摘  要：本發(fā)明公開了亞麻基因LuWRI1a及在提高植物耐鹽和耐旱性能中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，亞麻基因LuWRI1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本發(fā)明通過基因工程手段，將該基因轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，侵染亞麻的下胚軸，再對(duì)亞麻進(jìn)行培養(yǎng)，獲得的轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫和干旱脅迫狀態(tài)下長(zhǎng)勢(shì)良好，發(fā)現(xiàn)了該基因具備提高亞麻耐鹽脅迫和干旱脅迫的功能，為耐逆性亞麻株系的構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)。

 

技術(shù)要點(diǎn)

1.亞麻基因LuWRI1a，其特征在于，所述亞麻油基因LuWRI1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.由權(quán)利要求1所述的亞麻基因LuWRI1a編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.權(quán)利要求1所述的亞麻基因LuWRI1a在構(gòu)建生物材料中的應(yīng)用，其特征在于，所述生物材料包括重組載體、重組菌株。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組載體為pE101?LuWRI1a。

5.權(quán)利要求1所述的亞麻基因LuWRI1a在提高亞麻耐鹽和耐旱性能中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，亞麻基因LuWRI1a上調(diào)LuAREB2、LuDREB2、LuLEA和LuNCED基因的表達(dá)，調(diào)控亞麻轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性。

7.根據(jù)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，亞麻基因LuWRI1a增強(qiáng)亞麻在鹽脅迫和干旱脅迫下抗氧化酶的活性并且減輕對(duì)亞麻細(xì)胞膜造成的氧化損傷。

8.權(quán)利要求1所述的亞麻基因LuWRI1a在構(gòu)建耐鹽脅迫和耐干旱脅迫的亞麻株系和分子育種中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，亞麻株系的構(gòu)建過程包括：以亞麻基因LuWRI1a構(gòu)建重組載體pE101?LuWRI1a，將重組載體pE101?LuWRI1a轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，得到重組菌株，最后以重組菌株侵染亞麻，獲得耐鹽脅迫和耐干旱脅迫的亞麻株系。

10.一種耐鹽和耐干旱脅迫的亞麻株系，其特征在于，由權(quán)利要求9所述的方法構(gòu)建得到。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及亞麻基因LuWRI1a及在提高植物耐鹽和耐旱性能中的應(yīng)用。

 

背景技術(shù)

亞麻(Linum usitatissimum L.)是一年生的二倍體自花授粉植物，屬于亞麻科亞麻屬。亞麻是全球非常重要的油料作物，主要種植于印度，加拿大和中國(guó)。亞麻籽一般含有40％～50％的油脂，73％的多不飽和脂肪酸，其中α?亞麻酸(C18：3，ALA)含量高達(dá)50％，被用來作為食品原料有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。WRINKLED1最初是在擬南芥的wri1?1突變體中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，由于該突變體的表皮有皺紋，它被命名為WRINKLED1。

研究發(fā)現(xiàn)，在大豆、玉米和油菜等植物中過表達(dá)WRI的同源基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的種子含油量。我們?cè)谇捌诘难芯恐袕膩喡橹锌寺×藘蓚€(gè)WRINKLED1基因，LuWRI1a和 LuWRI1b。我們發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)LuWRI1a可以增加轉(zhuǎn)基因亞麻種子的含油量，而不影響亞麻籽油的質(zhì)量或種子產(chǎn)量。盡管WRI1基因在不同植物中的多種作用已經(jīng)被證實(shí)，但WRI1基因是否可以提高植物耐逆性方面的功能卻鮮有報(bào)道。

因此，如果開發(fā)WRI1基因的新功能，并將其應(yīng)用于植物耐鹽和耐干旱脅迫中是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的技術(shù)問題。

 

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種亞麻基因LuWRI1a提高植物耐鹽和耐旱性能中的應(yīng)用。采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將亞麻的LuWRI1a基因過表達(dá)導(dǎo)入亞麻的外植體，獲得3個(gè)LuWRI1a表達(dá)量較高的T3代純合株系。利用NaCl和PEG?6000模擬鹽處理和干旱處理分析轉(zhuǎn)基因亞麻的耐鹽耐旱能力，通過觀察轉(zhuǎn)基因亞麻的植株表型、測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)以及分析逆境脅迫響應(yīng)基因在轉(zhuǎn)基因亞麻中的表達(dá)等研究，研究LuWRI1a基因在亞麻耐逆中的功能，為培育耐旱耐鹽堿亞麻新品種提供理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

亞麻基因LuWRI1a，其特征在于，所述亞麻基因LuWRI1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

ATGAAATCGCCGCCGTCAAACGACAAGTCGACGACGAAGAACAACAAGAGGCAAAGGAAGATAATATCTCCTTCTTCATCTTCCTCATCCCTTTCTTCCCTCACTTCTAATTCCTCCTGCTCTTCCAATTCTTCCAACAATTCCTCTCCCCCATCTCCTTCTTGCTCCTGCTCTTCCTCCCCTTGCTCTTCCTGCGATCCCTCCGCTGTAATTGTTCACCCTCCTCCTCCTCCGCCGAATCATGAGGAGAAACCAGCTGCTCCACCCAAAGCCGCCAAACGACGGAGAAGAACCCAATCATCCAAGAAATTGACCAGCAACAACAATGGCGGCGATCACCCCCCTAAATCAAACGATGAAGACAAGATTGATGATCCCCTGCCTCCCCCCTCTGCACAAGGAAAACGAAGCTCTGCTTTCAGGGGTGTCACCAGGCATAGATGGACTGGAAGATTTGAAGCTCATCTGTGGGATAAAAGCTCCTGGAACAACATGCACAACAAGAAGGGTAGACAAGTGTATTTGGGGGCGTATGACGAAGAGGAAGCCGCTGCTCGGACTTACGACCTTGCTGCGTTGAAGTACTGGGGATCCGCCACCACCTTGAATTTCCCTGTAGAAGGGTACGAGAAGGAGATGGAGGAGATGAGTAAAGTGAGCAGAGAAGAGTACTTGGCTTCTCTCCGGCGCCGGAGCTCCGGCTTCTCCAGAGGCGTCTCTAAGTACCGCGGCGTCGCCAGGCATCACCATAATGGACGGTGGGAAGCAAGGATTGGAAGAGTGCTGGGGAACAAGTACCTCTACCTCGGCACTTTCAACACGCAGGAGGAGGCTGCAGAGGCGTATGACATGGCGGCACTAGAATACAGAGGAGCCAACGCTGTCACCAACTTCGACGTGGCCAATTACGTGGACCGCCTCAAGTCGAAAGGCGACCAATTCCTCCAGCCAATTTCTGACGTGGCAGCGGCTGAGGTGGCACCGGAAGATGATCAAGAAGCAGCTGAACTATACATCAACGACAATGCTGCCAAGTTAGAACCACTTCCCCTGCCCTCATCATCATCGTCGATCGAACAAGAGGCCGCTGAGGTGGCAATGATGATGGATATGCCTCTGCCACCGGAGATGCCTCCCACCACGACGACAACGACAAACAACGGTGGCAGCATGATGGAGCTTCTGGAGTTGGAGAATGATGGGAATTGGAGCTTCTGTTTCGAGTACCCGGAGGAGAACAACGCGGCCTCCTCGCAGCTGGCGTCGGAGGAGGGGTGCTGTATATTGCCGGAGTTGTTCGACGTGGATGGGGGAGGGTTCCAGCTGGAGGACATTGACTATTTGGTGTTTGACTCGTACCCGCCGCCGGTGGCGGTGGATGATGATGACGTGGGGAAGAGCGTGAAGGAGAAGTTGTTGTCCGAGGAGGATCTGTCAAGGTCTCCTTCTTGTTCAACAACAACATCGGTTTCTTGTAACTAA，如SEQ ID NO.1所示。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)由所述的亞麻基因LuWRI1a編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

MKSPPSNDKSTTKNNKRQRKIISPSSSSSSLSSLTSNSSCSSNSSNNSSPPSPSCSCSSSPCSSCDPSAVIVHPPPPPPNHEEKPAAPPKAAKRRRRTQSSKKLTSNNNGGDHPPKSNDEDKIDDPLPPPSAQGKRSSAFRGVTRHRWTGRFEAHLWDKSSWNNMHNKKGRQVYLGAYDEEEAAARTYDLAALKYWGSATTLNFPVEGYEKEMEEMSKVSREEYLASLRRRSSGFSRGVSKYRGVARHHHNGRWEARIGRVLGNKYLYLGTFNTQEEAAEAYDMAALEYRGANAVTNFDVANYVDRLKSKGDQFLQPISDVAAAEVAPEDDQEAAELYINDNAAKLEPLPLPSSSSSIEQEAAEVAMMMDMPLPPEMPPTTTTTTNNGGSMMELLELENDGNWSFCFEYPEENNAASSQLASEEGCCILPELFDVDGGGFQLEDIDYLVFDSYPPPVAVDDDDVGKSVKEKLLSEEDLSRSPSCSTTTSVSCN，如SEQ ID NO.2所示。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)所述的亞麻基因LuWRI1a在構(gòu)建生物材料中的應(yīng)用，所述生物材料包括重組載體、重組菌株。

優(yōu)選地，所述重組載體為pE101?LuWRI1a。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)所述的亞麻基因 LuWRI1a在提高亞麻耐鹽和耐旱性能中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，亞麻基因LuWRI1a上調(diào)LuAREB2、LuDREB2、LuLEA和LuNCED基因的表達(dá)，調(diào)控亞麻轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性。

優(yōu)選地，亞麻基因LuWRI1a增強(qiáng)亞麻在鹽脅迫和干旱脅迫下抗氧化酶的活性并且減輕對(duì)亞麻細(xì)胞膜造成的氧化損傷。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)所述的亞麻基因 LuWRI1a在構(gòu)建耐鹽和耐干旱脅迫的亞麻株系和分子育種中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，亞麻株系的構(gòu)建過程包括：以亞麻基因LuWRI1a構(gòu)建重組載體pE101? LuWRI1a，將重組載體pE101?LuWRI1a轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，得到重組菌株，最后以重組菌株侵染亞麻，獲得耐鹽脅迫和耐干旱脅迫的亞麻株系。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種耐鹽和耐干旱脅迫的亞麻株系，由所述的方法構(gòu)建得到。

經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開發(fā)現(xiàn)了亞麻基因LuWRI1a，并鑒定了該基因的功能，為亞麻抗逆植株的構(gòu)建和分子育種提供了理論基礎(chǔ)。

 

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1附圖為轉(zhuǎn)基因胡麻的獲得的過程；A：農(nóng)桿菌侵染亞麻下胚軸；B：下胚軸誘導(dǎo)形成不定芽；C：生根；D：轉(zhuǎn)化苗移栽；

  

圖2附圖為轉(zhuǎn)基因亞麻的分子鑒定結(jié)果圖；A：LuWRI1a轉(zhuǎn)基因亞麻的PCR檢測(cè)，M： Marker DL2000；W：空白對(duì)照；1?24：轉(zhuǎn)基因亞麻；B：轉(zhuǎn)基因亞麻L(zhǎng)uWRI1a的表達(dá)分析；WT：野生型對(duì)照(亞麻栽培品種隴亞10號(hào)) ；OE?2，OE?20，OE?22：過表達(dá)亞麻株系；

  

圖3附圖為脅迫處理后野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的表型；

  

圖4附圖為鹽脅迫和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株性狀分析；A：株高；B：主根長(zhǎng)；C：側(cè)根數(shù)；D：葉片數(shù)；

  

圖5附圖為過表達(dá)LuWRI1a亞麻的酶活性測(cè)定圖；

  

圖6附圖為脅迫處理下轉(zhuǎn)基因亞麻逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)分析圖。

  

 

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例中用到的試驗(yàn)材料

供試材料為亞麻品種(Linum usitatissimum)隴亞10號(hào)和LuWRI1a過表達(dá)T3代純合轉(zhuǎn)基因株系LuWRI1a?OX?X，種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所亞麻研究室提供。挑選生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR鑒定陽(yáng)性株系。

實(shí)施例1

構(gòu)建LuWRI1a過表達(dá)亞麻株系

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化亞麻品種隴亞10號(hào)，將包含重組質(zhì)粒pE101?LuW RI1a的農(nóng)桿菌GV3101侵染亞麻的下胚軸，見圖1；在培養(yǎng)基中中進(jìn)行培養(yǎng)，每2周更換一次培養(yǎng)基，直至獲得完整植株。同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因“隴亞10號(hào)”(野生型)為陰性對(duì)照。挑選生長(zhǎng)良好的再生植株進(jìn)行PCR鑒定陽(yáng)性株系。通過PCR鑒定篩選陽(yáng)性植株，獲得純合轉(zhuǎn)基因亞麻株系5個(gè)(圖 2A)。根據(jù)qRT?PCR的檢測(cè)結(jié)果，選擇表達(dá)量較高的3個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系OE?1、OE?2和OE?5進(jìn)行下一步試驗(yàn)(圖2B) ，溫室培養(yǎng)收獲T1代種子，將T1代植株在花盆中于溫室培養(yǎng)，通過篩選鑒定陽(yáng)性植株，獲得T2代種子。

上述引物序列如SEQ ID NO .19～SEQ ID NO.20所示。

F：5′?CCACATGAAATCGCCGCCGTCAAACGAC?3′，如SEQ ID NO.19所示；

R：5′?CAAGAAACCGATGTTGTTGTTGA?3′，如SEQ ID NO.20所示。

實(shí)施例2

轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系在逆境脅迫下生長(zhǎng)狀態(tài)的對(duì)比

采用盆栽法，盆高18cm，直徑15cm，將進(jìn)口的丹麥品質(zhì)草炭土和蛭石按3：1的體積混合均勻，取適量混合營(yíng)養(yǎng)土裝入小花盆中。選取籽粒飽滿、大小均勻的亞麻種子約15粒(T3代純合系種子，對(duì)照組是野生型)，播種到花盆內(nèi)，室溫放置。用1/2Hogland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)1個(gè)月，每隔3d澆灌100mL/次。光照強(qiáng)度為130μmol·m^?2·s^?1，光周期為16h/8h(光照/黑暗)，置于室溫條件下培養(yǎng)4周，進(jìn)行脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，3次重復(fù)。挑選長(zhǎng)勢(shì)相同的幼苗進(jìn)行如下處理：

(1)鹽脅迫處理：用1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制200mmol·L^?1NaCl營(yíng)養(yǎng)液，每隔3d澆灌100mL；

(2)PEG?6000模擬干旱處理：用1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制25％PEG營(yíng)養(yǎng)液，每隔3d澆灌100mL；

脅迫處理2周后，觀察表型并測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。每個(gè)株系選取5株進(jìn)行株高、根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)和葉片數(shù)的測(cè)定。結(jié)果見圖3和圖4，正常培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因株系的株高、主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)和葉片數(shù)與野生型相比均無(wú)明顯差異。在200mmol L^?1NaCl脅迫下，野生型亞麻株高較低，葉片發(fā)黃，嚴(yán)重干枯，萎蔫程度較轉(zhuǎn)基因株系嚴(yán)重，這表明過表達(dá)LuWRI1a基因亞麻的耐鹽能力比野生型亞麻更強(qiáng)。PEG?6000脅迫處理后，野生型植株和轉(zhuǎn)基因株系均未出現(xiàn)萎蔫，轉(zhuǎn)基因株系葉片部分失綠，表型無(wú)明顯差異(圖3)。野生型植株的根系生長(zhǎng)受到了抑制，側(cè)根數(shù)目明顯減少，轉(zhuǎn)基因植株的平均側(cè)根數(shù)與野生型植株相比差異顯著(圖4)，分別提高了36.36％、30.91％和23.63％。平均根長(zhǎng)分別提高了9.46％，15.44％和8.63％，平均葉片數(shù)分別提高了18.07％、31.73％和9.64％；干旱脅迫處理兩周后，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，平均主根長(zhǎng)分別提高了3.08倍、5.17倍和負(fù)0.23倍，平均側(cè)根數(shù)分別提高了25.9％，22.29％和22.89％，平均葉片數(shù)分別提高了5.5倍，6.88倍和4.59倍。轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫和干旱脅迫處理后，相對(duì)株高、主根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)目及葉片數(shù)均升高，且在鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株各指標(biāo)均明顯高于對(duì)照，表明過表達(dá)LuWRI1a的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫的耐受性更高。

此外，每組不同處理的材料隨機(jī)挑選5株亞麻，剪取根部組織和地上組織，每個(gè)株系取3個(gè)重復(fù)。液氮速凍后于?80℃冰箱儲(chǔ)存。

實(shí)施例3

轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系在氧化歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及丙二醛(MDA)的含量中的對(duì)比

氧化歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及丙二醛(MDA)的含量是植物在抗逆性方面的重要生理指標(biāo)。正常條件下，轉(zhuǎn)基因植株的 APX活性比野生型植株的高，CAT活性、SOD活性和MDA含量并無(wú)明顯差異。鹽脅迫和干旱脅迫后，三種抗氧化酶的活性都顯著高于對(duì)照，而MDA含量都低于對(duì)照。

鹽脅迫處理后，野生型亞麻的SOD活性為109.73U·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的SOD酶活性分別為134.90、138.83和129.11U·g^?1，比野生型提高了0.23倍、0.27倍和0.18倍(圖5A)；野生型亞麻的CAT酶活性為36.80U·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的CAT酶活性分別為45.30、53.38和42.32U·g^?1，比野生型提高了0.23倍、0.45倍和0.15倍(圖5B)；野生型亞麻的APX酶活性為29.07U·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的APX酶活性分別為41.85、41.91和40.67U·g^?1，比野生型提高了0.44倍、0.44倍和0.40倍(圖5C)；野生型亞麻的MDA含量為75.50nmol·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的MDA含量分別為66.33、60.79和63.0nmol·g^?1，比野生型亞麻降低了0.12倍、0.19倍和0.17倍(圖5D)。

干旱脅迫處理后，野生型亞麻的SOD活性為109.71U·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的SOD酶活性分別為134.40、146.28和122.86U·g^?1，比野生型提高了0.22倍、0.33倍和0.12倍(圖5A)；野生型亞麻的CAT酶活性為36.22U·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的CAT酶活性分別為39.76、37.81和43.53U·g^?1，比野生型提高了0.10倍、0.04倍和0.20倍(圖5B)；野生型亞麻的APX酶活性為

32.24U·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的APX酶活性分別為41.96、42.59和38.59U·g^?1，比野生型提高了0.30倍、0.32倍和0.20倍(圖5C)；野生型亞麻的MDA含量為71.85nmol·g^?1，轉(zhuǎn)基因亞麻的MDA含量分別為39.15、40.18和40.38nmol·g^?1，比野生型亞麻降低0.46倍、0.44倍和0.44倍(圖5D)。結(jié)果表明，過表達(dá)LuWRI1a能夠增強(qiáng)在鹽脅迫和干旱脅迫下抗氧化酶的活性并且減輕對(duì)亞麻細(xì)胞膜造成的氧化損傷。

實(shí)施例4

逆境脅迫響應(yīng)基因在轉(zhuǎn)基因亞麻中的表達(dá)分析

為了研究LuWRI1a在逆境脅迫反應(yīng)中可能的分子機(jī)制，分析了4個(gè)非生物脅迫響應(yīng)基因LuAREB2(ABA?responsive element binding)、LuDREB2(dehydration?responsive element binding)、LuLEA(late embryogenesis?abundan t protein)和LuNCED(9?cis?epoxycarotenoid dioxygenase)在野生型亞麻和轉(zhuǎn)基因亞麻中的表達(dá)水平。

引物合成

根據(jù)NCBI上公布的亞麻隴亞10號(hào)基因組序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)熒光定量引物。以甘油醛?3?磷酸(GAPDH，Glyceraldehyde 3?phosphate dehydroge nase)為內(nèi)參基因。所有引物由上海生物化工公司合成(表1)。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

  

通過實(shí)時(shí)熒光定量(qRT?PCR)分析表明，在鹽脅迫和干旱脅迫的處理下，逆境脅迫相關(guān)基因均上調(diào)表達(dá)(圖6)。LuAREB2在正常和逆境脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均顯著高于野生型(圖6A)。正常條件下，LuDREB2在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量沒有明顯差異，在鹽脅迫和干旱脅迫處理后，基因表達(dá)量較對(duì)照顯著上調(diào)(圖6B)。LuLEA5在正常條件和鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均顯著高于野生型，但在干旱脅迫處理后，株系間差異不顯著(圖6C)。正常條件下，LuNCED較對(duì)照無(wú)明顯差異，在鹽脅迫和干旱脅迫處理后，基因的表達(dá)量較對(duì)照略上調(diào)，但株系間差異不顯著(圖6D)。結(jié)果表明，在逆境脅迫下，尤其是在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株中LuWRI1a通過上調(diào)LuAREB2、LuDREB2、LuLEA和LuNCED等逆境脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，來參與調(diào)控亞麻轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性。

本說明書中各個(gè)實(shí)施例采用遞進(jìn)的方式描述，每個(gè)實(shí)施例重點(diǎn)說明的都是與其他實(shí)施例的不同之處，各個(gè)實(shí)施例之間相同相似部分互相參見即可。

對(duì)所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。

 

摘自國(guó)家發(fā)明專利，發(fā)明人：李聞娟，張建平，齊燕妮，王利民，趙瑋，黨照，謝亞萍，申請(qǐng)?zhí)枺?/font>202310681317.5，申請(qǐng)日：2023.06.09