/g，壓力在0.1MPa、100MPa、200MPa、300MPa時(shí)酶解產(chǎn)物持水性分別為3.5±0.09g/g、2.7±0.08g/g、2.73±0.06g/g、2.9±0.08g/g，可見，0.1MPa處理下酶解產(chǎn)物持水性最大，高于改性前HPI，而100-300MPa處理時(shí)顯著下降（P<0.05），低于改性前HPI?？赡艿脑蚴荋PI在蛋白酶的作用下肽鏈斷裂，極性基團(tuán)暴露，使部分氨基與羧基處于游離狀態(tài)，蛋白質(zhì)分子通過極性基團(tuán)吸水，因而持水性增加。持水性下降的原因可能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，蛋白質(zhì)經(jīng)高壓酶解后，分子量和粘度逐漸降低，蛋白質(zhì)分子無序性程度增加，從而導(dǎo)致持水性下降[34]，當(dāng)壓力再繼續(xù)增加時(shí)，加強(qiáng)了蛋白的水合作用，又進(jìn)一步促進(jìn)水分吸收[35]。
圖8 超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物持水性的影響
2.2.5 持油性
蛋白質(zhì)持油性是指蛋白質(zhì)吸附油脂的能力，將蛋白質(zhì)應(yīng)用于肉制品加工中可有效降低肉中油脂及汁液流失。如圖9所示為在最佳酶解條件下超高壓輔助酶解反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物持油性的影響，研究表明，蛋白質(zhì)表面疏水性及其氨基酸側(cè)鏈殘基的非極性基團(tuán)可影響蛋白質(zhì)對(duì)油脂的吸附能力[36]。本實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)持油性隨壓力的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，HPI持油性為2.52±0.09g/g，0.1-300MPa時(shí)持油性分別為3.95±0.10g/g、4.01±0.13g/g、4.35±0.08g/g、3.26±0.05g/g，可見，改性后蛋白質(zhì)的持油性較改性前相比均有顯著提高（P<0.05），200MPa時(shí)達(dá)到最大值?？赡艿脑蚴?，HPI經(jīng)酶解改性后溶解度增大，疏水基團(tuán)暴露，提高了蛋白質(zhì)與油脂的接觸率與親和力，因此其酶解產(chǎn)物的持油率有所提升，但當(dāng)壓力達(dá)到300MPa時(shí)，蛋白質(zhì)在壓力的作用下發(fā)生聚集，溶解度因此降低且表面疏水基團(tuán)被蛋白質(zhì)聚集體所掩蓋，導(dǎo)致其持油能力下降，這與林素麗[37]等人研究結(jié)果一致。
3 結(jié)論
本研究在0.1-300MPa超高壓下輔助復(fù)合蛋白酶對(duì)HPI進(jìn)行酶解改性，以溶解度及水解度為判定指標(biāo)，得到最佳改性條件為：加酶量5000U/g、改性pH8.0、改性溫度55℃、改性時(shí)間50min。在此條件下酶解后的蛋白溶解性顯著提升（P<0.05），當(dāng)壓力為200MPa時(shí)溶解性最高，隨后下降。蛋白起泡性有所提升，并在200MPa時(shí)達(dá)到最大，而泡沫穩(wěn)定性在100MPa處理下最高，與起泡性變化趨勢(shì)并不完全一致。經(jīng)酶解后HPI的乳化性隨壓力升高逐漸增大而后減小，當(dāng)壓力為200MPa時(shí)其乳化性最高，而乳化穩(wěn)定性存在不同程度的下降。由持水性測(cè)定結(jié)果可知，0.1MPa處理時(shí)HPI持水性最大且高于HPI，隨著壓力的增加，持水性反而下降。由持油性測(cè)定結(jié)果可知，改性后蛋白質(zhì)的持油性較HPI相比均有顯著提高（P<0.05），200MPa時(shí)達(dá)到最大值。綜上所述，當(dāng)超高壓壓力在200MPa時(shí)對(duì)HPI酶解改性具有較好的促進(jìn)作用，能夠明顯改善HPI的理化性質(zhì)。
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