摘  要:以靜態(tài)吸附率和解吸率為指標,篩選出適合荷葉?羅布麻總黃酮純化的最佳大孔樹脂,再用其進行動態(tài)吸附考察;采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化荷葉?羅布麻總黃酮的純化工藝條件?結果表明:荷葉?羅布麻總黃酮純化的最佳樹脂均是AB-8型大孔樹脂,荷葉總黃酮最佳純化工藝條件為上樣流速3.0BV/h?上樣質量濃度1.606mg/mL?乙醇體積分數(shù)80%?上樣量1.4BV,在此條件下荷葉總黃酮含量為65.75%;羅布麻總黃酮最佳純化工藝條件為上樣流速1.5BV/h?上樣質量濃度2.394mg/mL?乙醇體積分數(shù)80%?上樣量1.5BV,在此條件下羅布麻總黃酮含量為46.75%?

關鍵詞:大孔樹脂;荷葉;羅布麻;總黃酮;純化

 

荷葉為睡蓮科屬植物,生長在水上?陸地或湖泊,在我國資源十分豐富^[1]?現(xiàn)代醫(yī)學研究證明,荷葉中含有大量的黃酮類和生物堿類物質,具有降血脂?治療動脈粥樣硬化?抑菌等功效^[2]?羅布麻在中國淮河?秦嶺以北各省(自治區(qū))都有分布?現(xiàn)代研究認為其可預防和治療高血壓,對增強機體抗病能力均有一定作用,為延年益壽?養(yǎng)生之藥^[3]?

大孔樹脂是一類有機高聚物吸附劑,其理化性質穩(wěn)定,不溶于酸?堿及有機溶劑,選擇性較好,與其他分離技術相比,它具有提高有效成分的相對含量?生產(chǎn)周期短?樹脂再生方便等優(yōu)點,因而近幾年在天然產(chǎn)物的分離純化中被廣泛應用,尤其適用于黃酮類化學物的分離純化^[4]?本研究篩選出適合荷葉和羅布麻總黃酮純化的最佳大孔樹脂,并優(yōu)化得到純化荷葉?羅布麻總黃酮的最佳條件,可為荷葉和羅布麻的有效開發(fā)利用提供理論依據(jù)?

1材料與方法

1.1材料與試劑

荷葉?羅布麻,湖北濟善堂中藥飲片有限公司;蘆丁標準品(≥98%),天津一方科技有限公司;無水乙醇?濃鹽酸?氫氧化鈉?硝酸鋁?亞硝酸鈉,分析純;D315大孔吸附樹脂?D101大孔吸附樹脂?X-5大孔吸附樹脂?AB-8大孔吸附樹脂?HPD600大孔吸附樹脂?HPD450大孔吸附樹脂,鄭州勤實科技有限公司?

1.2儀器與設備

YP-202N型電子天平,上海精密科學儀器有限公司;RE-5ZCS型旋轉蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器有限公司;TDZ5-WS型低速離心機,長沙湘麓離心機儀器有限公司;DG-120型中草藥粉碎機,浙江省瑞安市飛達器械有限公司;KQ-3200E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;SP-752型紫外分光光度計,上海光譜儀器有限公司;SPX-100B-D型全溫振蕩培養(yǎng)箱,常州諾基儀器有限公司?

1.3方法

1.3.1羅布麻?荷葉的總黃酮標準曲線的制作

精密稱取蘆丁標準品,用體積分數(shù)30%乙醇配制成0.15mg/mL蘆丁標準品對照液,精準量取對照液0?1.00?2.00?3.00?4.00?5.00mL分別移入標有0?1?2?3?4?5號的10mL比色管中,分別加入體積分數(shù)30%乙醇至5mL,各加入0.05g/mLNaNO2溶液0.3mL,搖勻,靜置6min,再加入0.1g/mLAl(NO3)3溶液0.3mL,搖勻,靜置6min后,加入0.04g/mLNaOH溶液2.0mL,最后加入體積分數(shù)30%乙醇至刻度,搖勻,靜置15min?以0號為空白對照,于波長510nm處測吸光度^[5]?以蘆丁標準品質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程y=9.6267x+0.0071,相關系數(shù)R²=0.9996?蘆丁對照品在質量濃度0.0075~0.0600mg/mL呈良好的線性關系?

1.3.2羅布麻?荷葉的預處理及提取工藝

按文獻^[6]操作,分別取羅布麻?荷葉以60℃干燥至恒重,粉碎后過89μm鋼篩,密封保存?分別稱取一定量的羅布麻?荷葉粉末?荷葉粉末在60℃?150W條件下按料液比1∶20(g/mL)加入體積分數(shù)50%乙醇作溶劑,抽提2次,每次超聲20min;羅布麻粉末在40℃?150W條件下按料液比1∶15(g/mL)加入體積分數(shù)60%乙醇作溶劑,抽提2次,每次超聲20min;收集提取物后分別以4200r/min離心5min,取上清液,對荷葉?羅布麻中總黃酮含量進行測定

1.3.3提取液中總黃?酮含量測定

提取液于波長510nm處測吸光度,經(jīng)標準曲線方程計算得到提取液中總黃酮質量濃度?按式(1)計算總黃酮含量?

 

式中:ρ為提取液中總黃酮質量濃度,mg/mL;V為洗脫液的體積,mL;m為洗脫液干燥后的質量,g?

1.3.4大孔樹脂的預處理與篩選

按文獻^[7]操作,將大孔樹脂進行預處理使上清液pH呈中性?通過大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸試驗選取最優(yōu)樹脂?吸附率和解吸率按式(2)~(3)計算?

 

式中:ρ₁為初始質量濃度,mg/mL;ρ₂為吸附后質量濃度,mg/mL;ρ₃為解吸液中黃酮質量濃度,mg/mL?

1.3.5上樣量的確定

按文獻^[8]操作,稱取已處理完畢的AB-8大孔樹脂,濕法上柱維持柱體積10mL,以流出液總黃酮質量濃度為考察指標,加入一定體積的上樣液,荷葉粗提液以上樣流速為3.0BV/h,羅布麻粗提液以上樣流速1.5BV/h進行動態(tài)吸附,每2.5mL接1管,測定總黃酮的質量濃度,當AB-8大孔樹脂達到吸附飽和時,停止上樣并記錄上樣量,繪制泄露曲線?

1.3.6單因素試驗

1.3.6.1上樣流速的確定

分別以1.5?3.0?4.5?6.0BV/h的上樣流速,收集流出液,測定上樣流速對總黃酮流出液質量濃度的影響?

1.3.6.2上樣質量濃度的確定

將荷葉?羅布麻總黃酮提取液分別以0.803?1.606?2.409?3.212mg/mL與0.798?1.596?2.394?3.191mg/mL進行上樣,收集流出液,測定上樣質量濃度對總黃酮吸附率的影響?

1.3.6.3洗脫液體積分數(shù)的確定

分別用體積分數(shù)60%?70%?80%?90%乙醇進行洗脫,收集流出液,測定不同體積分數(shù)的乙醇對總黃酮流出液質量濃度的影響?

1.3.7正交試驗

在單因素試驗的基礎上,以上樣流速(A)?上樣質量濃度(B)?乙醇體積分數(shù)(C)為變量?總黃酮含量為指標,設計正交試驗,因素水平見表1?

表1 L₉(3³)正交試驗因素水平表

  

注:每個因素的水平左邊數(shù)值表示為荷葉總黃酮上樣條件,右邊數(shù)值表示為羅布麻總黃酮上樣條件?

2結果與分析

2.1樹脂篩選結果

由表2可知:對于荷葉總黃酮,D315吸附率最強,為55.49%,AB-8次之,為49.82%,而AB-8解吸率最強,為43.01%,遠高于其他樹脂;對于羅布麻總黃酮,AB-8吸附率最強,為65.68%,D101解吸率最強,為58.82%,而AB-8解吸率是中等水平,為40.13%?綜合吸附率和解吸率,荷葉和羅布麻均選擇極性樹脂AB-8型進行后續(xù)動態(tài)吸附試驗?

表2 5種大孔樹脂對總黃酮的吸附率及解吸率

  

2.2上樣量的確定

由圖1可知:當荷葉提取液上樣量達到1.4BV時出現(xiàn)泄露點,因此在最佳吸附條件下,荷葉選取上樣量為1.4BV?羅布麻的泄露點在1.5~1.75BV且上樣量為1.75BV時泄露明顯,因此,羅布麻選取上樣量為1.5BV?

  

圖1 荷葉和羅布麻總黃酮的泄漏曲線

2.3單因素試驗

2.3.1上樣流速的確定

由圖2可知:荷葉?羅布麻樣品液的上樣流速均在6.0BV/h時,泄漏點出現(xiàn)最早?荷葉?羅布麻樣品液上樣流速分別在3.0BV/h時,泄漏點出現(xiàn)較晚?因此,選擇荷葉?羅布麻上樣流速均為3.0BV/h?

  

圖2 不同上樣流速對總黃酮流出液質量濃度的影響

2.3.2上樣質量濃度的測定

由圖3可知:超過一定質量濃度范圍后,隨著上樣液質量濃度的增大,AB-8大孔樹脂對2種樣液總黃酮動態(tài)吸附率均逐漸下降?其原因可能是隨著上樣質量濃度的增大雜質增多,造成對AB-8大孔樹脂表面的堵塞,從而影響吸附效果?因此,選擇荷葉上樣質量濃度為1.606mg/mL,羅布麻上樣質量濃度為1.596mg/mL?

  

圖3 不同的上樣質量濃度

對AB-8大孔樹脂吸附率的影響

2.3.3洗脫液體積分數(shù)的確定

由圖4可知:荷葉總黃酮用體積分數(shù)60%?70%乙醇洗脫出的峰形比較寬,且均有一定的拖尾現(xiàn)象,用體積分數(shù)80%?90%乙醇洗脫效果較好,峰形較窄,洗脫效果相差不大?羅布麻總黃酮用體積分數(shù)70%?80%乙醇洗脫時效果較好,峰形較窄,洗脫效果相差不大?綜合成本考慮,荷葉?羅布麻總黃酮分別選用體積分數(shù)80%?70%乙醇進行洗脫?

  

圖4 不同體積分數(shù)乙醇對總黃酮流出液質量濃度的影響

2.4正交結果分析

由表3可知:荷葉總黃酮的最佳純化條件為A₂B₂C₂?羅布麻總黃酮的最佳純化條件為A₁B₃C₃?在最佳提取純化工藝條件下,分別進行3次驗證實驗,測得荷葉總黃酮含量平均為65.75%,羅布麻總黃酮含量平均為46.75%?

表3 L₉(3³)正交試驗設計及結果表

  

注:k₁?k₂?k₃?R為荷葉,k₁′?k₂′?k₃′?R′為羅布麻?

3結論

以靜態(tài)吸附率和解吸率為指標,篩選出適合荷葉?羅布麻總黃酮純化的最佳大孔樹脂,用其進行動態(tài)吸附考察?采用單因素試驗和正交試驗,得到純化荷葉?羅布麻總黃酮的最佳條件?結果表明:荷葉?羅布麻總黃酮純化的最佳樹脂均為AB-8型大孔樹脂,荷葉總黃酮最佳純化工藝為上樣流速3.0BV/h?上樣質量濃度1.606mg/mL?乙醇體積分數(shù)80%?上樣量1.4BV,在此條件下荷葉總黃酮含量為65.75%;羅布麻總黃酮最佳純化工藝為上樣流速1.5BV/h?上樣質量濃度2.394mg/mL?乙醇體積分數(shù)80%?上樣量1.5BV,在此條件下羅布麻總黃酮含量為46.75%?本研究可為荷葉?羅布麻的深入開發(fā)?產(chǎn)業(yè)附加值的提高提供參考依據(jù)?

 

參考文獻

[1]郄冰冰,王璐,郭瑞鋒,等.大孔吸附樹脂分離純化荷葉提取物[J].中國藥業(yè),2007,16(20):44-45.

[2]李浩然,高麗.荷葉黃酮提取工藝的研究[J].農(nóng)業(yè)機械,2012(15):99-102.

[3]耿巖玲,李福偉,王曉,等.羅布麻中黃酮的超聲波強化提取及高速逆流色譜分離純化[J].食品科學,2007,28(12):47-49.

[4]劉東彥,石曉峰,胡鵬斌,等.大孔吸附樹脂富集純化雪松松針總黃酮工藝的優(yōu)化[J].中成藥,2017,39(2):308-311.

[5]韋琴,梅輝,樂薇,等.金雞毛草葉和莖總黃酮的超聲波提取工藝優(yōu)化[J].糧食與油脂,2016,29(7):81-85.

[6]徐曌.荷葉中黃酮類化合物的提取?分離純化工藝及其抗氧化性研究[D].武漢:武漢理工大學,2008.

[7]張強祖.中藥材黃酮的大孔樹脂吸附工藝研究及生產(chǎn)線設計[D].上海:華東理工大學,2013.

[8]MUNHOZ V M, LONGHINI R, SOUZA J R P, et al. Extraction of flavonoids from Tagetes patula: Process optimization and screening for biological activity [ J] . Revista Brasileira de Farmacognosia,2014,24(5):576-583.

 

文章摘自:韋琴,劉清怡,范康俊,梅輝.荷葉和羅布麻總黃酮的富集純化工藝研究[J].糧食與油脂,2023,36(03):81-84+88.