摘 要：采用8種不同方法提取火麻籽殼多酚，通過對比不同提取方法的提取率與提取物抗氧化活性，篩選出火麻籽殼多酚的最佳提取方法。采用大孔樹脂對最佳提取工藝的多酚粗提物樣品進行純化，確定其純化條件。結(jié)果表明：超聲波輔助醇提法多酚提取率最高，多酚提取率為2.34mg/g。不同提取方法所得多酚提取液對DPPH·和ABTS+·都有清除能力，其中超聲波輔助醇提法所得樣品在不同濃度水平均表現(xiàn)出較強的自由基清除能力。純化火麻籽殼多酚的最佳樹脂為X-5，其吸附率和解吸率分別為74.5%和44.5%，乙醇解吸液濃度為90%。純化后多酚對DPPH·和ABTS+·的清除能力與樣品濃度之間存在量效關(guān)系，其IC50值分別0.38mg/mL和0.10mg/mL，純化后的火麻籽殼多酚具有較高的抗氧化活性。
關(guān)鍵詞：火麻籽殼；多酚；提取工藝；分離純化；抗氧化性
植物多酚（plant polyphenol）又稱植物單寧，具有多元酚結(jié)構(gòu)，分為水解單寧和縮合單寧，是一類復(fù)雜的酚類次生代謝物[1]，常存在于天然可食性植物中，如茶葉、桑葚、豆制品、葡萄酒、果蔬等。近年來，對于植物多酚的開發(fā)應(yīng)用層出不窮，采用不同工藝條件提取香菇[2]、櫻桃李[3-4]、菠蘿皮渣[5]、菠蘿蜜果皮[6]以及鐵皮石斛渣[7]等多種植物的多酚類化合物并初步探討其生物學(xué)活性，證明植物多酚具有清除自由基、抗氧化、美白等功效。研究表明，植物多酚還具有防輻射[8]、抗癌[9]、抗過敏[10]、抑菌抗炎及增強免疫力[11]等功能，植物多酚的深入研究為食品添加劑、功能性食品、化妝品、抗氧化劑等領(lǐng)域提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
火麻（Cannabis sativa L.），別稱漢麻、大麻、線麻等，是一種一年生的?？?、大麻屬草本植物，在中國各個省份和地區(qū)都可以人工栽植，至今已有3000多年的種植歷史[12-13]。從古至今，火麻在人們的日常生活中都占據(jù)著重要的位置，如紡織麻布、制作繩索、紡線、造紙或者編織漁網(wǎng)等[14]；火麻籽的平均含油量為30%，不飽和脂肪酸含量較高，具有顯著的抗輻射與抗氧化功效[15]。
火麻籽殼是火麻籽的外殼，其質(zhì)量約占火麻籽總質(zhì)量的40%。在火麻籽食品（火麻籽油、火麻仁蛋白等）加工業(yè)中，火麻籽殼作為廢棄物，是火麻籽食品加工生產(chǎn)過程中需要完全除去的部位。然而，火麻籽殼中還包含植物性纖維素、植物多酚以及少量沒有去除干凈的火麻籽仁等有效成分[16]。若將該產(chǎn)品作為原料加工后的廢物丟棄，不僅是對生物質(zhì)資源的巨大浪費，還會對環(huán)境造成污染。因此，本研究以火麻籽殼為研究對象，采用不同方法對火麻籽殼多酚類化合物進行提取，并對不同提取方法所得產(chǎn)物的體外抗氧化性進行測定，篩選提取火麻籽殼多酚的最佳提取方法，并利用大孔樹脂進行初步純化，確定純化工藝，為火麻籽殼的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
火麻籽殼：山西宏田嘉利農(nóng)業(yè)科技有限公司；福林-酚（Folin-phenol）、沒食子酸、抗壞血酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS]、甲醇、乙醇（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
D101、D201、NKA、HP-20和X-55種不同型號大孔樹脂：北京索萊寶科技有限公司，均為乳白色不透明球狀顆粒，全多孔吸附型樹脂，具體參數(shù)如表1所示。
表1 5種大孔樹脂參數(shù)
1.2儀器與設(shè)備
4500A高速多功能搖擺粉碎機：浙江省永康市紅太陽機電有限公司；G-36A超聲波清洗機：深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司；WFG-7200分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1提取工藝
1.3.1.1超聲波輔助提取
超聲波輔助醇提法（UE）：稱取10g火麻籽殼粉末與70%乙醇[料液比1∶10（g/mL）]置于錐形瓶中，在溫度為50℃的條件下進行超聲波輔助提取40min，得到的提取液在低速離心機中以5000r/min離心15min后進行抽濾、旋蒸，并將提取樣品進行冷凍干燥、保存。
超聲波輔助水提法（UW）：提取物溶劑為水溶液，其他的操作步驟、條件同超聲波輔助醇提法。
1.3.1.2冷浸提取
冷浸醇提法（CE）：稱取10g火麻籽殼粉末與70%乙醇[料液比1∶10（g/mL）]置于錐形瓶中，在常溫條件下浸泡24h（每隔30min搖晃1次錐形瓶，盡量使其完全反應(yīng)），得到的提取液在低速離心機中以5000r/min離心15min后進行抽濾、旋蒸，并將提取樣品進行冷凍干燥、保存。
冷浸水提法（CW）：提取物溶劑為水溶液，其他的操作步驟、條件同冷浸醇提法。
1.3.1.3熱回流提取
熱回流醇提法（HE）：稱取10g火麻籽殼粉末與70%乙醇[料液比1∶10（g/mL）]置于錐形瓶中，在80℃條件下進行熱回流提取80min，得到的提取液在低速離心機中以5000r/min離心15min后進行抽濾、旋蒸，并將提取樣品進行冷凍干燥、保存。
熱回流水提法（HW）：提取物溶劑為水溶液，其他的操作步驟、條件同熱回流醇提法。
1.3.1.4索氏提取
索氏醇提法（SE）：稱取10g火麻籽殼粉末，用濾紙包裝好置于索氏提取器中，不可超過虹管長度，然后與70%乙醇進行索式提取3h，溫度為100℃，得到的提取液在低速離心機中以5000r/min離心15min后進行抽濾、旋蒸，并將提取樣品進行冷凍干燥、保存。
1.3.1.5高溫高壓提取
高溫高壓水提法（TW）：于500mL錐形瓶中，稱取火麻籽殼粉末25g，加入250mL蒸餾水，以硫酸紙封口，置于高壓滅菌器中，在121℃、0.15MPa的條件下提取20min，得到的提取液在低速離心機中以5000r/min離心15min后進行抽濾、旋蒸，并將提取樣品進行冷凍干燥、保存。
1.3.2多酚提取率測定
采用福林-酚比色法[17]測定多酚得率。在10mL試管中，依次加入1mL待測液、6mL水、0.5mL福林-酚溶液，混勻，暗反應(yīng)5min；1.5mL7%的Na2CO3溶液、1mL去離子水，加塞充分搖勻，室溫暗處靜置60min，在750nm處測吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以沒食子酸濃度（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16mg/mL）為X軸，吸光度A為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程（Y=152.27X+0.0816，R2=0.998）計算提取液中多酚濃度，并按以下公式計算多酚含量。
1.3.3大孔樹脂純化
1.3.3.1大孔樹脂的篩選
首先對樹脂進行預(yù)處理，用90%乙醇對大孔樹脂浸泡12h，裝柱用蒸餾水沖洗到?jīng)]有明顯的乙醇?xì)馕?，再倒?%鹽酸溶液處理12h，用蒸餾水沖洗，再用5%NaOH溶液處理12h，然后用蒸餾水洗到中性，儲存?zhèn)溆谩?/span>
將D101、D201、NKA、HP-20和X-55種經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂進行真空抽濾以去掉多余水分，分別稱取2g（W）抽干的樹脂于50mL錐形瓶中，加入25mL（V1）火麻籽殼多酚粗提取液（C0），放入恒溫振蕩箱中室溫振蕩吸附24h，取1mL上清液測定火麻籽殼多酚質(zhì)量濃度（C1）；用少許蒸餾水將充分吸附的各種樹脂表面的殘留粗提液沖洗干凈，真空抽濾，去掉水分后，分別加入50%乙醇溶液25mL（V2）解吸24h，取1mL解吸液測定火麻籽殼多酚質(zhì)量濃度（C）[18]。按照公式（2）～（5）計算吸附量（Q）、吸附率（A）、解吸率（P）、提取率（E），篩選出適合純化火麻籽殼多酚的樹脂。
1.3.3.2洗脫劑濃度對解吸的影響
將5種經(jīng)過預(yù)處理的不同型號大孔樹脂分別采用濕法裝柱（2.5cm×60cm）后，沿內(nèi)管壁加入待分離純化的粗提取液15mL，分別加入30%、50%、70%、90%的乙醇15mL，在室溫度下以1.0BV/h的流速進行洗脫，收集解吸液測定多酚含量，計算解吸率。
1.3.4抗氧化性測定
1.3.4.1DPPH自由基清除能力測定
配制不同濃度的多酚凍干粉溶液，分別量取0.3mL和2.7mL60μmol/LDPPH溶液混合搖勻，室溫避光反應(yīng)30min，518nm波長處測定吸光度，結(jié)果標(biāo)記作As；取0.3mL蒸餾水和2.7mLDPPH溶液混合搖勻，測吸光度記作A0；取0.3mL不同濃度的樣品溶液和2.7mL無水甲醇混合搖勻，測定吸光度記作Ar。用VC作為陽性對照。按照公式（6）計算多酚提取物對DPPH自由基的清除率[19]。
DPPH自由基清除率/%=[1-（As-Ar）/A0]×100（6）
1.3.4.2ABTS+自由基清除能力測定
配制不同濃度的多酚凍干粉溶液，分別量取0.3mL和2.7mLABTS工作液（7mmol/LABTS溶液和2.5mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫條件下避光反應(yīng)12h～16h后，用80%的乙醇溶液進行稀釋，使其在734nm波長處的吸光度為0.7）混合搖勻，室溫避光反應(yīng)30min，734nm波長處測定吸光度，結(jié)果標(biāo)記作As；取0.3mL蒸餾水和2.7mLABTS工作液混合搖勻，測吸光度記作A0；取0.3mL不同濃度的樣品溶液和2.7mL無水乙醇搖勻混合，測定吸光度記作Ar。用VC作為陽性對照。按照公式（7）計算多酚提取物對ABTS+自由基的清除率[19]。
ABTS+自由基清除率/%=[1-（As-Ar）/A0]×100（7）
1.4數(shù)據(jù)處理
試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值，采用GraphPad Prism8.4.3軟件進行作圖，采用SPSS17.0軟件進行差異性分析，P<0.05表示具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
2結(jié)果與分析
2.1不同提取方法的多酚提取率
不同提取方法對多酚提取率的影響見圖1。
不同字母代表具有顯著性差異（P<0.05）。
圖1 不同提取方法對多酚得率的影響
由圖1可知，提取溶劑、提取溫度、超聲波輔助等均對火麻籽殼多酚的提取率有影響。以乙醇作溶劑的多酚提取率較水作溶劑的提取率高，其中，超聲波輔助醇提法的提取率高于其他7種方法；相比于熱回流醇提法和超聲波輔助水提法，冷浸醇提法和索式醇提法多酚提取率偏高，但無顯著差異；熱回流水提法的多酚提取率最低，原因可能是溫度過高，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)受熱分解、含量下降；而超聲波輔助醇提法與其他提取方法相比提取率最高且操作簡便、可控制性強，故提取火麻籽殼多酚時，采取超聲波輔助醇提取工藝。
2.2大孔樹脂純化
2.2.1大孔樹脂的篩選
純化火麻籽殼多酚的不同型號樹脂的吸附率、解吸率、提取率如圖2所示。
圖2 不同樹脂對多酚吸附率、解吸率及提取率的影響
由圖2可知，對火麻籽殼多酚吸附率較高的是NKA、HP-20和X-53種樹脂，其吸附率分別是74.5%、75.6%、74.5%；解吸率較高的是D201、X-5兩種樹脂，解吸率分別是50%、44.5%；提取率最高的是X-5樹脂，為33.2%，因此選擇X-5型號的樹脂作為純化火麻籽殼多酚的最佳樹脂。
2.2.2乙醇濃度對多酚解吸率的影響
乙醇濃度對火麻籽殼多酚解吸率的影響如圖3所示。
圖3 乙醇濃度對多酚解吸率的影響
由圖3可知，隨著乙醇濃度的升高，多酚解吸率逐漸升高。植物多酚是有機物，其在水中的溶解度較小，當(dāng)多酚溶解于乙醇時，不僅溶解度增大，而且乙醇中氧氣溶解度較小，可以防止植物多酚被氧化而變質(zhì)，因此選擇90%乙醇解吸為宜。
2.3火麻籽殼多酚的抗氧化性分析
2.3.1純化前火麻籽殼多酚對DPPH自由基的清除能力
以VC為陽性對照，8種不同提取工藝所得多酚樣品對DPPH自由基的清除能力如表2所示。
表2 不同提取工藝純化前火麻籽殼多酚對DPPH·的清除能力
注：同行不同字母代表具有顯著性差異（P<0.05）。
由表2可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，不同樣品對DPPH·具有清除能力，隨著樣品濃度的增大，不同提取方法的樣品對DPPH·的清除率逐漸增大，在同一濃度水平時，VC較其余8種樣品均表現(xiàn)出顯著的DPPH·清除能力。有機溶劑冷提取法，即冷浸醇提法與超聲波輔助醇提法所得樣品對DPPH·清除能力更強，且顯著高于除高溫高壓提取外的其余5種非有機溶劑冷提取法所得多酚樣品，其中熱回流醇提的多酚樣品清除能力最弱，其熱回流水提的多酚樣品也較弱，原因可能是溫度過高導(dǎo)致的清除能力降低。
2.3.2純化前火麻籽殼多酚對ABTS+自由基的清除能力
VC、8種不同提取工藝下多酚對ABTS+·的清除能力如表3所示。
表3 不同提取工藝純化前火麻籽殼多酚對ABTS+·的清除能力
注：同行不同的字母代表具有顯著性差異（P<0.05）。
由表3可知，隨著VC和樣品濃度的升高，對ABTS+·的清除能力不斷增強，不同樣品對ABTS+·的清除率與樣品濃度之間存在量效正相關(guān)關(guān)系；不同處理濃度下，對ABTS+·清除能力最強的是VC陽性對照，其次是超聲波輔助醇提法所得樣品（除120、160μg/mL）。對比8種不同提取方法，醇提取（UE、CE、HE、SE）工藝下所得多酚樣品較水提?。║W、HW、CW、TW）工藝下所得多酚樣品對ABTS+·的清除作用更強，且存在顯著差異，可能原因是有機溶劑更有利于目標(biāo)產(chǎn)物的萃取溶出[20]。
2.3.3純化后火麻籽殼多酚對DPPH自由基的清除能力
VC、純化前及純化后超聲波輔助乙醇法提取火麻籽殼多酚對DPPH·的清除能力如圖4所示。
圖4 不同樣品對DPPH·的清除能力
由圖4可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增大，火麻籽殼多酚對DPPH·的清除率逐漸增大。純化后的火麻籽殼多酚對DPPH·的清除能力高于純化前火麻籽殼多酚，同時低于VC。說明經(jīng)過試驗純化后，樣品捕獲DPPH·的能力增強，試驗所選純化條件可以富集多酚。
2.3.4純化后火麻籽殼多酚對ABTS+·的清除能力
VC、純化前以及純化后火麻籽殼多酚對ABTS+·的清除能力如圖5所示。
圖5 不同樣品對ABTS+·的清除能力
由圖5可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增大，火麻籽殼多酚對ABTS+·的清除率逐漸增大。純化后的火麻籽殼多酚對ABTS+·的清除能力高于純化前火麻籽殼多酚，且高于食品中常用的抗氧化劑VC，說明經(jīng)過X-5型號大孔樹脂純化后，火麻籽殼多酚含量升高，清除ABTS+·能力增強。
3討論與結(jié)論
通過超聲波輔助（乙醇/蒸餾水）提取法、熱回流（乙醇/蒸餾水）提取法、冷浸（乙醇/蒸餾水）提取法、索式抽提法、高溫高壓提取法8種不同方法提取火麻籽殼多酚，并對不同提取方法所得多酚粗提物樣品進行抗氧化測定，結(jié)果顯示，與蒸餾水相比，乙醇作提取溶劑時，多酚提取率明顯提高；輔助超聲波手段可以明顯提高多酚提取率；因此，8種不同提取法中，超聲波輔助乙醇提取法多酚提取率最高，可達2.34%；對比不同提取方法所得多酚粗提物的抗氧化活性可知，超聲波輔助乙醇提取法所得樣品在試驗所選不同濃度水平上對DPPH和ABTS+自由基的清除能力均較強，因此，超聲波輔助乙醇提取法可作為提取火麻籽殼多酚的最佳提取方法。采用大孔樹脂對超聲波輔助乙醇法所得多酚粗提物樣品進行純化，篩選得到純化火麻籽殼多酚的最佳樹脂為X-5，其吸附率和解吸率分別為74.5%和44.5%，乙醇解吸液濃度為90%。純化后多酚對DPPH·和ABTS+·的清除能力與樣品濃度之間存在量效關(guān)系，其IC50值分別0.38mg/mL和0.10mg/mL。本研究結(jié)果為火麻籽殼多酚的提取純化工藝，以及火麻籽殼多酚在功能性食品添加劑以及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的科學(xué)參考。
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