摘  要：對漢麻 Alfin-like 轉錄因子家族進行鑒定和生物信息學分析，為 Alfin-like 轉錄因子調控漢麻生長發(fā)育及抗性奠定基礎。通過利用擬南芥 Alfin-like 轉錄因子蛋白序列作為模板，利用 TBtools、MEGA 等生物信息學工具分析漢麻全基因組數(shù)據(jù)。在漢麻基因中共鑒定出 5 個 CsALs 基因，對其進行了理化性質分析、亞細胞定位、保守基序、基因結構、染色體定位、順式元件、共線性分析、進化分析及聚類分析等基礎分析。結果表明：鑒定的 5個漢麻 AL 轉錄因子均含有 DUF3594 結構域（PAL 結構域）和 PHD 手指狀結構域；經(jīng)理化性質分析得出，CsALs蛋白質長度在 239～256 aa 之間，等電點在 4.97～5.31 之間，親水性為–0.809～–0.623，屬于酸性親水蛋白；CsALs基因分布在 4 條染色體上，亞細胞定位發(fā)現(xiàn) AL 轉錄因子均定位在細胞核；上游 2 000 bp 啟動子元件分析與光響應、脅迫響應和激素相關；根據(jù)與擬南芥、大豆、水稻、玉米、煙草等系統(tǒng)發(fā)育分析共分為 B、E、F 3 個亞族；熱圖聚類分析表明 CsALs 基因在漢麻中具有較高表達。

關鍵詞：漢麻；Alfin-like；成員鑒定；生物信息學；表達分析

 

Alfin-like 轉錄因子家族 N 端含有高度保守的DUF3594 結構域、C 末端含有 PHD 手指狀蛋白和保守結構域之間的可變區(qū)域，是植物中小型特異性基因家族，該轉錄因子家族首次在苜蓿中被鑒定[1-3]。Alfin1 是苜蓿中根和愈傷組織特異性轉錄因子，通過結合 MsPRP2 的啟動子，增強其耐鹽表達，其過表達明顯改善根系生長狀況^[4-5]。擬南芥中 AL 家族中PHD 手指蛋白可以與賴氨酸 4（H3K4me3/2）高度甲基化形式結合，也是擬南芥各種植物組織中表達的核蛋白，并參與染色質調節(jié)^[6]。擬南芥 AL6、 AL7 在種子中優(yōu)先表達，其中 AL PHD-PRC1 復合物以染色質的形式激活 H3K4me3 轉錄轉換至 H3K27me3 種子萌發(fā)^[7]。AL6 在擬南芥幼苗生長期間通過調節(jié)染色質結構協(xié)調磷酸鹽和茉莉酸鹽信號轉導^[8]。目前 AL 基因在擬南芥^[9]、玉米^[10]、核桃^[11]、棉花^[12]中被鑒定。

漢麻又稱為工業(yè)大麻(Cannabis sativa)，屬大麻科(Cannabinaceae)，春種夏收，是一年生直立草本植物^[13]。7000 年前我國已開始將工業(yè)大麻應用于生產(chǎn)生活，近 30 年，工業(yè)大麻被歐美專家稱為“最完美纖維”、“第二層皮膚”^[14-15]。毒品大麻與漢麻的區(qū)別在于 THC 含量，低于 0.3%THC 含量的大麻為漢麻，應用于纖維制衣、食品面粉、大麻籽油、乙醇燃料^[16-17]。但關于 Alfin-like 相關研究很少，對漢麻中 Alfin-like 轉錄因子家族進行生物信息學分析，基于漢麻全基因組數(shù)據(jù)，分析其家族成員，進行基因定位、基因結構、順式作用元件、保守基序、與擬南芥共線性分析，并與其他作物進行同源序列比對，為進一步研究其生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1漢麻 AL 轉錄因子家族的鑒定

漢麻、擬南芥全基因序列與蛋白質序列來源于 NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、擬南芥 Alfin-like  轉錄因子蛋白序列來源于 TAIR （https://www.arabidopsis.org/）。根據(jù)擬南芥 AL 轉錄因子家族利用 TBtools 中的 blast 比對分析 CsALs候選基因，并上傳 Pfam 進行結構域鑒定，除去不含 Alfin、PHD 結構域的候選基因，最終確定漢麻 Alfin-like 轉錄因子相關基因。

1.2漢麻 AL 轉錄因子定位及進化樹分析

將漢麻全基因組注釋文件與篩選出的 CsALs 轉錄因子基因號導入 TBtools 進行基因定位可視化。利用NCBI 對玉米、大豆、水稻、煙草進行 blast 比對，并下載其 Alfin-like 轉錄因子蛋白序列，使用 MEGA 7.0 與擬南芥 、漢麻根據(jù)鄰近算法 (neighbor-joining，NJ) 構建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用在線工具 EvolView（https://www.evolgenius.info/）對進化樹進行美化。

1.3漢麻 AL 轉錄因子保守基序及基因結構分析

利用在線網(wǎng)站 MEME （ https://meme-suite. org/meme/tools/meme）分析漢麻 Alfin-like 轉錄因子相關基因的保守基序，基序預測選擇 10，其他設置默認。將 MEME 分析結果、漢麻全基因組注釋文件、 CsALs 轉錄因子基因號導入 TBtools 進行保守基序、基因結構結果可視化。

1.4漢麻 AL 轉錄因子家族理化性質分析及亞細胞定位

使用在線網(wǎng)站 Expasy （ https://web.expasy. org/protparam/）分析漢麻 Alfin-like 轉錄因子基因的理化性質，包括氨基酸數(shù)、等電點、分子量、親水性。利用在線工具Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預測漢麻 Alfin-like轉錄因子基因的亞細胞定位。

1.5漢麻 AL 轉錄因子順式作用元件及共線性分析

篩選漢麻 Alfin-like 轉錄因子基因上游 2 000 bp利用在線軟件PlantCARE 分析其啟動子順式作用元件，使用 TBtools 中 Dual Systeny Plot for MCScanX分析漢麻與擬南芥共線性共線性關系，利用 TBtools對順式作用元件、共線性進行可視化。

1.6漢麻 AL 轉錄因子不同品種表達模式分析

根據(jù)已報道的 9 個大麻栽培品種（Black Berry Kush， Black Lime， Canna Tsu， Cherry Chem， Valley Fire，Mama Thai， Sour Diesel， Terple 和 White Cook- ies）腺毛轉錄組數(shù)據(jù)[18]篩選關于漢麻 Alfin-like 轉錄因子基因的表達量數(shù)據(jù)并導入 TBtools 軟件中繪制熱圖，對其進行不同品種表達量的聚類分析。

2結果與分析

2.1漢麻 AL 轉錄因子家族理化性質分析及亞細胞定位

通過 Pfam 結構域驗證，除去重復基因共篩選出 5 個 CsALs 基因，分別命名 CsAL1~5。CsALs 基因分別定位在 4 條染色體上，其中 4 號染色體上包含兩個基因，分別為 CsAL4、CsAL5。經(jīng)理化性質分析基因長度在 1 285～1 391 bp 之間。經(jīng)理化性質分析得出，CsALs 蛋白質長度在 239～256 aa 之間，等電點在 4.97～5.31 之間，屬于酸性蛋白。親水性為–0.809～–0.623，均小于 0，屬于親水蛋白，亞細胞定位均在細胞核。

2.2漢麻 AL 轉錄因子定位及進化樹分析

將漢麻、擬南芥、大豆、水稻、玉米及煙草中 Alfin-like 轉錄因子進行多序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 1），6 種植物共分為 6 個亞族（A～F）。漢麻 Alfin-like 轉錄因子共分為 B、E、F3 個亞族，這與擬南芥 AL 轉錄因子家族分類一致，CsAL1 聚類到 B 亞族、CsAL4、CsAL5 聚類到 E 亞族、CsAL2、 CsAL3 聚類到 F 亞族。漢麻與大豆、煙草親緣關系較近，與水稻、玉米親緣關系較遠，表明單子葉植物與雙子葉植物進化上發(fā)生分歧。

2.3漢麻 AL 轉錄因子保守基序及基因結構分析

CsALs 保守基序均含有 motif1、motif2、motif3、motif4、motif6、motif9。僅有 CsAL1 含有 motif10，但不含 motif8。CsAL2 不含有 motif5，含有兩個 motif8。motif7 只存在于 CsAL4、CsAL5 中。CsAL3包含所有 CsALs 共同的保守基序。圖 2 中，CsAL1、CsAL2、CsAL4、CsAL5 基因含有 2 個外顯子和 5個內含子，其中 CsAL4、CsAL5 基因外顯子內含子所在位置、長度一致、結構相似，具有相同的基因功能，CsAL3 含有 3 個外顯子和 5 個內含子，內含子長度與其他 4 個基因類似。圖 3 中對 CsALs 進行了多序列比對，漢麻 Alfin-like 轉錄因子 N 端含有大約 130 個氨基酸的 DUF3594 結構域，C 端含有大約 60 個氨基酸的 PHD 結構域。CsAL4、CsAL5 保守基序、基因結構十分相似。綜合保守基序、基因結構及多序列比對分析得出 CsALs 基因具有高度保守性。

表1 CsALs 理化性質分析及亞細胞定位

Table1 CsALs physicochemical property analysis and subcellular localization

  

  

紅色為 A 亞族，橙色為 B 亞族，黃色為 C 亞族；綠色為 D 亞族，藍色為 E 亞族，紫色為 F 亞族；CsAL 為漢麻 AL 基因，AtAL 為擬南芥 AL 基因，GmAL 為大豆 AL 基因，OsAL 為水稻 AL 基因，ZmAL 為玉米 AL 基因，NtAL 為煙草 AL 基因。

圖1 漢麻、擬南芥、大豆、水稻、玉米及煙草 AL 基因系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 1  Phylogenetic AL gene phylogeny of Cannabis sativa， Arabidopsis thaliana， Glycine max， Oryza sativa， Zea mays and Nicotiana tabacum

2.4漢麻 AL 轉錄因子順式作用元件及共線性分析

在漢麻 Alfin-like 轉錄因子基因上游 2 000 bp 區(qū)域分析其順式作用元件（圖 4）。共鑒定 13 個關于激素響應元件與脅迫響應元件。其中 CsALs 含有較多的光響應元件，其次含有較多的激素類相應元件——茉莉酸甲酯（17 個）、脫落酸（14 個）、生長素（8 個），脅迫響應元件包括厭氧響應元件（7 個）、低溫響應元件（4 個）。推測漢麻 Alfin-like 轉錄因子家族與植物激素和生物脅迫關系密切。圖 5 為漢麻與擬南芥 Alfin-like 轉錄因子共線性關系，由此可以看出只有 CsAL4 與 AtAL6 具有相關性，CsAL4 與AtAL6 均為 E 亞族，其中說明兩個基因高度同源。

  

圖2 CsALs 保守基序及基因結構

Figure2 CsALs conserved motifs and gene structure

 

  

紅色線框為 DYF3594 domain，黃色線框為PHD domain。

圖3 CsALs 基因多序列比對

Figure3 Multiple sequence alignment of the CsALs genes

  

A：參與茉莉酸甲酯反應的順式調節(jié)元件；B：參與光反應的順式調節(jié)元件；C：與干旱誘導有關的順式調節(jié)元件；D：厭氧誘導所必需的順式調節(jié)元件；E：參與玉米醇溶蛋白代謝調節(jié)的順式調節(jié)元件；F：參與脫落酸反應的順式作用元件；G：與水楊酸反應有關的順式作用元件；H：參與生長素反應的順式作用元件；I：參與低溫反應的順式作用元件；J：參與防御和壓力反應的順式作用元件；K：參與胚乳表達的順式調節(jié)元件；L：與分生組織表達相關的順式調節(jié)元件。

圖4 CsALs 順式作用元件

Figure4 The CsALs cis-acting element

  

圖5 工業(yè)大麻與擬南芥 AL 基因共線性關系

Figure5 Collinearity between Cannabis sativa L. and Arabidopsis thaliana AL genes

  

圖6 CsALs 基因不同品種表達模式分析

Figure6 Analysis of the expression patterns of different vari- eties of CsALs genes

2.5漢麻 AL 轉錄因子不同品種表達模式分析

根據(jù)已報道的 9 個大麻栽培品種（Black Berry Kush，Black Lime， Canna Tsu， Cherry Chem， Valley Fire ， Mama Thai， Sour Diesel， Terple 和 White Cookies）腺毛轉錄組數(shù)據(jù)，繪制 CsALs 在不同品種的表達熱圖（圖 6）。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，在 Sour Diesel 中5 個AL 基因的表達量顯著高于其他品種中的表達量；CsAL2 在 Terple 和 White Cookies 中表達量極低，在 Terple 中 CsALs 基因相較于其他品種表達量最低；CsAL3 在 9 個品種中的調表達量顯著高于其他 CsALs；CsAL4 在 Canna Tsu 中表達量顯著高于其他品種。相同基因在同種植物的不同品種中表達量不同，表明品種間的表型差異與基因表達量有關。

3 討論與結論

Alfin-like 轉錄因子是一類含有雙結構域的蛋白，N 端的 DUF3594 domain 又稱為 PAL 結構域是 “心形”同源二聚體，代表一種新形式的蛋白質折疊形式，C 端的PHD domain 與染色質緊密結合[6，19]。 Alfin-like 轉錄因子在植物生長發(fā)育及脅迫響應方面具有重要作用[20]。本研究根據(jù)漢麻全基因組注釋文件及蛋白質序列文件獲得 5 個 CsALs 基因。根據(jù)理化性質分析，CsALs 蛋白是酸性親水蛋白，其亞細胞定位顯示均定位于細胞核，有研究表明植物 ALs基因定位于細胞核，這與葡萄[21]、核桃[11]亞細胞定位結果一致，葡萄 VvALs 等電點為 5.11～5.62、親水性為–0.803～–0.569，核桃 JrALs 等電點為 5.04～5.71、親水性為–0.751～–0.618。CsALs 基因結構中均含有 5 個內含子，含有 6 個相同的保守基序，僅有 CsAL3 含有 3 個外顯子，具有相似保守基序的 CsALs 蛋白質序列聚類到相同亞族，而 CsAL1 單獨聚類到 B 亞族且僅含有 motif10，motif7僅存在于 CsAL4、CsAL5 并聚類到 E 亞族，CsAL2含有兩個 motif8、CsAL3 包含 CsALs 基因 6 個共同 motif 并聚類到 F 亞族。CsAL2 定位于 X 染色體，可以猜測，關于非生物因素脅迫的抗性或許是可以遺傳的。CsALs 基因 CDS 編碼長度差異不大，表明 CsALs 基因在進化過程中的高度保守性。根據(jù)其啟動子元件分析表明，5 個漢麻 Alfin-like 轉錄因子含有大量光響應元件，且均與激素響應和脅迫響應有關，且 ALs 基因是參與調控大麻非生物脅迫的重要參與者，而植物通常遭遇的非生物脅迫主要是鹽脅迫、低溫脅迫和干旱脅迫。推測可以通過編輯 CsALs基因參與調控漢麻的生長發(fā)育與非生物脅迫。進化樹分析漢麻Alfin-like 轉錄因子與雙子葉植物同源性較高，與水稻、玉米等單子葉植物存在明顯差異，其系統(tǒng)發(fā)育樹分析中單雙子葉植物的差異可能是由于植物進化造成的，推測該基因在物種間具有較高保守性。漢麻與擬南芥 Alfin-like 轉錄因子共線性關系中只有 CsAL4 與 AtAL6 具有相關性，AtAL6 可以通過調節(jié) ETC1 轉錄本的穩(wěn)定性來控制 Pi 缺陷條件下的根毛伸長，AtAL6 還需要克服在低 Pi 條件下光誘導的根毛伸長抑制，而 CsAL4 與 AtAL6 具有高度同源性[22]，推測 CsAL4 在漢麻生長發(fā)育中發(fā)揮與 AtAL6 相同功能。漢麻 CsALs 基因在不同品種表達模式分析該轉錄因子在較多品種中有高度表達，但不同品種中存在表達差異，推測漢麻 CsALs 基因在表達調控上存在一定的功能分化，在不同品種中 CsAL3 表達量顯著高于其他基因，推測該基因可能對生長發(fā)育和脅迫響應起到重要的調控作用。

本研究首次鑒定了漢麻 Alfin-like 轉錄因子家族，并對其進行了初步的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該基因與植物脅迫響應、激素響應關系密切。本研究為進一步鑒定漢麻Alfin-like 轉錄因子的生物學功能奠定基礎。

 

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文章摘自：陳晗,徐洪國,王志剛等.漢麻Alfin-like轉錄因子家族鑒定及表達分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報,2023,50(03):410-415.DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.001.