摘 要：苧麻是一種重要的纖維作物，纖維被用作紡織工業(yè)的原料。擴展蛋白具有誘導依賴pH的細胞壁伸長和壓力松弛的特性。為了對苧麻基因組中expansin家族成員數(shù)量和類型進行鑒定，并研究在纖維細度不同的苧麻莖皮中擴展蛋白基因的表達情況，研究首先在芒麻中藝1號基因組數(shù)據(jù)庫挖掘到24個擴展蛋白基因家族成員。通過生物信息學方法對其分子量、等電點、信號肽、亞細胞定位、motif及基因結(jié)構(gòu)進行分析和預(yù)測。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示：擴展蛋白包括α亞族成員17個、β亞族4個、α類亞族1個和β類亞族2個，共分為3類；expansin家族同一進化支蛋白結(jié)構(gòu)域比較保守且有一個特有的motif。然后，利用苧麻莖皮擴展蛋白基因家族成員轉(zhuǎn)錄組表達分析和GRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)兩個基因在兩個纖維細度差異顯著的品種及其5個不同生長期表達量差異顯著。該結(jié)果有助于了解苧麻expansin家族的進化，為影響苧麻纖維發(fā)育和纖維細度相關(guān)基因及其功能的研究奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：苧麻；expansin家族；生物信息學分析；表達分析
擴展蛋白最早被鑒定為一種具有細胞壁松弛作用的蛋白，部分介導了植物細胞壁延伸和細胞生長。擴展蛋白主要分為兩個蛋白家族，即α和β擴展蛋白亞族，他們不僅作用于細胞膨脹，還參與調(diào)節(jié)包括形態(tài)發(fā)生、果實軟化、花粉管生長等多種植物生長過程[1]。蛋白功能被細胞壁酸性條件激活，在植物中存在一些反應(yīng)機制會誘導細胞壁pH值發(fā)生變化而影響細胞的生長[2]。由于擴展蛋白對細胞壁具有獨特的修飾作用，先后在棉花和苧麻關(guān)于纖維發(fā)育的研究中得到關(guān)注，已有研究發(fā)現(xiàn)3種編碼擴展蛋白的基因在苧麻的上部莖皮上調(diào)表達[3-4]。一些家族成員基因在其他植物中的功能相繼被證實，涉及促進生長、改善纖維品質(zhì)和鹽脅迫響應(yīng)，例如水稻OsEXP4[5]、棉花GhEXPA8[6]和GbEXPATR[7]、小麥0sEXPB23[8]等。擴展蛋白在苧麻中的研究才剛剛起步，該家族基因具體的分子功能及其對纖維細胞的發(fā)育和纖維品質(zhì)的影響尚不清楚。
在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中：水稻的56個編碼擴展蛋白的基因，包括α亞族34個，β亞族19個；擬南芥36個編碼擴展蛋白的基因包括α亞族25個和β亞族7個；玉米4個基因都于β亞族。苧麻中通過轉(zhuǎn)錄組序列拼接和同源基因克隆的方法發(fā)現(xiàn)了12個α亞族和4個β亞族，共16個編碼擴展蛋白的基因[9]。然而，目前還未對節(jié)麻expansin家族成員的具體數(shù)目和類型進行全面鑒定。節(jié)麻基因組測序草圖的順利完成[10]，使利用生物信息學在全基因組水平上分離和鑒定expansin家族成為可能。因此，本研究利用藝麻基因組數(shù)據(jù)庫對蘆麻expansin家族成員及其類型進一步鑒定與分析，旨在為芒麻纖維發(fā)育候選基因挖掘奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1苧麻expansin家族成員鑒定
在Pfam數(shù)據(jù)庫下載擴展基因家族保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)文件（登錄號分別為PF03330和PF01357)，利用hmmer v3.0軟件構(gòu)建苧麻expansin家族專有的保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型文件，然后在苧麻基因組蛋白數(shù)據(jù)中搜索家族成員[11]。將家族蛋白氨基酸序列在HMMER網(wǎng)站（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer）進行序列分析。
1.2理化性質(zhì)分析和亞細胞定位
通過ExPASy網(wǎng)站（https：//www.expasy.org/)中的Protparam程序分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點，利用Signal P-5.0預(yù)測蛋白的信號肽，采用pLoc-mPlant進行蛋白的亞細胞定位預(yù)測。
1.3擴展基因結(jié)構(gòu)及蛋白序列分析
利用在線軟件MEME(http：//meme-suite.org/)對擴展蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析。最大motif數(shù)量設(shè)為20，其他參數(shù)為默認值。根據(jù)苧麻基因組的DNA序列和編碼區(qū)序列，使用TBtools軟件[12]分析和繪制基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)圖。
1.4基因家族系統(tǒng)進化分析
利用分子進化分析軟件MEGA7的Clustalw程序?qū)﹁b定的苧麻擴展蛋白氨基酸序列進行多重序列比對，采用鄰接法(NJ，neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫下載水稻和擬南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，與苧麻的蛋白氨基酸序列進行比對，默認參數(shù)，bootstrap值設(shè)為500，構(gòu)建NJ進化樹。
1.5表達分析
依據(jù)本課題組已經(jīng)完成的苧麻轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，即2個纖維細度差異大的品種，編號為2-25(纖維細度1312m/g)和3-4(2788m/g)，發(fā)芽2周(T1)，4周(T2)，6周(T3)，8周(T4)、10周(T5)5個不同纖維發(fā)育時期莖皮中各基因的FPKM值[13-14]，分析其5個發(fā)育時期的expansin家族基因表達模式。利用與轉(zhuǎn)錄組相同的樣品材料(液氮冷凍，-80℃保存)，提取苧麻莖皮總RNA，RNA提取方法和模板cDNA的合成均按照試劑盒操作手冊。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 用于莖皮總RNA提取，Thermo Scientific RevertAid first-strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientiic，Vilnius，Lithuania) 用于cDNA合成，合成20μL體系cDNA，用ddH2O稀釋一倍后備用。根據(jù)擴展蛋白基因家族表達差異的結(jié)果在Primer 5 設(shè)計相關(guān)基因的特異性引物，以苧麻18S rRNA為內(nèi)參基因，于Bio-Rad iQ5 Real-Time PCR System(Bio-Rad，CA，USA)分析儀上進行qRT-PCR分析，25μL qPCR體系，即1μL cDNA，12.5μL 2xSYBR qPCR Mix (北京艾德萊生物公司)，各1μL上下游引物(10μmol/L)和10.5μL ddH2O，程序為95℃2min、95℃15s和55℃30s，40個循環(huán)，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，并按照2-△△CT的方法計算基因的相對表達量[15]。利用GraphPad Prism8軟件的Holm-Sidak方法對表達量進行t測驗，以比較基因在品種間和時期間的差異顯著性。
2結(jié)果與分析
2.1基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析
通過全基因組基因家族成員挖掘，去掉結(jié)構(gòu)和功能冗余的2個候選序列，共獲得了27個expansin基因候選序列。在Pfam數(shù)據(jù)庫對這些序列進行結(jié)構(gòu)域注釋，發(fā)現(xiàn)24個具有家族保守結(jié)構(gòu)域的DPBB_1和Pollen_allerg_1，3個缺失第二個結(jié)構(gòu)域的候選序列。對此24個具有完整結(jié)構(gòu)域基因的命名沿用苧麻基因組蛋白數(shù)據(jù)庫注釋。
比較和分析24個共麻擴展蛋白序列的理化性質(zhì)(表1)，基酸數(shù)目213aa(Expansin-A23)~589aa(Expansin-B15_3)，分子量23253.44Da(Expansin-A23)~62 928.18Da(Expansin-B15_3)，等電點4.78(Expansin-like_2)~9.96(Expansin-A12_1)。預(yù)測發(fā)現(xiàn)5個蛋白序列沒有信號膚，分別為Expansin-A23、Expansin-A12_2、Expansin-A4_1、Expansin-B15_3、Expansin-A12_1。亞細胞定位結(jié)果顯示24個苧麻擴展蛋白均位于細胞壁。
表１苧麻擴展蛋白基本理化性質(zhì)
2.2基因家族的基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)基序預(yù)測
苧麻expansin家族成員外顯子數(shù)目為2~9個，內(nèi)含子數(shù)目為1~8個。根據(jù)MEME分析結(jié)果，選擇其中E-value最低為8.4e-003的17個保守基序作圖(圖1)。同一進化支蛋白的結(jié)構(gòu)域均保守且每個基因亞族蛋白含特有的保守基序(motif)，α亞族蛋白特有motif3，β亞族特有motif8，EXPL支(EXPLA亞族和EXPLB亞族)特有motif15。
圖1擴展家族蛋白序列保守基序和基因結(jié)構(gòu)與3個特有保守基序
2.3苧麻expansin家族的系統(tǒng)進化分析
在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫下載水稻和擬南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，分別為36和56條，與24條苧麻蛋白氨基酸序列一起構(gòu)建進化樹（圖2)。expansin家族包括EXPA、EXPB、EXPLA、EXPLB等4個亞族，在進化樹中可分為EXPA、EXPB、EXPL3大類。EXPA類包含苧麻expansin家族的17個基因(α亞族），EXPB類包含4個基因(β亞族），EXPL類有3個基因(1個α類亞族和2個β類亞族）。
圖2苧麻expansin家族進化樹
2.4基因家族成員的表達分析
5個發(fā)育時期的expansin家族基因表達模式如圖3所示9個基因在兩個品種間存在明顯的差異表達情況，其中BnEXPA16、BnEXP-like-3和BnEXPA20僅在品種3-4的T3、T4及T5期上調(diào)表達，BnEXP-like-1和BnEXPA7僅在品種2-25的T4期上調(diào)表達，BnEXPA8-2、BnEXPB3、BnEXPA23和BnEXPA11僅在品種2-25的T2期上調(diào)表達。兩個苧麻品種5個生長期內(nèi)，在T1和T2期都上調(diào)表達的有BnEXPA2-1、BnEXPA2-2、BnEXP-like-2、BnEXPA8-1、BnEXPA12-1、BnEXPA8-2、BnEXPA1、BnEXPA15、BnEXPA4-1、BnEXPA13。在T3、T4和T5期都上調(diào)表達的有BnEXPB15-1、BnEXPB15-2和BnEXPB15-3。
根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果和相關(guān)差異表達基因的功能分析，選擇BnEXP-like-3和BnEXPB15-2這兩個基因做進一步分析(特異性引物序列見表2)，熒光定量PCR結(jié)果(圖4)顯示，5個時期苧麻莖皮中兩個基因的表達量呈現(xiàn)顯著差異(p<0.01)，兩個基因在品種3-4表達量明顯高于2-25的表達量。
圖３苧麻expansin家族基因表達量熱圖
表２expansin家族基因特異qRT-PCR引物（５’→３’）
注：“∗”表示ｐ＜0.05的顯著差異性，“∗∗”表示ｐ＜0.01，“∗∗∗”表示ｐ＜0.001，……。
圖４BnEXP-like-3（左）和BnEXPB15-2（右）在兩個苧麻品種莖皮５個時期的相對表達量
3討論與結(jié)論
苧麻中鑒定出的4種擴展蛋白亞族的蛋白，包括α亞族17個、β亞族4個、α類亞族1個和β類亞族2個。蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析表明，可依據(jù)其特有的保守基序區(qū)分不同亞族的擴展蛋白，苧麻expansin家族α亞族蛋白特有motif3，β亞族特有motif8，α類亞族和β類亞族共特有motif15。表達分析結(jié)果顯示，expansin家族成員在不同品種和時期存在表達差異，且BnEXP-like-3與BnEXPB15-2兩個基因在品種3-4中冬人時期的相對表達量均高于2-25。目前被報道與纖維發(fā)育相關(guān)的擴展蛋白基本屬于如EXP1、EXPA2、EXPA8等所在的成員數(shù)量占有優(yōu)勢的a亞族[3-4，6-7]，而鮮有α類亞族和β亞族的成員。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，苧麻纖維細度還受光照、濕度、溫度等生態(tài)環(huán)境因素的影響[16]。本研究首次發(fā)現(xiàn)在兩個在纖維細度不同的兩個品種間呈表達差異的BnEXP-like-3與BnEXPB15-2，其所在亞族的蛋白被報道與植物抗逆性相關(guān)，如啟動子序列存在脫落酸、生長素、水楊酸等激素誘導元件和對干旱、高溫等非生物脅迫的響應(yīng)元件的OfEXLA1[17]及被證實由磷酸鹽饑餓誘導且能夠提高大豆磷效率的GmEXPB2[18]。因此BnEXP-like-3和BnEXPB15-2是否具有通過對苧麻生長環(huán)境響應(yīng)而影響纖維細度的功能值得深入探討。
棉花中發(fā)現(xiàn)了兩個擴展蛋白基因，GbEXPA2通過增加結(jié)晶纖維素含量影響纖維細胞厚度，GbEXPATR是編碼一個缺失Pollen_allerg_1結(jié)構(gòu)域的蛋白基因，同屬于擴展蛋白α亞族，過表達GbEXPATR纖維會產(chǎn)生更長、更結(jié)實的薄壁纖維[7]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了3個缺失第二結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中兩個有信號肽，但與擴展蛋白家族各個亞族的蛋白相似性不高，其功能有待進一步研究。
參考文獻：
[1]LEE Y，CHOI D，KENDE H.Expansins:ever-expanding numbers and functions[J].Current Opinion in Plant Biology，2001，4(6)：527-532.
[2] COSCROVE D J.Growth of the plant cell wall[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2005，6(11)：850-861.
[3] RUAN Y L，ILEWELLYN D J，FURBANK R T.The control of single-celled cotton fiber elongation by developmentally reversible gating of plasmodesmata and coordinated expression of sucrose and K+ transporters and expansin[J].Plant Cell，2001，13(1)：47-60.
[4] CHEN J，PEL Z H，DALI L J，et al，Transcriptome profiling using pyrosequencing shows genes associated with bast fiber development in ramie(Boehmeria nwea L.)[J].BMC Genomics，2014，15：919.
[5] CHOI D S，LEE Y，CHO H T，et al.Regulation of expansin gene expression affects growth and development in transgenic rice plants[J].Plant Cell，2003，15(6)：1386-1398.
[6] BAJWA K S，SHAHID A A，RA0 A Q，et al.Stable transformation and expression of GhEXPA8 fiber expansin gene to improve fiber length and micronaire value in cotton[J].Frontiers in Plant Science，2015，6.838.
[7] LI Y，TU L L，PETTOLINO F A，et al.GbEXPATR，a species-specifc expansin，enhances coton fibere elongation through cell wall restructuring[J].Plant Biotechnology Journal，2016，14(3).951-963.
[8] HAN Y Y，LI A X，L1 F，et al.Characterization of a wheat(TrticumaestitumL.)expansin gene，TaEXPB23，involved in the abiotic stress response and phytohormone regulation[J].Plant Physiology and Biochemistry，2012，54.49-58
[9] 陳杰.麻纖維發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序及expansin家族功能分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2017.
[10]LUAN M B，JIAN J B，CHEN P，et al.Draft genome sequence of ramie，Boehmeria nitea(L.)Gaudich(J].Molecular Ecology Resources，2018，18(3)：639-645.
[11]LOZANO R，HAMBLIN M T，PROCHNIK S，et al.Identification and distribution of the NBS-LRR gene family in the Cassava genome[J].BMC Genomics，2015，16：360.
[12]CHENC J，CHEN H，ZHANC Y，et al.TBtools：an interative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J]Molecular Plant，2020，13(8)：1194-1202.
[13]CHEN K M，MING Y，LUAN M B，et al.The chromosome-level assembly of ramie(Boehmeria Nivea L.)genome provides insights into molecular regulation of fiber fineness[L].Journal of Natural Fibers，2023，20(1)：2168819.
[14]黃坤勇.苧麻纖維細度全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因篩選[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2020.
[15]譚龍濤.苧麻氮代謝高效基因型篩選及表達分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2015.
[16]湖南省苧麻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的氣象條件研究協(xié)作組，劉淑梅.苧麻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的氣象生態(tài)條件試驗研究[J].中國麻作，1991，2：13-20.
[17]高曉月，董彬，張超，等.桂花擴展蛋白基因OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXIA1啟動子克隆及活性分析[J].浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版)，2019、45(1)：23-29.
[18]ZHOU J，XIE J N，LIAO H，et al.Overexpression of beta-expansin gene GmEXPB2 improves phosphorus efficiency in soybean[J].Physiologia Plantarum，2014，150(2)：194-204.
文章摘自：石亞亮，鐘意成，黃坤勇等.苧麻expansin家族成員鑒定與表達分析[J].中國麻業(yè)科學，2023，45(04):145-151.
