1.2試驗(yàn)方法

1.2.1紅麻wrky家族成員的鑒定

紅麻WRKY家族成員的鑒定從國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(National Genomics Data Center)下載紅麻全基因組的核苷酸序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列^［15］，利用Blast軟件構(gòu)建本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，以紅麻HcWRKY71^［10］蛋白的氨基酸序列為比對(duì)序列，利用Blast本地比對(duì)功能，在本地建立的蛋白庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲取紅麻WRKY候選蛋白，同時(shí)從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//pfam.xfam.org/)下載WRKY基因家族保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件，利用HMMER3.1軟件在紅麻本地蛋白數(shù)據(jù)中進(jìn)行BlastP搜索，獲取紅麻WRKY候選蛋白，去掉重復(fù)序列后將二者獲得序列全部作為WRKY基因家族的候選序列。然后利用在線軟件SMART(http：//smart.embl.de/)和NCBI網(wǎng)站的CD-SearchTool對(duì)基因家族候選序列的WRKY結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，去掉不具有WRKY結(jié)構(gòu)域的候選序列，最后獲得紅麻WRKY基因家族序列，將獲得的WRKY基因家族序列逐條在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BlastP序列比對(duì)并命名。

1.2.2紅麻WRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從網(wǎng)站(https：//www.arabidopsis.org/)下載擬南芥WRKY家族成員核苷酸序列并翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，利用MEGA11.0軟件，采用鄰近法構(gòu)建擬南芥和紅麻2個(gè)物種WRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3紅麻WRKY家族基因保守基序和蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線網(wǎng)站MEME(https：//memesuite.org/)對(duì)紅麻WRKY家族基因進(jìn)行保守基序分析，同時(shí)利用在線網(wǎng)站ExPASy(https：//www.expasy.org/)檢測(cè)WRKY家族成員氨基酸序列的等電點(diǎn)(PI)、蛋白質(zhì)分子量(MW)和氨基酸數(shù)目(aa)。

1.2.4鹽脅迫下紅麻WRKY家族的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用植物總RNA提取試劑盒分別提取不同NaCl濃度脅迫下紅麻植株根、莖、葉的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。根據(jù)WRKY家族基因的核苷酸序列，利用PrimerPremier6.0設(shè)計(jì)引物(表1)。以Hcβaction基因為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)在不同NaCl濃度脅迫下WRKY家族成員的表達(dá)特征進(jìn)行分析，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。qRT-PCR的反應(yīng)體系：上下游引物各0.5μL，qPCRmix10μL，cDNA模板2μL，ddH2O補(bǔ)至20μL。qRT-PCR的2步法擴(kuò)增程序：95℃2min;95℃15s，60℃30s，45個(gè)循環(huán);溶解曲線標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃15s，65℃15s。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2結(jié)果與分析

2.1紅麻WRKY家族基因成員鑒定及其理化性質(zhì)分析

通過(guò)Blast和HMMER序列比對(duì)，結(jié)合WRKY保守結(jié)構(gòu)域分析，最后獲得33個(gè)WRKY家族成員。將33個(gè)WRKY家族成員逐條在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)分析，根據(jù)最小E值對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)命名。由表2可知，33個(gè)WRKY家族成員不均勻地分布在12條染色體上。其中，7，6號(hào)染色體分布的WRKY家族成員最多，各5個(gè)成員;5，8號(hào)染色體分布的WRKY家族成員最少，各1個(gè)成員;3，6，7號(hào)染色體分別存在同一基因的2個(gè)拷貝，分別是HcWRKY71-1、HcWRKY71-2;HcWRKY72-1、HcWRKY72-2;HcWRKY40-1、HcWRKY40-2。而HcWRKY75基因的2個(gè)拷貝分別位于18，4號(hào)染色體上。這可能是由基因組復(fù)制事件導(dǎo)致的結(jié)果。

WRKY家族成員理化性質(zhì)鑒定分析結(jié)果如表2所示，該基因家族多肽鏈氨基酸數(shù)目為87～1142個(gè);等電點(diǎn)為5.26～10.18;蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為0.2～132.7。

2.2紅麻WRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA11.0對(duì)72個(gè)擬南芥WRKY家族成員和33個(gè)紅麻WRKY家族成員的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，2個(gè)物種的WRKY家族成員分成了3個(gè)類群GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ，其中GroupⅢ包含了5個(gè)亞組。紅麻WRKY家族成員在每個(gè)分支都有分布，其中，GroupⅠ和GroupⅢ-a全部為紅麻WRKY家族成員。

紅麻WRKY家族成員中的HcWRKY13、Hc-wrky31?hcwrky33?hcwrky40-2分布在groupⅡ，與其相對(duì)應(yīng)的擬南芥的wrky家族成員則分布在groupⅢ。這可能是由于紅麻屬于錦葵科木槿屬，而擬南芥屬于十字花科鼠耳芥屬的緣故。

表2 WRKY家族成員及其理化性質(zhì)分析

2.3WRKY家族成員保守基序分析

由圖2可知，33個(gè)WRKY家族成員都含有WRKY保守基序，其中有5個(gè)WRKY家族成員含有2個(gè)WRKY保守基序。這一結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果相似，具有2個(gè)WRKY保守基序的WRKY家族成員(HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY58)都位于GroupⅡ;其余28個(gè)WRKY家族成員都含有1個(gè)WRKY保守基序，分布在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的不同分支上。

2.4WRKY家族成員在不同器官的表達(dá)分析

采用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)33個(gè)紅麻WRKY家族成員在不同器官的表達(dá)特征進(jìn)行分析，成功檢測(cè)到26個(gè)WRKY家族成員基因在不同器官的表達(dá)變化，分別是HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY9、HcWRKY11、HcWRKY13、HcWRKY17、HcWRKY24、HcWRKY31、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY39、HcWRKY40-1、HcWRKY40-2、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY47、HcWRKY53、HcWRKY57、HcWRKY58、HcWRKY65、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1、HcWRKY72-2、HcWRKY74。未能檢測(cè)到的WRKY家族成員有7個(gè)，分別是HcWRKY23、HcWRKY26、HcWRKY46、HcWRKY51、HcWRKY71-2、HcWRKY75-1、HcWRKY75-2。其中在根、莖、葉表達(dá)量沒(méi)有顯著差異的WRKY家族成員有8個(gè)，分別是HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY39、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY53、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1(圖3);在根和莖的表達(dá)量低于葉片的WRKY家族成員有5個(gè)，分別是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY47、HcWRKY74，其中在根中表達(dá)量極顯著低于葉片的是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY74。hcwrky71-2?hcwrky75-1?hcwrky75-2。其中在根?莖?葉表達(dá)量沒(méi)有顯著差異的wrky家族成員有8個(gè)，分別是hcwrky4?hcwrky7?hcwrky39?hcwrky43?hcwrky44?hcwrky53?hcwrky71-1?hcwrky72-1(圖3);在根和莖的表達(dá)量低于葉片的wrky家族成員有5個(gè)，分別是hcwrky2?hcwrky32?hcwrky33?hc-wrky47?hcwrky74，其中在根中表達(dá)量極顯著低于葉片的是hcwrky2?hcwrky32?hcwrky33?hcwrky74。在莖中表達(dá)量極顯著低于葉片的是基因hc-wrky33，顯著低于葉片的基因是hcwrky47?hc-wrky32。在根中表達(dá)量顯著低于葉片的基因是hcwrky72-2(圖4)。在莖中表達(dá)量高于葉片的wrky家族成員有12個(gè)，其中極顯著高于葉片的是hcwrky9?hcwrky13?hcwrky31?hcwrky40-1?hc-wrky40-2?hcwrky57?hcwrky65基因，顯著高于葉片的基因是hcwrky3?hcwrky17(圖5)。綜上所述，紅麻wrky家族成員在根?莖?葉都有表達(dá)，都屬于組成型表達(dá)基因。

圖1 紅麻和擬南芥wrky家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖2 紅麻wrky家族成員保守基序分布

圖3 在不同器官表達(dá)量無(wú)顯著差異的wrky家族成員

圖4 在根?莖表達(dá)量下調(diào)的wrky家族成員

圖5 在莖表達(dá)量上調(diào)的wrky家族成員

2.5鹽脅迫下wrky家族成員的表達(dá)分析

以葉片cdna為pcr模板，采用熒光定量pcr技術(shù)，對(duì)成功檢測(cè)到的26個(gè)wrky家族成員在鹽脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的wrky家族成員具有不同的表達(dá)特征。

2.5.1鹽脅迫下基因表達(dá)量一直上升的wrky家族成員

鹽脅迫下，隨著nacl濃度的升高，基因表達(dá)量一直上升的wrky家族成員有5個(gè)，分別是hcwrky17?hcwrky24?hcwrky40-1?hcwrky53?hcwrky71-1。由圖6可知，當(dāng)nacl濃度為400mmol/l時(shí)，hcwrky71-1基因表達(dá)量上調(diào)幅度最大，為對(duì)照的42倍，其次是hcwrky53?hcwrky40-1?hcwrky24?hcwrky17。與對(duì)照相比，這5個(gè)wrky家族成員表達(dá)量上調(diào)幅度都具有極顯著差異水平(p<0.01)。由此推測(cè)，這5個(gè)wrky家族成員在紅麻響應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中具有正向調(diào)控作用。

2.5.2鹽脅迫下基因表達(dá)量先上升后下降再上升的wrky家族成員

鹽脅迫下，隨著nacl濃度的升高，基因表達(dá)量先上升后下降然后再上升的wrky家族成員有5個(gè)，分別是hcwrky39?hcwrky40-2?hcwrky47?hcwrky58?hcwrky72-1。由圖7可知，在低濃度nacl脅迫下(50mmol/l)，這5個(gè)wrky家族成員基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，隨著nacl濃度的升高，基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)nacl濃度為400mmol/l時(shí)，hcwrky47?hcwrky58?hcwrky72-1基因的表達(dá)量則進(jìn)一步上升，其中hcwrky72-1基因的表達(dá)量是對(duì)照表達(dá)量的9倍多，其次依次是hcwrky47?hcwrky58。由此推測(cè)，這5個(gè)wrky家族成員在紅麻響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中具有正向調(diào)控作用。

圖6 鹽脅迫下表達(dá)量一直上升的wrky家族成員

圖7 鹽脅迫下基因表達(dá)量先上升后下降再上升的wrky家族成員

鹽脅迫下基因表達(dá)量先上升后下降的wrky家族成員隨著nacl濃度的升高，基因表達(dá)量先上升然后下降的wrky家族成員有12個(gè)，分別是hc-wrky2?hcwrky4?hcwrky7?hcwrky13?hcwrky31?hcwrky32?hcwrky33?hcwrky43?hcwrky44?hc-wrky65?hcwrky72-2?hcwrky74(圖8)。在nacl濃度為50mmol/l時(shí)，基因表達(dá)量達(dá)到最高值的有hc-wrky4?hcwrky13?hcwrky31?hcwrky33?hcwrky43?hcwrky72-2?hcwrky74;在nacl濃度為100mmol/l時(shí)，基因表達(dá)量達(dá)到最高值的有hcwrky4?hcwrky44?hcwrky65;在nacl濃度為200mmol/l時(shí)，基因表達(dá)量達(dá)到最高值有hcwrky2?hcwrky7?hcwrky32。與對(duì)照相比，基因表達(dá)量的最高值均具有極顯著差異(除hcwrky4外)。由此可知，這12個(gè)wrky家族成員表達(dá)量上調(diào)達(dá)各自峰值時(shí)對(duì)應(yīng)不同的nacl濃度，且在紅麻響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中均具有正向調(diào)控作用。

圖8 鹽脅迫下表達(dá)量先上升后下降的wrky家族成員

鹽脅迫下表達(dá)量先下降后上升的wrky家族成員隨著nacl濃度的升高，基因表達(dá)量先下降然后上升的wrky家族成員有1個(gè)，即hcwrky3。由圖9可知，在濃度nacl脅迫時(shí)(50，100mmol/l)該基因表達(dá)量下降，與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異，當(dāng)nacl濃度升高時(shí)(200，400mmol/l)該基因表達(dá)量上升，與對(duì)照相比具有極顯著差異。推測(cè)該基因在紅麻響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中具有正向調(diào)控作用。

2.5.4鹽脅迫下基因表達(dá)量一直下降的wrky家族成員

隨著nacl濃度的升高，基因表達(dá)量一直下降的wrky家族成員有3個(gè)，分別是hcwrky9?hc-wrky11?hcwrky57。由圖10可知，當(dāng)nacl濃度為400mmol/l，hcwrky11基因表達(dá)量下調(diào)幅度最大，為對(duì)照的1/16倍，其次是依次hcwrky57?hcwrky9。與對(duì)照相比，這3個(gè)wrky家族成員表達(dá)量下調(diào)幅度具有極顯著差異水平。由此推測(cè)，這3個(gè)wrky家族成員在紅麻響應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中具有負(fù)向調(diào)控作用。

圖9 鹽脅迫下表達(dá)量先下降后上升的wrky家族成員

圖10 鹽脅迫下表達(dá)量一直下降的wrky家族成員

綜上所述，鹽脅迫下，wrky基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的家族成員有23個(gè)，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的家族成員有3個(gè)，表達(dá)量上調(diào)的wrky基因可能具有正向調(diào)控作用，表達(dá)量下調(diào)表達(dá)的wrky基因可能具有負(fù)向調(diào)控作用。

3結(jié)論與討論

3.1紅麻wrky家族成員分子特征

wrky家族成員參與植物的不同逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目前很多植物已經(jīng)完成了wrky家族成員的系統(tǒng)分析，如擬南芥[16-18]?水稻[19]?小麥[20]?楊樹(shù)[21]?石榴^[22]。然而對(duì)紅麻wrky家族的系統(tǒng)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)紅麻基因組blast和hmmer序列比對(duì)，結(jié)合wrky保守結(jié)構(gòu)域分析，最后獲得了33個(gè)wrky家族成員，遠(yuǎn)少于棉花^[23]的109個(gè)wrky家族成員。這表明，與棉花相比，紅麻wrky基因家族在進(jìn)化過(guò)程中基因丟失現(xiàn)象嚴(yán)重，在西瓜^[24]和黃瓜^[25]wrky家族成員研究者也有相似的結(jié)果。不同的wrky家族成員之間在蛋白質(zhì)理化性質(zhì)方面存在一定的差異，比如氨基酸數(shù)目?蛋白質(zhì)分子量?理論等電點(diǎn)。這些理化性質(zhì)的差異是每個(gè)wrky家族成員具有不同生物學(xué)功能的分子基礎(chǔ)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)紅麻wrky家族成員hcwrky11?hc-wrky32?hcwrky46沒(méi)有與擬南芥的wrky家族成員聚類到一起。同時(shí)分別來(lái)源于紅麻和擬南芥的wrky家族成員在同一進(jìn)化樹(shù)的分支中存在散在的分布情況，說(shuō)明大多數(shù)同源基因在這2個(gè)物種適應(yīng)各自環(huán)境的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了一定程度的變異。

3.2紅麻wrky家族成員的鹽脅迫響應(yīng)

wrky轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。如在擬南芥中過(guò)表達(dá)棉花gmwrky34基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性^[26]，在煙草中過(guò)表達(dá)棉花gmwrky41基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性^[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，33個(gè)wrky家族成員中有26個(gè)被成功檢測(cè)到，且全部是鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因，其中23個(gè)wrky家族成員具有正向調(diào)控作用，3個(gè)wrky家族成員具有負(fù)向調(diào)控作用。這就是紅麻耐鹽性強(qiáng)的一個(gè)重要因素。

鹽脅迫下，紅麻hcwrky71-1基因的表達(dá)量隨著nacl濃度的增加而逐漸上調(diào)，這與鹽脅迫下棉花gh-wrky71^[28]基因的表達(dá)相似;hcwrky4基因的表達(dá)量隨著nacl濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，同樣甘蔗scwrky4^[29]基因的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo);紅麻hcwrky33基因和擬南芥atwrky33^[30]基因都是鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因。可見(jiàn)，同源基因在不同的物種中具有相似的生物學(xué)功能，這將為紅麻wrky家族成員的功能研究提供理論參考。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定出了33個(gè)wrky家族成員，不均勻地分布在12條染色體上。鹽脅迫下，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)成功檢測(cè)到26個(gè)wrky家族成員，其中23個(gè)具有正向調(diào)控作用，3個(gè)具有負(fù)向調(diào)控作用。這將為進(jìn)一步研究紅麻wrky家族成員的生物學(xué)功能奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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文獻(xiàn)摘自：李輝,康澤培,邱財(cái)生,戴志剛,邱化蛟.紅麻WRKY基因家族鑒定及其鹽脅迫下的表達(dá)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2022,37(04)：71-81.