摘 要：目的研究熱處理和不同離子強(qiáng)度條件下漢麻蛋白的熱聚集行為。方法以漢麻籽為原料，考察在80、90、100℃熱處理下，以及不同離子強(qiáng)度(0、0.2、0.4、0.6、0.8mol/LNaCl溶液)下漢麻蛋白的ζ-電位、粒徑、濁度、二級結(jié)構(gòu)、凝膠電泳、巰基及二硫鍵等指標(biāo)。結(jié)果漢麻蛋白隨著熱處理溫度的升高和離子強(qiáng)度的增大，ζ-電位絕對值降低、粒徑增大、濁度增加；電泳圖中在70kDa處有聚集條帶顯示；傅里葉變換紅外光譜顯示隨著熱處理溫度升高，α-螺旋結(jié)構(gòu)顯著降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)顯著增大；隨著離子強(qiáng)度增大，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)顯著降低，β-折疊結(jié)構(gòu)增加，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)先增大后減小；90℃熱處理時游離巰基含量低于80℃和100℃，二硫鍵含量在80℃處理下最少；離子強(qiáng)度對漢麻蛋白總巰基影響不顯著。結(jié)論熱處理溫度的升高及離子強(qiáng)度增大對漢麻蛋白聚集行為具有促進(jìn)作用，為漢麻蛋白熱加工工藝優(yōu)化和品質(zhì)調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：漢麻蛋白；聚集體；離子強(qiáng)度；熱處理
0引言
漢麻又稱大麻、火麻，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域，其籽仁可食用。漢麻籽含有豐富的營養(yǎng)組分，其中蛋白質(zhì)含量占20%~25%[1?2]。漢麻蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，富含多種必需氨基酸，具有極高的營養(yǎng)價值、低致敏性和易消化的特性，越來越多的應(yīng)用在食品領(lǐng)域[3?4]。在現(xiàn)代食品加工過程中，熱處理是食品加工的基本方法[5]。熱處理時食物中的蛋白質(zhì)在化學(xué)力的作用下形成聚集體[6]，這種聚集行為可引起蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能發(fā)生變化，如溶解性降低[7]、沉淀析出、功能性改變[8]等。蛋白聚集行為受到溶液的加熱溫度[9]、離子強(qiáng)度[10]、pH[11]等因素影響，加熱溫度具有影響蛋白分子去折疊狀態(tài)的效果[12]，離子強(qiáng)度可以發(fā)揮屏蔽靜電作用，影響蛋白分子與溶劑的水合反應(yīng)[13]。AMAGLIANI等[14]認(rèn)為蛋白濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度對蛋白質(zhì)無定形聚集體的影響較大。目前，對于漢麻蛋白的研究多圍繞提取方法及功能特性，對熱聚集行為機(jī)制及調(diào)控方式的研究較少。漢麻蛋白熱聚集行為的探究可以為調(diào)控產(chǎn)品加工工藝參數(shù)、提高產(chǎn)品品質(zhì)、促進(jìn)產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
本研究以漢麻籽為原料，探究漢麻蛋白熱聚集行為以及離子強(qiáng)度對漢麻蛋白熱聚集行為的影響，為漢麻蛋白食品熱加工工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制提供理論參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
漢麻籽(廣西巴馬縣)。
甘氨酸(glycine，Gly)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、Ellman試劑、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、β-巰基乙醇(分析純，美國Sigma公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA)、尿素、考馬斯亮藍(lán)R250(分析純，北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、正己烷、鹽酸(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。
1.2儀器與設(shè)備
PHS-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；HH-S4型恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；FA224電子天平(精度0.0001g，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；524G數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；GL-21M冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HAD-HZS-H恒溫振蕩器(北京恒奧德科技有限公司)；Zetasier Nano ZS納米粒度分布儀(英國Malvern儀器有限公司)；DYY-6D電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；L160000A FTIR傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer， FTIR)(珀金埃爾默儀器有限公司)；Alpha-1506紫外可見光分光光度儀(上海譜元儀器有限公司)。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1漢麻蛋白的提取
漢麻籽浸于正己烷中振蕩2h，抽濾，重復(fù)上述操作進(jìn)行脫脂3次，粉碎，過篩，得60目脫脂漢麻粉。將原料與蒸餾水按照料液比1：20(m：V)混合后，用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH到10.0，在室溫條件下磁力攪拌1h，再以5000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，取上清液。用1mol/LHCl將上清液的pH調(diào)到4.5，靜置30min，5000r/min離心30min，收集沉淀，并將沉淀用蒸餾水洗3次去除其中的鹽分，調(diào)pH至7.0，冷凍干燥，備用[15]。采用凱氏定氮法測定干粉樣品中蛋白質(zhì)的含量為93.46%。
1.3.2不同溫度漢麻蛋白熱聚集體的制備
將漢麻蛋白粉溶于pH為7.0、10mmol/L的磷酸緩沖液(標(biāo)準(zhǔn)緩沖液)中，配制為5%(m：V)的蛋白質(zhì)溶液，在25℃下磁力攪拌2h使其充分溶解。5000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，取上清液過0.45µm纖維素膜，濾液倒入帶塞三角瓶中。將樣品分別置于80、90、100℃水浴鍋中處理30min，迅速冷卻以終止聚集體的形成。樣品經(jīng)5000r/min離心30min，取上清液過0.45µm纖維素膜除去不溶性物質(zhì)，得到不同溫度漢麻蛋白熱聚集體[16]。
1.3.3不同離子強(qiáng)度漢麻蛋白熱聚集體的制備
將漢麻蛋白粉以1：15(m：V)溶于去離子水中，在25℃下磁力攪拌2h使其充分溶解。5000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，取上清液過0.45µm纖維素膜，濾液倒入帶塞三角瓶中，向樣品中分別加入NaCl溶液，制備成NaCl濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8mol/L的漢麻蛋白溶液，搖晃均勻，將樣品放入90℃水浴鍋中加熱30min，迅速冷卻以終止聚集體的形成。樣品經(jīng)5000r/min離心30min，取上清液過0.45µm纖維素膜除去不溶性物質(zhì)，得到不同離子強(qiáng)度處理的漢麻蛋白熱聚集體。
1.3.4粒徑分布
將經(jīng)過不同條件處理后的漢麻蛋白熱聚集體配制成10mg/mL溶液，稀釋后經(jīng)過0.45µm濾膜，進(jìn)行樣品測定。采用Malvern納米粒度分布儀測定其粒徑分布特征和多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)，平行3次，取其平均值作為測定值。
1.3.5ζ-電位
將經(jīng)過不同條件處理后的漢麻蛋白熱聚集體樣品用pH7.0、10mmol/L磷酸緩沖液配制成10mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，稀釋后緩慢加入馬爾文電位樣品池。采用Malvern納米粒度分布儀測定電位值，重復(fù)測量3次，取其平均值作為測定值。
1.3.6二級結(jié)構(gòu)
將經(jīng)過不同條件處理后的漢麻蛋白熱聚集樣品，凍干成粉末。利用FTIR測定，掃描范圍4000~400cm?1，分辨率4cm?1，利用PeakFitv4.12軟件對紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析。
1.3.7巰基和二硫鍵含量測定
蛋白質(zhì)樣品巰基(包括游離巰基和總巰基)含量的測定采用Ellman法[17]并稍做修改。
游離巰基：取0.0100g樣品加入10mLTris-Gly(pH8.0)緩沖液，4500r/min離心10min，取上清液加入100µLEllman試劑，20℃避光保溫1h，在412nm處測吸光度(以緩沖液代替樣品為空白)，通過公式(1)計(jì)算出游離巰基含量。
總巰基：取0.0050g樣品加入10mL0.2mol/L Tris-HCl(10 mmol/L EDTA、2%SDS、8mol/L尿素、pH6.8)緩沖液中，加入100 µL Ellman 試劑，20℃避光反應(yīng)1h，在412nm處測定吸光度值，通過公式(1)計(jì)算出總巰基含量。
式中，A412表示412nm波長處的吸光度；C表示漢麻蛋白溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；D表示稀釋因子。
二硫鍵：總巰基與游離巰基之差的1/2，通過公式(2)計(jì)算出二硫鍵含量：
1.3.8濁度
將不同條件下處理后的漢麻蛋白熱聚集樣品，用pH7.0、10mmol/L的磷酸緩沖液稀釋蛋白質(zhì)量濃度至8mg/mL，溶解2h，用分光光度計(jì)在600nm處測定吸光度計(jì)算濁度T[18]。每個樣品測定3次，最終結(jié)果取其平均值(以蒸餾水為空白)：
式中，A表示600nm波長處的吸光度；V表示稀釋倍數(shù)；I表示光程，取0.001m。
1.3.9十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
將蛋白樣品稀釋為80mg/mL，8000r/min離心5min，取上清液0.5mL加入250µL蒸餾水及緩沖液(0.2mL10%SDS和50µL0.01mol/L巰基乙醇)混合均勻，煮沸5min，冷卻后的蛋白溶液8000r/min離心5min，上樣量為20µL。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，電壓恒定為120V。取出凝膠放入考馬斯亮藍(lán)染液(R250)中染色30min，再用脫色液脫色至背景清晰，利用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶[19]。
1.4數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2013和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過Origin2019繪圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
2結(jié)果與分析
2.1粒徑分布
加熱溫度對漢麻蛋白聚集體粒徑分布有較大影響。由圖1顯示，隨加熱溫度的升高平均粒徑增大，90℃下平均粒徑高于80℃，達(dá)到175.8nm，PDI下降。當(dāng)熱處理溫度達(dá)到100℃時，平均粒徑可增至400.1nm，隨著熱處理溫度的升高，蛋白分子表面電荷數(shù)量減小，斥力減弱，分子聚集更容易，使?jié)h麻蛋白熱聚集體平均粒徑增大。王冬梅等[20]研究大豆蛋白熱處理的行為表征結(jié)果與本結(jié)論一致，隨著熱處理溫度的升高，大豆蛋白形成了可溶性聚集體，聚集體粒徑和分子量逐漸增大。漢麻蛋白在不同離子強(qiáng)度作用下，粒徑分布發(fā)生了明顯改變。如圖2所示，經(jīng)NaCl處理后的漢麻蛋白聚集體粒徑峰向右偏移，粒徑增大，平均粒徑由175.8nm增至271.2nm，PDI升高。隨著離子強(qiáng)度增大，漢麻蛋白熱聚集體粒徑逐漸增大，當(dāng)NaCl濃度從0.2mol/L增加至0.8mol/L時，平均粒徑由193.9nm增至271.2nm，PDI略有降低，這表明離子強(qiáng)度增加能促進(jìn)漢麻蛋白的聚集。在鹽離子作用下，蛋白微環(huán)境中的電荷產(chǎn)生屏蔽作用[21]，水化層被破壞，影響蛋白質(zhì)表面疏水作用，分子間斥力減小，更易發(fā)生聚集。同時，離子強(qiáng)度的增加相當(dāng)于減少蛋白質(zhì)的凈電荷密度，隨著NaCl濃度增大，分子表面電荷數(shù)減少，熱力學(xué)穩(wěn)定性下降，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，漢麻蛋白熱聚集體平均粒徑增大。李向紅等[22]通過對不同離子強(qiáng)度大豆分離蛋白熱聚集體的研究表明，隨著離子強(qiáng)度的增大，大豆分離蛋白熱聚集體的粒徑隨之增大，與本研究結(jié)論一致。
圖1不同溫度處理的漢麻蛋白熱聚集體粒徑分布變化(n=3)
圖2 不同離子強(qiáng)度處理的漢麻蛋白熱聚集體粒徑分布變化(n=3)
2.2ζ-電位
ζ-電位是溶液中帶電粒子的電層中剪切面的電位，通常用來評價膠體的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)溶液是一種典型的膠態(tài)分散體系，ζ-電位的絕對值越大，表明蛋白質(zhì)分子表面的負(fù)載量就越大，并有較大的靜電斥力維持系統(tǒng)處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)；相反，當(dāng)ζ-電位絕對值較低時，體系狀態(tài)不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)分子容易聚集。
隨著熱處理溫度升高，ζ-電位絕對值逐漸減小。100℃熱處理漢麻蛋白ζ-電位的絕對值小于80℃時，表明在100℃下分子表面電荷總數(shù)發(fā)生減少，蛋白質(zhì)分子間的斥力減弱，靜電作用力增強(qiáng)，漢麻蛋白分子及熱聚集體分子被靜電吸引形成了新的更大的聚集體分子。隨著熱處理溫度升高，ζ-電位的絕對值降低，可能是由于漢麻蛋白表面帶負(fù)電殘基隨著高溫處理逐漸掩埋，靜電排斥減少，溶液穩(wěn)定性降低，這將有利于體系中蛋白分子形成聚集體。
離子強(qiáng)度對漢麻蛋白熱聚集體ζ-電位有較大影響，NaCl處理后的漢麻蛋白熱聚集體的ζ-電位絕對值明顯低于未經(jīng)NaCl處理的漢麻蛋白熱聚集體。隨著NaCl濃度的增大，漢麻蛋白熱聚集體的ζ-電位絕對值逐漸減小，從
18.3mV降至8.05mV。處于特定離子強(qiáng)度的環(huán)境下漢麻蛋白分子由于靜電相互作用產(chǎn)生了屏蔽效應(yīng)，靜電相互作用引起的排斥弱化，使整個溶液體系中吸引力大于排斥力，以及體系中由于競爭水合加劇了分子間的碰撞，產(chǎn)生疏水性聚集，分散體系的平衡被完全破壞，溶液穩(wěn)定性降低，從而導(dǎo)致了漢麻蛋白聚集現(xiàn)象的發(fā)生。袁江蘭等[23]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度增加，大米谷蛋白熱聚集體ζ-電位絕對值減少，與上述結(jié)論相符。
2.3二級結(jié)構(gòu)
利用FTIR對漢麻蛋白聚集體進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖3、4所示。在酰胺Ⅰ帶(1700~1600cm?1)，漢麻蛋白熱聚集體具有較強(qiáng)的吸收峰，酰胺Ⅰ帶譜峰與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)之間有相對應(yīng)的關(guān)系，可以通過對峰面積的研究進(jìn)一步對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1、2所示。
經(jīng)過不同溫度處理的漢麻蛋白熱聚集體在酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰有顯著差異(P<0.05)。由圖3和表1可知，隨著熱處理溫度的升高，漢麻蛋白聚集體α-螺旋結(jié)構(gòu)顯著減少(P<0.05)，在100℃時最低；而β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)顯著增多(P<0.05)。此結(jié)果與熱處理紅蕓豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)相似，紅蕓豆蛋白隨溫度升高，α-螺旋結(jié)構(gòu)占比呈下降趨勢，而不規(guī)則結(jié)構(gòu)占比呈上升趨勢[24]。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋代表蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)，而β-折疊和無規(guī)則卷曲代表蛋白質(zhì)的無序結(jié)構(gòu)[25]，氫鍵是穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。FTIR結(jié)果顯示，熱處理對漢麻蛋白聚集體氫鍵有顯著影響，使維持α-螺旋的氫鍵斷裂，α-螺旋結(jié)構(gòu)打開，
疏水性基團(tuán)暴露，打破分子間作用力平衡，分子間的相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而通過β-折疊形成蛋白聚集體[26]。
圖3不同溫度處理的漢麻蛋白熱聚集體的紅外光譜圖
圖4不同離子強(qiáng)度處理的漢麻蛋白熱聚集體的紅外光譜圖
表1不同溫度處理對漢麻蛋白熱聚集體二級結(jié)構(gòu)的影響
在0.8mol/L時最高；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)先增大后減小，在0.6mol/L時最高。FTIR結(jié)果表明，離子強(qiáng)度的增加可以促進(jìn)漢麻蛋白聚集體從有序結(jié)構(gòu)向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，β-折疊結(jié)構(gòu)含量反映了蛋白疏水位點(diǎn)的暴露程度，隨著NaCl濃度的增加，蛋白聚集體發(fā)生部分變性且二級結(jié)構(gòu)改變，β-折疊結(jié)構(gòu)含量增大，疏水位點(diǎn)暴露，同時ζ-電位絕對值減小，分子間斥力減小，分子聚集形成更大的聚集體。
表2不同離子強(qiáng)度處理對漢麻蛋白熱聚集體二級結(jié)構(gòu)的影響
2.4巰基及二硫鍵
游離巰基是蛋白質(zhì)中最活躍的基團(tuán)。它位于蛋白質(zhì)分子表面，氧化后形成一個新的二硫鍵，對維持復(fù)合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起著重要作用。用含量表征了漢麻熱聚集體中蛋白質(zhì)氧化程度的變化，不同樣品的游離巰基含量可以反映不同處理方式對蛋白質(zhì)共價作用的影響。
由圖5可知，經(jīng)過熱處理后漢麻蛋白熱聚集體的總巰基含量有顯著變化(P<0.05)，由29.49μmol/g降至27.87μmol/g，游離巰基含量先減小后增大，二硫鍵先增大后減小。當(dāng)90℃熱處理時漢麻蛋白熱聚集溶液中的游離巰基含量最低為6.62μmol/g，這是由于隨著熱處理溫度的升高，游離巰基氧化成二硫鍵和發(fā)生-SH-SS互換反應(yīng)[27]，從而發(fā)生游離巰基減少和二硫鍵增多的現(xiàn)象；然而，當(dāng)熱處理溫度增加到100℃時，游離巰基含量反而提升至7.5μmol/g，可能是由于在100℃的熱處理時，蛋白質(zhì)發(fā)生疏水性聚集，使得暴露的游離巰基被部分包裹在聚集體內(nèi)部，不再發(fā)生-SH-SS互換和二硫鍵轉(zhuǎn)換[28]。
不同濃度NaCl處理對漢麻蛋白巰基和二硫鍵的影響如圖6所示。隨著離子強(qiáng)度增大，游離巰基含量變化顯著(P<0.05)，總巰基含量無顯著變化(P>0.05)。可知離子強(qiáng)度對漢麻蛋白游離巰基的二硫鍵轉(zhuǎn)換和-SH-SS互換影響不大。在不同離子強(qiáng)度的作用下，漢麻蛋白聚集現(xiàn)象的差異可能是由于疏水性基團(tuán)暴露增加，蛋白質(zhì)表面疏水性增加，從而發(fā)生疏水性聚集。
圖5不同溫度處理的漢麻蛋白熱聚集體的巰基和二硫鍵含量(n=3)
圖6不同離子強(qiáng)度處理的漢麻蛋白熱聚集體的巰基和二硫鍵含量(n=3)
2.4濁度
濁度法是監(jiān)測蛋白質(zhì)聚集最直觀最簡便的方法。熱處理溫度對漢麻蛋白熱聚集體濁度具有一定影響。隨著熱處理溫度的升高，濁度顯著增大(P<0.05)，80℃時漢麻蛋白濁度為900.55%，100℃時上升到1297.66%，渾濁程度肉眼可見。這是由于溫度促進(jìn)漢麻蛋白熱聚集行為的發(fā)生，隨著溫度升高，大分子可溶性聚集體增多，溶液濁度增大，漢麻蛋白濁度的增加與其平均粒徑增大的結(jié)果相互驗(yàn)證。陳振家等[24]研究紅蕓豆蛋白在70~95℃熱處理時穩(wěn)定性的結(jié)果與本研究結(jié)論一致，隨著熱處理溫度升高，紅蕓豆蛋白內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)的暴露，溶解度逐漸降低，濁度升高，高溫促進(jìn)蛋白聚集現(xiàn)象發(fā)生。JIANG等[29]的研究結(jié)果表明隨著NaCl濃度的增加，大豆蛋白更容易發(fā)生熱聚集，當(dāng)?shù)鞍自?/font>0.6mol/LNaCl溶液中加熱到80~97℃時，SPI濁度呈指數(shù)性增加，蛋白質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重聚集。但90℃與100℃處理下漢麻蛋白濁度變化不大，這是由于在100℃下，聚集現(xiàn)象加劇，生成大分子不溶性聚集體并以沉淀的形式析出，可溶性聚集體濁度相差不大。
離子強(qiáng)度對漢麻蛋白濁度也具有一定影響。隨著NaCl濃度的增大，漢麻蛋白濁度逐漸增大，從1267.2%增加到1341.06%，由此可知離子強(qiáng)度可促進(jìn)漢麻蛋白聚集。隨著離子強(qiáng)度增大，漢麻蛋白分子粒徑增大，溶液體系更穩(wěn)定。袁江蘭等[23]用0.30mol/LNaCl處理大米谷蛋白時，溶液濁度顯著增加，并且出現(xiàn)了肉眼可見的渾濁。JIANG等[29]研究結(jié)果顯示，大豆分離蛋白濁度隨著鹽離子強(qiáng)度的增加而增加。
2.6十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
漢麻蛋白主要由麻仁球蛋白(edestin)和白蛋白(albumin)組成。麻仁球蛋白占總蛋白質(zhì)含量的60%~80%，它由6個相同的亞基組成，每個亞基由一個酸性亞基(acidic subunits， AS)和一個堿性亞基(basic subunits， BS)通過一個二硫鍵連接而成[30]。麻仁球蛋白的分子量大約為300kDa，其中AS分子量約為34kDa，組成相對均一；而BS主要由兩個亞基組成，分子量分別為20和18kDa[31]。由圖7可見，漢麻蛋白熱聚集體在濃縮膠與分離膠頂部出現(xiàn)明顯條帶，并隨著溫度的升高和離子強(qiáng)度的增大，條帶更明顯。這可能是由于隨溫度升高和離子強(qiáng)度增大，漢麻蛋白發(fā)生聚集并形成大分子可溶性聚集體，這也是引起粒徑增大及濁度上升的原因。此結(jié)果與蔣將[32]的電泳結(jié)果一致，大豆蛋白聚集體在濃縮膠頂部出現(xiàn)聚集條帶。王慶玲[33]在研究pH偏移及熱處理對漢麻蛋白結(jié)構(gòu)的影響過程中也得到相同結(jié)論。而隨著熱處理溫度和離子強(qiáng)度的變化，漢麻蛋白分布在70kDa處的條帶具有明顯
圖7不同條件處理后漢麻蛋白熱聚集體的電泳圖
變化，隨著熱處理溫度增加和離子強(qiáng)度增大，70kDa處的條帶逐漸加深，在100℃和0.8mol/LNaCl處理?xiàng)l件下出現(xiàn)明顯的條帶。這說明熱處理溫度和離子強(qiáng)度會促使蛋白亞基的聚集，70kDa附近的亞基條帶在加熱過程中最易發(fā)生聚集，且隨著離子強(qiáng)度的增大聚集能力增大。溫度升高也會促使紅蕓豆蛋白亞基的聚集，90kDa附近的紅蕓豆蛋白亞基條帶在加熱過程中最易發(fā)生聚集，與本研究所得結(jié)果相似[24]。
3結(jié)論
食品加工過程中加熱是常見的處理方式，食鹽是必不可少的調(diào)味品，然而熱處理和離子強(qiáng)度對食品加工及食品品質(zhì)具有影響。熱處理可以促進(jìn)漢麻蛋白聚集行為的發(fā)生，并隨著熱處理溫度的升高，聚集現(xiàn)象更顯著。漢麻蛋白表面帶負(fù)電殘基隨著高溫處理逐漸掩埋，ζ-電位的絕對值降低，靜電排斥減少，分子間作用力平衡破壞；α-螺旋結(jié)構(gòu)打開，形成β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)象，游離巰基氧化生成二硫鍵，分子聚集粒徑增大，濁度上升，形成蛋白聚集體，體系穩(wěn)定性增強(qiáng)。隨著離子強(qiáng)度的升高，蛋白質(zhì)表面凈電荷密度減少，ζ-電位絕對值降低，蛋白微環(huán)境中的電荷產(chǎn)生屏蔽作用，分子間斥力減小，蛋白分子粒徑增大，更易發(fā)生聚集；α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，β-折疊結(jié)構(gòu)含量增大，蛋白結(jié)構(gòu)由有序性向無序性變化，濁度增大，形成大分子可溶性聚集體。離子強(qiáng)度對漢麻蛋白聚集行為具有一定的調(diào)控作用。本研究對熱處理及離子強(qiáng)度對漢麻蛋白聚集行為的影響進(jìn)行了探討，為漢麻蛋白的加工及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
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文章摘自：王冰，楊楊，范洪臣，李婷婷，張娜，石彥國，朱秀清.熱處理溫度和離子強(qiáng)度對漢麻蛋白熱聚集行為的影響[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2022，13(16)：5337-5344.
