摘  要：該文以苧麻Boehmeria nivea（L.）Gaudich為實(shí)驗(yàn)材料，研究?jī)?nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下對(duì)苧麻幼苗葉綠素、可溶性糖、蛋白質(zhì)、脯氨酸和谷胱甘肽等生理生化指標(biāo)的影響。研究表明，重金屬鎘毒害降低苧麻幼苗葉綠素、可溶性糖和谷胱甘肽等含量；而蛋白質(zhì)和脯氨酸的含量在低鎘濃度時(shí)上升，但隨著鎘濃度的增加也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；加入內(nèi)生細(xì)菌處理后，苧麻各生理生化指標(biāo)相比對(duì)照都有上升。結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌在一定程度上通過(guò)改善苧麻的生理生化特性來(lái)緩解鎘對(duì)苧麻幼苗造成的脅迫。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細(xì)菌；鎘脅迫；苧麻；生理生化；重金屬污染

 

鎘（Cd）是一種生物毒性非常強(qiáng)的重金屬。土壤受到鎘污染后，會(huì)使農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育受到阻礙，產(chǎn)量下降^[1]。植物體內(nèi)吸收的過(guò)量的重金屬易通過(guò)干擾植物細(xì)胞正常代謝，影響光合系統(tǒng)，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻，所以在重金屬高度污染的地區(qū)很難有植物能生長(zhǎng)存活^[2-3]。因此，了解重金屬脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響對(duì)于尋找提高植物抗逆性方法具有重要意義。重金屬治理修復(fù)最常見(jiàn)的技術(shù)大致可分為物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)及生物修復(fù)^[4]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是一種效率高、低成本、低污染的極具潛力的方案^[5]。

至今為至，已有500多種重金屬超富集植物，其中用于Cd污染的富集植物較少，主要有寶山堇菜（Viola baoshanensis）、大花金雞菊（Coreopsis grandiflora Hogg）、忍冬（Lonicera japonica Thunb）和苧麻^[6]。苧麻蕁麻科，多年生草本宿生植物，原產(chǎn)于東亞，高可達(dá)0.5~1.5m，是世界上最古老的纖維作物之一^[7]。我國(guó)是苧麻的原產(chǎn)地，擁有約2000份苧麻種質(zhì)資源，其遍布我國(guó)21個(gè)?。▍^(qū)）。此外，苧麻生物量較大，一年可收割3次，根系深度可達(dá)60cm^[8]?？等f(wàn)利等^[9]研究表明，苧麻根系入土深、主根發(fā)達(dá)、根系分布廣、固土能力強(qiáng)及葉面積指數(shù)大等，是一種優(yōu)良的水土保持和環(huán)境治理植物，在湖南境內(nèi)大部分地區(qū)都有分布。

目前，重金屬想要徹底治理又不造成二次污染的方法還未見(jiàn)報(bào)道，只能將重金屬轉(zhuǎn)移或遷移，不能被降解。研究證明，植物與內(nèi)生細(xì)菌聯(lián)合修復(fù)是一種綠色的修復(fù)技術(shù)，不會(huì)造成二次污染^[10]。植物修復(fù)因其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，與物理、化學(xué)修復(fù)等相比缺點(diǎn)顯而易見(jiàn)，因此，利用微生物結(jié)合植物修復(fù)顯得尤為重要。

內(nèi)生細(xì)菌在植物修復(fù)研究中受到廣泛關(guān)注^[11]。植物相關(guān)細(xì)菌在宿主適應(yīng)不斷變化的環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。研究表明，超富集植物的內(nèi)生細(xì)菌可能是重金屬生物吸附的高效生物吸附劑的潛在資源^[12]。內(nèi)生細(xì)菌特別受關(guān)注，因其具有相對(duì)免受土壤競(jìng)爭(zhēng)性高應(yīng)力環(huán)境影響的優(yōu)勢(shì)^[13]。

此外，微生物還能促進(jìn)植物的旺盛生長(zhǎng)，增大其生物量。由于內(nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)，不易受外界環(huán)境的影響，可長(zhǎng)期持續(xù)作用，具有良好開(kāi)發(fā)利用前景^[14]。本研究將內(nèi)生細(xì)菌運(yùn)用接種到處于不同程度鎘脅迫下的苧麻上，從生長(zhǎng)情況、葉綠素相對(duì)含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及丙二醛含量等生理方面研究該內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鎘脅迫下苧麻生長(zhǎng)的影響，以期為重金屬抗性微生物在鎘污染領(lǐng)域緩解植物生長(zhǎng)毒害作用的應(yīng)用提供理論支撐，發(fā)現(xiàn)良好的重金屬抗性內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于輔助苧麻修復(fù)重金屬鎘污染環(huán)境的修復(fù)中。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

苧麻種子于湖南人文科技學(xué)院校園內(nèi)采集。所用菌株是本實(shí)驗(yàn)室從婁底市冷水江錫礦石重金屬污染區(qū)的作物中分離篩選出來(lái)的對(duì)鎘有抗性的植物內(nèi)生細(xì)菌xks-03。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

選取均勻飽滿的苧麻種子分成2組分別在清水和稀釋100倍的菌液中浸種24h，再分別分成3組擺放于培養(yǎng)皿中即6個(gè)處理組，清水浸種的3組分別用含Cd2+濃度為0mg/L、50mg/L、100mg/L的溶液和蒸餾水進(jìn)行澆灌，菌液浸種的3組則用含Cd2+濃度為0mg/L、50mg/L、100mg/L的溶液和菌液進(jìn)行澆灌，每次各加入10mL，一起放入恒溫培養(yǎng)箱中（25℃）進(jìn)行培養(yǎng)，待發(fā)芽后移植到土壤栽培，繼續(xù)澆灌。約半個(gè)月后，隨機(jī)從每組抽取一植株測(cè)定總糖含量（蒽酮比色法）、蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法）、葉綠素含量（丙酮法）與谷胱甘肽（DTNB法）和脯氨酸（磺基水楊酸法）等指標(biāo)。

1.2.1葉綠素的測(cè)定

稱取0.1g鮮葉，用丙酮和95%乙醇混合液提取，然后在663、645nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算葉綠素含量。

1.2.2可溶性糖的測(cè)定

稱取新鮮葉片0.25g，研磨勻漿，加入5mL蒸餾水，100℃沸水煮40min，快速冷卻后過(guò)濾，定容至25mL按蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖的含量。

1.2.3可溶性蛋白的測(cè)定

稱取苧麻幼苗倒數(shù)第三葉0.23g，用5mL生理鹽水研磨成勻漿，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法測(cè)定苧麻幼苗中可溶性蛋白。

1.2.4脯氨酸的測(cè)定

剪取苧麻上部分0.2g新鮮葉片，用3%的磺基水楊酸溶液研磨成勻漿，通過(guò)酸性茚三酮顯色法測(cè)定游離脯氨酸的含量用。

1.2.5谷胱甘肽的測(cè)定

稱取0.1g新鮮葉片，加入5%三氯乙酸（TCA）溶液后進(jìn)行研磨，定容。13000rpm，-4℃離心10min，取上清液定容至1.5mL。取0.5mL上清液，加入0.5mL蒸餾水，測(cè)定谷胱甘肽的含量。

苧麻所測(cè)各種生理生化指標(biāo)的含量或變化均以鮮重（FW）為單位計(jì)算，每個(gè)處理組重復(fù)3次測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）來(lái)表示。首先用Excel2020軟件完成基本的數(shù)據(jù)錄入與計(jì)算，用SPSS.20軟件進(jìn)行差異性分析。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生細(xì)菌在不同鎘濃度下苧麻幼苗葉綠素的變化

不同濃度的鎘脅迫對(duì)苧麻葉片葉綠素含量的影響不同。圖1中，在不加鎘溶液時(shí)，空白處理組中葉綠素含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量高，兩組無(wú)顯著性差異（P<0.05）；50mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組葉綠素含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，加內(nèi)生細(xì)菌處理顯著高于空白處理（P<0.05）；100mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組葉綠素含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，兩組無(wú)顯著性差異（P<0.05）。

  

注：圖中大小寫(xiě)字母不同分別表示在1%和5%水平差異顯著，下同。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌在不同鎘濃度下苧麻幼苗葉綠素含量

2.2內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗可溶性總糖的變化

可溶性糖的含量是衡量植株生理活性的一個(gè)指標(biāo)，鎘毒害使可溶性糖含量降低。圖2中，在無(wú)鎘脅迫時(shí)，空白處理組中可溶性糖含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，加內(nèi)生細(xì)菌處理顯著高于空白處理（P<0.05），且具有極顯著性差異（P<0.01）；在50mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中可溶性糖含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，加內(nèi)生細(xì)菌處理顯著高于空白處理（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中可溶性糖含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，兩組無(wú)顯著性

  

圖2 內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗可溶性總糖的含量

2.3內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗蛋白質(zhì)的變化

內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗蛋白質(zhì)的變化見(jiàn)圖3。圖3中，在無(wú)鎘脅迫時(shí)，空白處理組中蛋白質(zhì)含量低于加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量，加內(nèi)生細(xì)菌處理組顯著高于空白處理組（P<0.05）；在50mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中蛋白質(zhì)含量低于加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量，但無(wú)顯著性差異（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中蛋白質(zhì)含量低于加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量，加內(nèi)生細(xì)菌處理組高于空白處理組（P<0.05）達(dá)到顯著水平。

  

圖3 內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗蛋白質(zhì)的含量

2.4內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗脯氨酸的變化

內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗脯氨酸的變化見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，隨鎘濃度的增加，苧麻的脯氨酸含量呈先上升后降低趨勢(shì)。在無(wú)鎘脅迫時(shí)，空白處理組中脯氨酸含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，兩者無(wú)顯著性差異（P<0.05）；在50mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中脯氨酸含量明顯低于加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量，但兩者無(wú)顯著性差異（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中脯氨酸含量比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，兩組無(wú)顯著性差異（P<0.05）。

  

圖4 內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗脯氨酸的含量

2.5內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗谷胱甘肽的變化

從圖5中可以看出，在3個(gè)鎘溶液處理中，加入菌液處理中的谷胱甘肽含量都比不加菌液處理的高。在無(wú)鎘脅迫時(shí)，空白處理組中谷胱甘肽含量低于加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量，但兩組無(wú)顯著性差異（P<0.05）；在50mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中谷胱甘肽含量明顯比加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量低，加內(nèi)生細(xì)菌處理組顯著高于空白處理組（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時(shí)，空白處理組中谷胱甘肽含量明顯低于加內(nèi)生細(xì)菌處理組的含量，加內(nèi)生細(xì)菌處理組顯著高于空白處理組（P<0.05）。隨著鎘濃度的增加，內(nèi)生細(xì)菌對(duì)苧麻谷胱甘肽含量的合成效果越顯著。

  

圖5 內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下苧麻幼苗谷胱甘肽的含量

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要研究在重金屬鎘污染土壤上苧麻利用內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行處理后，重金屬鎘對(duì)苧麻幼苗的脅迫影響及內(nèi)生細(xì)菌對(duì)苧麻受重金屬鎘污染的緩解作用。

葉綠素是植物中的綠色物質(zhì)，是一種復(fù)雜的有機(jī)酸，與作物葉片葉綠素含量具有顯著水平的相關(guān)性，而葉綠素含量是反映葉片光合能力的重要指標(biāo)，與光合作用的性能密切相關(guān)^[15]。耐銻促生菌能通過(guò)顯著提高植物中的葉綠素含量來(lái)促進(jìn)光合作用。苧麻幼苗在鎘脅迫下，葉綠素含量在內(nèi)生細(xì)菌處理組均顯著高于空白組。而且隨著鎘濃度增加，葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明了鎘脅迫會(huì)破壞苧麻葉綠素的合成，但通過(guò)添加內(nèi)生細(xì)菌，能夠緩和重金屬鎘對(duì)苧麻的毒害。

植物體內(nèi)可溶性糖含量代表其體內(nèi)碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)化與輸出代謝情況。本研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量是隨著鎘濃度的增加而顯著下降的，這表明鎘對(duì)苧麻幼苗產(chǎn)生可溶性糖的脅迫較強(qiáng)。但可以明顯看出，加入內(nèi)生細(xì)菌后，可溶性糖含量有所提高。

可溶性蛋白的變化是衡量重金屬污染的重要指標(biāo)。研究表明，一定范圍的鎘濃度處理能夠促進(jìn)苧麻的可溶性蛋白含量的合成，隨著鎘濃度的增加苧麻的可溶性蛋白含量也隨之增加^[16]。同時(shí)也表明，隨著鎘處理濃度增加，蛋白質(zhì)含量上升。這可能是由于鎘作為一種逆境因子，激活了苧麻幼苗一些抗性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，但是高濃度鎘使可溶性蛋白含量明顯減少。但添加內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)苧麻的可溶性蛋白合成明顯高與未加菌組，說(shuō)明內(nèi)生細(xì)菌能夠促進(jìn)植物的可溶性蛋白的合成。

脯氨酸是植物體內(nèi)水溶性最大的氨基酸，具有較強(qiáng)的水合能力，是理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在鎘濃度低時(shí)，脯氨酸含量上升；鎘濃度高時(shí)，脯氨酸含量下降，這說(shuō)明鎘脅迫導(dǎo)致苧麻葉片中游離脯氨酸大量積累，脯氨酸的累積可能是苧麻對(duì)鎘毒害的一種保護(hù)性適應(yīng)。但高濃度鎘則對(duì)植物造成迫害，導(dǎo)致脯氨酸不能合成。從研究結(jié)果中看出，加入內(nèi)生細(xì)菌處理后，脯氨酸含量明顯提高。說(shuō)明內(nèi)生細(xì)菌能夠有效修復(fù)植物合成脯氨酸。

植物內(nèi)的谷胱甘肽含量能有效衡量植株對(duì)鎘富集和耐受能力的大小。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鎘濃度的增加，谷胱甘肽的含量極具減少，發(fā)現(xiàn)表明鎘處理濃度的增加加強(qiáng)對(duì)苧麻幼苗的脅迫作用。加入內(nèi)生細(xì)菌處理后與同濃度鎘相比，谷胱甘肽含量比顯著提高，表明內(nèi)生細(xì)菌在一定程度上緩解了鎘對(duì)苧麻幼苗的抑制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在重金屬鎘污染下苧麻幼苗生長(zhǎng)受到明顯抑制，苧麻幼苗的生長(zhǎng)和各生理指標(biāo)都受到影響，表現(xiàn)為重金屬鎘毒害使苧麻幼苗葉綠素、可溶性糖和谷胱甘肽等含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；而蛋白質(zhì)和脯氨酸的含量在鎘濃度低時(shí)上升，并隨著鎘濃度的增加而下降。加入內(nèi)生細(xì)菌與鎘處理后，內(nèi)生細(xì)菌具有緩解或抑制鎘毒害的作用。

 

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文章摘自：向書(shū)琴，胡春玉，黃寶蘭等.內(nèi)生細(xì)菌在鎘脅迫下對(duì)苧麻幼苗生理生化特性的影響[J].智慧農(nóng)業(yè)導(dǎo)刊，2023，3(06)：22-25.DOI：10.20028/j.zhnydk.2023.06.006.