摘 要：本發(fā)明公開了一種抗苧麻花葉病毒的抗血清及其制備方法和應(yīng)用，抗血清以RaMoV CP蛋白作為免疫原免疫大白兔得到，RaMoV CP蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。其制備方法以RaMoV CP基因?yàn)槟０?，通過PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、分離得到RaMoV CP蛋白，將PepMoV CP重組蛋白作為免疫原免疫大白兔得到抗血清。本發(fā)明的抗血清可應(yīng)用于苧麻花葉病毒的檢測，該方法可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量檢測，具有快速簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，可用于生產(chǎn)上該病毒的快速檢測和預(yù)測預(yù)報(bào)。
權(quán)利要求書
1.一種抗苧麻花葉病毒的抗血清，其特征在于，所述抗血清以RaMoV CP蛋白作為免疫原免疫大白兔得到，所述RaMoV CP蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一種權(quán)利要求1所述的抗血清的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)以RaMoV CP基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物對，對感染RaMoV植物的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
(2)酶切載體和所述擴(kuò)增產(chǎn)物，用連接酶連接得到重組載體；
(3)將所述重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
(4)從所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離出RaMoV CP重組蛋白。
(5)將所述的RaMoV CP重組蛋白免疫大白兔獲得多克隆抗體，即為抗苧麻花葉病毒的抗血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述引物對包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ ID NO.4所示的DNA序列；所述下游引物為SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述載體為pET30a。
5.一種權(quán)利要求1所述的抗血清在制備檢測苧麻花葉病毒的檢測試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測試劑盒的成分包括：PBST緩沖液、封閉液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、顯色液和顯色終止液；所述封閉液為含1％BSA的PBST緩沖液；所述顯色液為3,3',5,5' 四甲基聯(lián)苯胺；所述顯色終止液為用無菌水配制的濃度為2M的硫酸溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為ID ELISA檢測，具體為：
S1 1、10×PBST緩沖液包被待測物，加入到酶標(biāo)板中，用封閉液封閉；
S1 2、在酶標(biāo)板中加入含有苧麻花葉病毒抗血清的一抗溶液，進(jìn)行孵育；
S1 3、在酶標(biāo)板中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗的溶液，進(jìn)行孵育；
S1 4、加入顯色液進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀檢測OD 450nm吸光值，OD 450nm吸光值≥2.5倍為陽性，反應(yīng)孔OD 450nm吸光值＜2.5倍為陰性。
7.一種權(quán)利要求1所述的抗血清在制備檢測苧麻花葉病毒的檢測試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測試劑盒的成分包括：PBS緩沖液、封閉液、堿性過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、顯色液；所述封閉液為含1％BSA的PBST緩沖液，所述顯色液的成分為：0.1MNaHCO3、0.001MMgCl2、0.3g/LNBT(四唑氮蘭)和0.15g/LBCIP(5 溴 4 氯 3 吲哚磷酸鹽)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為Dot ELISA檢測，具體為：
S2 1、將待檢測物用PBS緩沖液研磨得到抗原溶液，將所述抗原溶液點(diǎn)在NC膜上用封閉液封閉；
S2 2、在NC膜上加入含有苧麻花葉病毒抗血清的一抗溶液，進(jìn)行孵育；
S2 3、在酶標(biāo)板中加入堿性過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗的溶液，進(jìn)行孵育；
S2 4、加入顯色液進(jìn)行顯色，顏色為深藍(lán)色至藍(lán)紫色為陽性。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗苧麻花葉病毒的抗血清及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)
苧麻花葉病毒(Ramie mosaic virus，RaMoV)屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)，自然條件下，只能通過介體昆蟲煙粉虱傳播。該病毒在自然條件下可侵染苧麻和煙草，嚴(yán)重危害苧麻和煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)。苧麻作為我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，種植歷史悠久，野生苧麻和家麻的種植區(qū)域均非常廣泛，且在自然環(huán)境下生活能力極強(qiáng)；煙草的經(jīng)濟(jì)附加值高，在我國種植范圍廣。被該病毒感染的煙草出現(xiàn)植株矮化、葉片皺縮、植物頂端不發(fā)育繼而死亡等癥狀。因而由煙粉虱廣泛傳播的RaMoV感染苧麻、煙草等經(jīng)濟(jì)作物所帶來的危害隱患不可小覷，一旦在田間爆發(fā)，損失將嚴(yán)重難以估算。同時(shí)雙生病毒重組率較高，一旦RaMoV與煙粉虱傳播的多種病毒發(fā)生重組，產(chǎn)生的危害將更為嚴(yán)重。
植物病毒病，目前生產(chǎn)上還缺乏有效的防控技術(shù)措施，預(yù)防是控制植物病毒病的最佳方法。建立高通量、快速的檢測方法是預(yù)防植物病毒病最關(guān)鍵的技術(shù)之一。血清學(xué)方法具有這些優(yōu)點(diǎn)，且廣泛的應(yīng)用于植物病毒的檢測與病害診斷。目前沒有應(yīng)用于檢測我國RaMoV分離物的快速血清學(xué)檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述需要解決的技術(shù)問題，提供了一種抗苧麻花葉病毒的抗血清及其制備方法和應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種抗苧麻花葉病毒的抗血清，所述抗血清以RaMoV CP蛋白作為免疫原免疫大白兔得到，所述RaMoV CP蛋白的DNA序列如SEQIDNO.3所示。
基于一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的抗血清的制備方法，包括以下步驟：
(1)以RaMoV CP基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物對，對感染RaMoV植物的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
(2)酶切載體和所述擴(kuò)增產(chǎn)物，用連接酶連接得到重組載體；
(3)將所述重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
(4)從所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離出RaMoV CP重組蛋白。
(5)將所述的RaMoV CP重組蛋白免疫大白兔獲得多克隆抗體，即為抗苧麻花葉病毒的抗血清。
上述的制備方法，進(jìn)一步的，所述步驟(1)中所述引物對包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQIDNO.4所示的DNA序列；所述下游引物為SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
上述的制備方法，進(jìn)一步的，所述步驟(2)中所述載體為pET30a。
基于一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的抗血清在制備檢測苧麻花葉病毒的檢測試劑盒中的應(yīng)用，所述檢測試劑盒的成分包括：PBST緩沖液、封閉液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、顯色液和顯色終止液；所述封閉液為含1％BSA的PBST緩沖液；所述顯色液為3,3',5,5' 四甲基聯(lián)苯胺；所述顯色終止液為用無菌水配制的濃度為2M的硫酸溶液。
上述的應(yīng)用，進(jìn)一步的，所述應(yīng)用為ID ELISA檢測，具體為：
S1 1、10×PBST緩沖液包被待測物，加入到酶標(biāo)板中，用封閉液封閉；
S1 2、在酶標(biāo)板中加入含有苧麻花葉病毒抗血清的一抗溶液，進(jìn)行孵育；
S1 3、在酶標(biāo)板中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗的溶液，進(jìn)行孵育；
S1 4、加入顯色液進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀檢測OD 450nm吸光值，OD 450nm吸光值≥2.5倍為陽性，反應(yīng)孔OD 450nm吸光值＜2.5倍為陰性。
基于一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的抗血清在制備檢測苧麻花葉病毒的檢測試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測試劑盒的成分包括：PBS緩沖液、封閉液、堿性過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、顯色液；所述封閉液為含1％BSA的PBST緩沖液，所述顯色液的成分為：0.1M NaHCO3、0.001M MgCl2、0.3g/L NBT(四唑氮蘭)和0.15g/L BCIP(5 溴 4 氯 3 吲哚磷酸鹽)。
上述的應(yīng)用，進(jìn)一步的，所述應(yīng)用為Dot ELISA檢測，具體為：
S2 1、將待檢測物用PBS緩沖液研磨得到抗原溶液，將所述抗原溶液點(diǎn)在NC膜上用封閉液封閉；
S2 2、在NC膜上加入含有苧麻花葉病毒抗血清的一抗溶液，進(jìn)行孵育；
S2 3、在酶標(biāo)板中加入堿性過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗的溶液，進(jìn)行孵育；
S2 4、加入顯色液進(jìn)行顯色，顏色為深藍(lán)色至藍(lán)紫色為陽性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
(1)本發(fā)明提供了一種抗苧麻花葉病毒的抗血清，以我國湖南煙草的RaMoV分離物相對保守的CP基因?yàn)槟０?，獲得CP蛋白對應(yīng)編碼的氨基酸序列，并將氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用以增加靶基因的翻譯效率來提高重組蛋白的表達(dá)水平。隨后進(jìn)行原核表達(dá)、純化，利用純化的重組蛋白作為抗原，制備RaMoV專一型抗血清。
(2)(2)本發(fā)明提供了一種抗苧麻花葉病毒的抗血清的制備方法，抗RaMoV專一型抗血清的免疫原為RaMoV的CP重組蛋白，是由原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a CP表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白含HIS標(biāo)簽，用Ni IDA樹脂親和層析純化得到CP重組蛋白。
(3)本發(fā)明提供了抗苧麻花葉病毒的抗血清在檢測苧麻花葉病毒中的應(yīng)用，以制備的RaMoV抗血清，建立RaMoV特異性ELISA和Dot ELISA快速檢測方法，為該病毒的早期診斷以及田間大規(guī)模樣本大規(guī)模檢測提供技術(shù)方法，應(yīng)用于苧麻花葉病毒的間接ELISA檢測和Dot ELISA檢測。
附圖說明
為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中RaMoV CP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS PAGE圖。圖中M為蛋白Marker，泳道1 2為RaMoV CP重組蛋白。
圖1
圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中RaMoV CP多克隆抗體靈敏度檢測結(jié)果。圖中橫坐標(biāo)是RaMoV抗原稀釋梯度，縱坐標(biāo)是OD 450nm吸光值。
圖2
圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中RaMoV CP多克隆抗體特異性檢測結(jié)果。點(diǎn)1 4為感染RaMoV煙草，點(diǎn)5 6為健康煙草，點(diǎn)7 10為感染RaMoV苧麻，點(diǎn)11 12健康苧麻，點(diǎn)13 16為感染RaMoV煙粉虱，點(diǎn)17 18為健康煙粉虱。
圖3
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過市場購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
實(shí)施例
以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。
實(shí)施例1：
一種RaMoV CP蛋白多克隆抗體，以RaMoV CP蛋白作為免疫原免疫大白兔得到，具體制備方法為：
(1)制備RaMoV CP蛋白抗原：
1.1氨基酸序列獲取與密碼子優(yōu)化：
以GenBank上報(bào)道的苧麻花葉病毒(Ramie Mosaic virus，RaMoV)基因組中的CP基因?yàn)槟０澹褂肞rimer5.0在線設(shè)計(jì)引物對，引物對由上游引物和下游引物組成，上游引物的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的堿基序列的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。引物序列如下：
F：CGCATATGATGTCGAAGCGTCCC(SEQ ID NO.1)；
R：CGGAATTCATTACTGATAGAATCATAAA(SEQ ID NO.2)。
利用上述引物對感染RaMoV的感病樣品煙草DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到完整的RaMoV CP基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體的擴(kuò)增體系為：Template:1μL，TopTaq:1μL，10×Top Taq buffer:5μL，2.5mM dNTPs:4μL，上游引物/下游引物(10μM)各1μL；ddH2O定容至20μL。
擴(kuò)增程序?yàn)?/font>94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示在800bp位置處有單一條帶，與預(yù)期序列大小一致。擴(kuò)增獲得苧麻花葉病毒分離物CP堿基序列。
RaMoV CP基因序列為：ATGTCGAAGCGTCCCGCCGATATAGTGATTTCAACACCCGCCTCCAAAGTACGCCGCCGGCTGAACTTCGACAGCCCCGGGATCAGCCGTGCCGCTGCCCCCACTGTCCTCGTCACAAACAGAAGACGGGCTTGGACCTACAGGCCCATGTATCGCAAGCCCAAGATGTACAGGATGTTCAGAAGCCCAGATGTTCCTCGTGGCTGTGAAGGCCCATGTAAGGTCCAGTCCTTTGAGGCCCGTCATGATGTAACCCATACTGGTAAGGTTATTTGTATTTCAGATGTCACTCGTGGTGGTGGGCTGACCCACCGAACAGGCAAGAGGTTCTGCGTAAAGTCCGTTTACGTATTGGGTAAGATCTGGATGGATGAGAATATTAAGGTTAAGAACCATACAAATACAGTCATGTTTTTTGTTGTCCGAGACAGGAGGCCTTATGGAACCCCCCAGGATTTTGGGCAGGTGTTCAACATGTATGACAATGAGCCCAGTACTGCCACTGTGAAGAACGATCTTAGAGATCGTTTTCAAGTTATCCGTCGTTTTACGTCAACTGTTACTGGAGGTCAATATGCGAGCAAGGAACAAGCCCTTGTCAAGAAGTATATGAAGGTTAACGCTCAGGTGGTTTATAACCACCAGGAAGCTGGGAAATATGAGAATCATACTGAGAATGCTTTATTATTGTATATGGCTTGTACGCATTCTAGTAATCCCGTGTATGGAACTTTGAAAATCAGGATCTATTTTTATGATTCTATCAGTAATTAA。
翻譯對應(yīng)編碼的氨基酸序列，氨基酸序列如下：
MSKRPADIVISTPASKVRRRLNFDSPGISRAAAPTVLVTNRRRAWTYRPMYRKPKMYRMFRSPDVPRGCEGPCKVQSFEARHDVTHTGKVICISDVTRGGGLTHRTGKRFCVKSVYVLGKIWMDENIKVKNHTNTVMFFVVRDRRPYGTPQDFGQVFNMYDNEPSTATVKNDLRDRFQVIRRFTSTVTGGQYASKEQALVKKYMKVNAQVVYNHQEAGKYENHTENALLLYMACTHSSNPVYGTLKIRIYFYDSISN。
將上述氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并于5’端添加His標(biāo)簽序列，優(yōu)化后得到的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，具體為：
CACCATCATCATCATCATAGCAAACGCCCGGCGGATATTGTTATTAGCACCCCGGCAAGTAAAGTCCGTCGTCGCCTGAACTTTGATAGCCCGGGTATTAGTCGCGCAGCAGCACCGACCGTTTTAGTTACCAATCGTCGTCGCGCTTGGACCTATCGTCCGATGTACCGCAAACCGAAAATGTACCGCATGTTTCGTAGTCCGGACGTTCCGCGCGGTTGCGAAGGTCCGTGTAAAGTCCAGAGCTTTGAAGCACGTCACGACGTTACCCATACCGGCAAAGTCATCTGCATTAGCGACGTTACCCGCGGCGGCGGTTTAACCCATCGTACCGGTAAACGCTTCTGCGTTAAAAGCGTCTACGTCCTGGGCAAAATCTGGATGGACGAGAACATCAAAGTCAAAAACCACACCAACACCGTGATGTTCTTTGTCGTTCGCGATCGTCGTCCGTACGGTACCCCGCAAGATTTTGGTCAAGTCTTCAACATGTACGACAACGAACCGAGCACCGCAACCGTTAAAAACGATCTGCGCGATCGCTTTCAGGTCATTCGTCGTTTTACCAGCACCGTTACCGGCGGTCAATACGCAAGTAAAGAGCAGGCGCTGGTCAAAAAATACATGAAAGTCAACGCGCAGGTCGTTTATAACCATCAGGAAGCGGGCAAATACGAAAACCACACCGAAAACGCGTTACTGCTGTACATGGCTTGCACCCATAGCAGTAATCCGGTTTACGGTACCCTGAAAATCCGCATCTACTTCTACGACAGCATCAGCAACTAA。
1.2原核表達(dá)載體構(gòu)建：
體外合成少量上述核酸片段，以上述密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列為模板，使用Primer5.0在線設(shè)計(jì)引物對，引物對由上游引物和下游引物組成，引物5’端添加酶切位點(diǎn)，上游引物的堿基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的堿基序列的堿基序列如SEQ ID NO.5所示。引物序列如下：
F：CATATGCACCATCATCATCATCAT(SEQ ID NO.4)；
R：AAGCTTTCATTAGTTGCTGATGC(SEQ ID NO.5)。
利用上述引物對密碼子優(yōu)化核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同1.1。重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用雙酶切法，參照說明書進(jìn)行：將優(yōu)化后基因的PCR產(chǎn)物和pET30a通過NdeI Hind III進(jìn)行雙酶切，分別純化后，用T4連接酶連接，得到重組表達(dá)載體pET30a CP。
1.3重組蛋白的表達(dá)和分析：
在42℃熱激50S，使重組載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(轉(zhuǎn)化方法參照[美]J.薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002)。
將得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含50(μg/mL)的卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12h。
挑取平板上的陽性單菌落，采用菌落PCR驗(yàn)證。
含有pET30α CP重組子的工程菌Rosetta pET30α CP接種到4mL的LB培養(yǎng)基中(含50μg/mL的卡那霉素)，培養(yǎng)至OD 600＝0.5～0.8，將上述培養(yǎng)液以1∶100體積比接種于20mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD 600為0.6～0.7(培養(yǎng)時(shí)間一般為2～4h)，加入誘導(dǎo)劑異丙基 β d 硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.8mM，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)時(shí)間為16h內(nèi)取菌液檢測。取菌液，離心收集菌體。取誘導(dǎo)的菌液作為對照。
全菌采用20mMPB(pH7.2)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％TritonX 100，1mM DTT，1mM PMSF超聲裂解，同時(shí)以20mM PB(pH7.2)，300mM NaCl，20mM Imidazole緩沖液平衡Ni IDA親和層析柱，之后用不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，并收集每個(gè)洗脫組分。
將收集的洗脫組分用12％(v/v)SDS PAGE凝膠在100V，25mA的電泳條件下電泳2h，然后用考馬斯亮藍(lán)染液(考馬斯亮藍(lán)染液的成分包括：0.1％(w/v)考馬斯亮蘭，45％(v/v)甲醇，10％(v/v)冰醋酸、余量的ddH2O)染色15min，最后用脫色液(脫色液的成分包括：40v/v％甲醇，10v/v％冰醋酸，50v/v％無菌水脫色1h后觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果參見圖1。
從圖1的電泳結(jié)果中可知：收集的洗脫組分有約35kDa的蛋白表達(dá)，此大小與CP蛋白氨基酸序列加上標(biāo)簽His基因融合蛋白的氨基酸分子大小基本一致，認(rèn)為此蛋白為融合表達(dá)CP蛋白。
1.4重組蛋白純化和濃度測定：
經(jīng)Ni IDA親和層析純化分析，收集純度較高的Lane1 2，將其加入到處理后的透析袋中，4℃環(huán)境下，透析到緩沖液(緩沖液的成分為：1×PBS(pH7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4ML Arginine，1M Urea，5％Glycerol)中復(fù)性，復(fù)性后CP His蛋白最終透析于儲(chǔ)存液1×PBS(pH7.4)溶液約6 8h。透析復(fù)性結(jié)束后，上清用0.22μm濾器過濾后分裝，并將其凍存至 80℃。
(2)制備RaMoV CP蛋白多克隆抗體：
以純化蛋白CP His為抗原，免疫2只新西蘭白兔(2 2.5kg)，皮下免疫，初免劑量為300μg/只，二免、三免、四免的劑量為150μg/只，2 3周免疫1次。免疫4次后，采血檢測，使用抗原親和純化的方法獲得針對CP His抗原的特異性多克隆抗體和抗血清，所得的RaMoV CP多克隆抗體的濃度為1.22mg/ml。
實(shí)施例2
一種實(shí)施例1的RaMoV CP蛋白多克隆抗體在在檢測苧麻花葉病毒中的應(yīng)用，具體的實(shí)驗(yàn)過程如下：
(1)包被：用10×PBST緩沖液包被RaMoV抗原，將實(shí)施例1中所述的RaMoV蛋白稀釋液(即為RaMoV抗原)，用抗體稀釋液進(jìn)行梯度稀釋，依次稀釋1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000倍、64000倍、128000倍的各RaMoV抗原梯度稀釋液，在酶標(biāo)板的各孔中依次加入100μl前述各RaMoV抗原梯度稀釋液，4℃過夜。用含1％BSA的10×PBST緩沖液(pH7.4)作為陰性對照。
所述BSA為牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)。
(2)洗板：將已包被的酶標(biāo)板用PBST洗滌三次，5分鐘/次。
(3)封閉：每孔加入150ul封閉液，37℃封閉60分鐘。所述洗滌液為的10×BST緩沖液(pH7.4)；所述封閉液為含的1％BSA的PBST緩沖液。
(4)洗板：用PBST洗滌三次，5分鐘/次。
(5)加一抗：封閉后的酶標(biāo)板按原加有不同稀釋倍數(shù)的RaMoV抗原的各孔中加入200μl一抗稀釋液，37℃孵育1小時(shí)。所述一抗稀釋液是將實(shí)施例2獲得的濃度為1.22mg/ml的RaMoV CP多克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋為500倍的RaMoV CP多克隆抗體(即濃度為2.44μg/ml的RaMoV CP多克隆抗體)，所述抗體稀釋液為含1％BSA的10×PBST緩沖液(pH7.4)。
(6)洗板：用PBST洗滌三次，5分鐘/次。
(7)加二抗：每孔加入二抗稀釋液200μl，37℃溫育1h，用10×PBST緩沖液(pH7.4)洗滌3次。所述二抗稀釋液為將辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗用抗體稀釋液稀釋至5000倍，所述抗體稀釋液為含1％BSA的PBST緩沖液。
(8)洗板：用PBST洗滌三次，5分鐘/次。
(9)顯色：加入TMB(3,3',5,5' 四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液100μl/孔，反應(yīng)約15min，最后加入100μl2mol/L硫酸終止液終止反應(yīng)。所述顯色終止液為用無菌水配制的濃度為2M的硫酸溶液。
(10)測OD值：用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定OD值。以各孔的OD 450nm吸光值為縱坐標(biāo)，以本實(shí)施例步驟(2)中所述的RaMoV抗原梯度稀釋液的稀釋度為橫坐標(biāo)，結(jié)果見圖2。取陰性對照OD 450nm吸光值的2.5倍為臨界值，反應(yīng)孔OD 450nm吸光值≥2.5倍為陽性，反應(yīng)孔OD 450nm吸光值＜2.5倍為陰性。
圖2表明，在RaMoV多克隆抗體稀釋2000倍時(shí)(濃度為0.25μg/ml)，抗原的最大稀釋倍數(shù)為128000倍，即抗原的濃度為3.9ng/ml，此時(shí)RaMoV多克隆抗體仍能特異性的識別RaMoV抗原，表明其RaMoV CP多克隆抗體的靈敏度高。
實(shí)施例3
一種實(shí)施例1的RaMoV CP蛋白多克隆抗體在在檢測苧麻花葉病毒中的應(yīng)用，采用Dot ELISA法檢測RaMoV CP多克隆抗體的特異性。測試以下3種樣品：RaMoV侵染的三生煙苗葉片、RaMoV侵染的苧麻葉片和RaMoV侵染的煙粉虱成蟲。
Dot ELISA法的實(shí)驗(yàn)步驟包括：
(1)樣本制備：0.1g植株葉片或煙粉虱成蟲，加入1mL 0.01mol/L的PBS緩沖液充分碾磨，12000rpm離心5min，上清即為抗原溶液。
(2)封閉：每個(gè)樣品取2μL點(diǎn)在NC膜上，37℃孵育30min，將NC膜浸入封閉液中，37℃室溫封閉30min。用PBST洗滌液洗滌3次，每次5min。所述洗滌液為的10×PBST緩沖液(pH7.4)；所述封閉液為含的1％BSA的PBST緩沖液。
(3)加一抗：NC膜置于50mL一抗稀釋液，37℃孵育1h，然后用洗滌液洗滌3次，每次5min。所述洗滌液為10×PBST緩沖液；所述一抗稀釋液是將實(shí)施例2獲得的濃度為1.22mg/ml的RaMoV CP多克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋為500倍的RaMoV CP多克隆抗體(即濃度為2.44μg/ml的RaMoV CP多克隆抗體)，所述抗體稀釋液為含1％BSA的10×PBST緩沖液(pH7.4)。
(4)加二抗：NC膜置于二抗稀釋液，37℃溫育30min，用10×PBST緩沖液(pH7.4)洗滌5次，每次5min。所述二抗稀釋液為將堿性過氧化物酶(Alkaline Peroxidase，AP)標(biāo)記羊抗兔二抗用抗體稀釋液稀釋至5000倍，所述抗體稀釋液為PBST緩沖液。
(5)顯色：NC膜置于20mL底物NBT/BCIP稀釋液(1∶500稀釋)中進(jìn)行顯色，室溫下顯色10min。所述顯色液含0.1M NaHCO3、0.001M MgCl2、0.3g/LNBT(四唑氮蘭)和0.15g/L BCIP(5 溴 4 氯 3 吲哚磷酸鹽)。
(6)結(jié)果判定：顏色為深藍(lán)色至藍(lán)紫色為陽性。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中RaMoV CP多克隆抗體特異性檢測結(jié)果。點(diǎn)1 4為感染RaMoV煙草，點(diǎn)5 6為健康煙草，點(diǎn)7 10為感染RaMoV苧麻，點(diǎn)11 12健康苧麻，點(diǎn)13 16為感染RaMoV煙粉虱，點(diǎn)17 18為健康煙粉虱。
圖3結(jié)果表明，感染RaMoV的煙草、苧麻葉片和煙粉虱樣本顯示深藍(lán)色，未感染RaMoV的煙草、苧麻葉片和煙粉虱樣品不顯示深藍(lán)色，表明RaMoV CP多克隆抗體特異性強(qiáng)。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：彭靜，高陽，張德詠，劉勇，鄭立敏，譚新球，史曉斌，朱春暉，張卓，孫書娥，申請?zhí)?/font>：202210923345.9，申請日：2022.08.02
