摘 要：為提高工業(yè)大麻的經(jīng)濟(jì)價值，本研究以工業(yè)大麻葉為原料，利用離子液體輔助超聲法提取具有藥用價值的活性成分大麻二酚（CBD），并對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。本研究以CBD得率為指標(biāo)，先從16種咪唑類離子液體中篩選出[C8mim]NTF2為最佳提取溶劑。再對影響離子液體輔助超聲法提取CBD得率的6個因素（超聲功率、超聲溫度、超聲時間、乙醇溶液濃度、離子液體的摩爾濃度和液料比），進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并確定乙醇濃度為65%，離子液體摩爾濃度為0.3mol/L（65%乙醇溶液配制）。在此結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計篩選出4個顯著因素（超聲功率、超聲溫度、超聲時間和液料比）。并利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。確定CBD顯著因素的最佳提取工藝條件為：超聲功率280W，超聲溫度50℃，超聲時間62.5min，液料比25mL/g。在上述條件下，離子液體[C8mim]NTF2提取CBD得率為7.66%±0.2%、甲醇的CBD得率為6.42%±0.3%，65%乙醇溶液的CBD得率為5.81%±0.2%。即CBD的提取能力，離子液體[C8mim]NTF2>甲醇>65%乙醇溶液。通過CBD降解實(shí)驗(yàn)，表明離子液體[C8mim]NTF2的CBD降解率16.40%±0.3%，小于甲醇的24.65%±0.6%和65%乙醇溶液的32.88%±0.5%，表明65%乙醇溶液加入離子液體[C8mim]NTF2后，既可以降低CBD的降解率，又可提高CBD的得率。本研究證明了離子液體既是CBD的保護(hù)劑，也是CBD的優(yōu)良提取溶劑，研發(fā)了離子液體輔助超聲法提取CBD工藝，為工業(yè)大麻的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。
關(guān)鍵詞：工業(yè)大麻葉；大麻二酚（CBD）；離子液體；超聲提取；Plackett-Burman 設(shè)計；響應(yīng)面
工業(yè)大麻（Cannabis sativa L.）因其廣泛應(yīng)用于紡織、油料、營養(yǎng)食品、化妝品和生物燃料領(lǐng)域，而被廣泛種植[1,2]。近期，工業(yè)大麻中大麻素的藥用價值成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)今，已有80多種大麻素被鑒定出來，主要有是大麻二酚、四氫大麻酚、大麻酚，大麻萜酚、大麻環(huán)醇、大麻色原烯和大麻三醇等[3]。研究表明大麻素對人體生理和精神上具有治療作用，因此具有潛在的藥用價值[4]。但四氫大麻酚可用作麻醉品，所以多國規(guī)定工業(yè)大麻中THC 的含量必須低于0.3%[5]。其中，大麻二酚（Cannabidiol，CBD）是最重要的大麻素，是一種淡黃色晶體，幾乎不溶于水，見光受熱易分解，無致幻作用[6]。近年來，隨著國內(nèi)外對CBD研究的深入，發(fā)現(xiàn)CBD具有很高的藥用價值。Wang Y等[7]發(fā)現(xiàn)CBD能保護(hù)酒精性肝損傷。Wirth P W等[8]發(fā)現(xiàn)CBD具有抗炎、抗氧化等作用。在化妝品方面，Huber S等[9]發(fā)現(xiàn)CBD是天然的化妝品原料，可以舒緩、滋潤皮膚，并具有鎮(zhèn)痛功效。李焰梅等[10]發(fā)現(xiàn)CBD對皮膚發(fā)炎、發(fā)紅，皮膚敏感等癥狀具有療效，還有一定治療痤瘡的效果。劉凱等[11] 和Boehnke K F等[12] 均發(fā)現(xiàn)CBD具有緩解肌肉疼痛。Moltke J等[13]發(fā)現(xiàn)CBD具有改善焦慮和失眠的功效。但CBD不穩(wěn)定，是光敏，熱敏感物質(zhì)，易在提取過程中分解[14]。因此，如何提高CBD得率，且保證CBD在提取過程中的穩(wěn)定性，成為研究熱點(diǎn)。
以前，普遍通過甲醇、乙醇、氯仿和丙酮等有機(jī)溶劑熱回流提取CBD[15]。該方法成本低廉，操作簡單，但污染嚴(yán)重，存在易燃易爆等安全隱患。為了解決這些問題，一些新的提取方法被采用。微波輔助提取法和超聲輔助提取法，具有提取速度快、提取率高和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但依然需要有機(jī)溶劑進(jìn)行提取[16,17]。CO2超臨界流體提取法，是利用CO2超臨界流體替代有機(jī)溶劑進(jìn)行提取的方法，具有綠色、環(huán)保、無污染和提取率高等優(yōu)點(diǎn)，但存在能耗大、操作復(fù)雜和設(shè)備成本高等問題[18]。近期，一種新型提取溶劑離子液體成為研究熱點(diǎn)。離子液體是由對稱且體積較大的有機(jī)陽離子，及體積相對較小的無機(jī)陰離子組成，在室溫或近室溫下呈液態(tài)的鹽[19]。離子液體擁有，幾乎可忽略的蒸汽壓、不揮發(fā)、不易燃、較好的化學(xué)穩(wěn)定性、無毒無污染和可設(shè)計性等特點(diǎn)[20]。離子液體出現(xiàn)在20世紀(jì)70年代，作為電池的電解質(zhì)[21]。由于，離子液體具有通過改變陰陽離子組成，調(diào)控其的物理化學(xué)性質(zhì)的可設(shè)計性[22]。因此，離子液體得到了快速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域[23]。離子液體可以作為活性物質(zhì)提取的催化劑和萃取劑，能加速有機(jī)溶劑的提取效率或代替有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。Hao Xu等[24]闡明了基于咪唑類離子液體作為二苯并噻吩氧化脫硫的催化劑和萃取劑。Mazid[25]等發(fā)現(xiàn)離子液體可增強(qiáng)生物活性物質(zhì)的活性和穩(wěn)定性。Stefan等[26]研究發(fā)現(xiàn)離子液體陽離子為咪唑基團(tuán)時，極易在微生物作用下水解，而吡啶基團(tuán)則很難被分解，闡明了咪唑類離子液體對環(huán)境和人體安全，吡啶類離子液體具有毒性。
鑒于此，本研究以工業(yè)大麻葉為原料，采用咪唑類離子液體作為一定濃度乙醇水溶液的催化劑，在提高乙醇水溶液的提取能力基礎(chǔ)上，降低有機(jī)溶劑的使用量，并保證CBD在提取過程中的穩(wěn)定性。再輔助超聲法進(jìn)一步提高CBD的得率。并通過單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，對工業(yè)大麻葉中CBD的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立一個高效、安全的提取方法，為CBD的提取工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料及儀器
工業(yè)大麻葉，高CBD品種，黑龍江省哈爾濱市民主鎮(zhèn)大麻種植基地；大麻二酚（CBD）標(biāo)準(zhǔn)品，99.5%，西安元貝貝生物科技；無水乙醇，分析純，沈陽邁科麥科技有限公司；甲醇，分析純，沈陽邁科麥科技有限公司；甲醇，色譜純，沈陽邁科麥科技有限公司；乙腈，色譜純，沈陽邁科麥科技有限公司；[C4mim]PF6，99%，沈陽賽登科技；[C4mim]BF4，99%，沈陽賽登科技；[C4mim]Br，99%，沈陽賽登科技；[C4mim]NTF2，99%，沈陽賽登科技；[C6mim]PF6，99%，沈陽賽登科技；[C6mim]BF4，99%，沈陽賽登科技；[C6mim]Br，99%，沈陽賽登科技；[C6mim]NTF2，99%，沈陽賽登科技；[C8mim]PF6，99%，沈陽賽登科技；[C8mim]BF4，99%，沈陽賽登科技；[C8mim]Br，99%，沈陽賽登科技；[C8mim]NTF2，99%，沈陽賽登科技；[C10mim]PF6，99%，沈陽賽登科技；[C10mim]BF4，99%，沈陽賽登科技；[C10mim]Br，99%，沈陽賽登科技；[C10mim]NTF2，99%，沈陽賽登科技；實(shí)驗(yàn)用去離子水，娃哈哈集團(tuán)。
KQ-400KDE型高功率超聲波清洗器，濟(jì)寧亨達(dá)超聲波有限公司；CARY100型紫外分光光度計，上海精科有限公司；XS204型分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；3-18K型冷凍離心機(jī)，德國SIGMA公司；U3000型高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；SHB-III型循環(huán)水式真空泵，無錫市長慶化工防腐設(shè)備有限公司；DYF-500型萬能粉碎機(jī)，浙江瑞昊機(jī)械制造有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，蘇州德沃斯烘箱制造有限公司；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；QT-1旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 工藝流程
工業(yè)大麻葉→除雜→180℃高溫處理→粉碎成粉→過80目篩→定量稱取→與離子液體提取溶液混合→超聲提取→離心→取上清液→沉淀物復(fù)溶→離心→取上清液→兩次上清液合并→定容→液相色譜檢測
操作要點(diǎn):工業(yè)大麻葉除雜后，在鼓風(fēng)干燥箱中180℃高溫處理4h，使大麻葉中的大麻二酚酸（CBDA）受熱充分降解為CBD[20]。再利用萬能粉碎機(jī)將烘干后的大麻葉磨成粉，過80目篩。用一定濃度乙醇溶液溶解離子液體，配制成離子液體提取液，并按一定液料比與大麻粉混勻，制成混合液，并放入超聲波清洗器中提取。利用高速離心機(jī)使混合液固液分離，取上清，沉淀物再次用離子液體提取液二次提取，離心取上清，兩次上清液合并，定容，針入高效液相色譜檢測，按下面公式計算CBD得率：
式中：W1表示CBD得率，%；c表示根據(jù)峰面積計算出的溶液質(zhì)量濃度，g/mL；V表示供試品溶液體積，mL；D表示溶液稀釋倍數(shù)；m表示取樣量，g。
1.2.2 CBD液相色譜條件
CBD在波長220 nm有穩(wěn)定的特征吸收峰，因此CBD的色譜條件為：色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18 250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（25:75）；檢測波長：220nm；流速：1.0mL/min-l，柱溫：30℃[27]。
1.2.3 離子液體的篩選
選取咪唑類離子液體[C4mim]PF6、[C4mim]BF4、[C4mim]Br、[C4mim]NTF2、[C6mim]PF6、[C6mim]BF4、[C6mim]Br、[C6mim]NTF2、[C8mim]PF6、[C8mim]BF4、[C8mim]Br、[C8mim]NTF2、[C10mim]PF6、[C10mim]BF4、[C10mim]Br、[C10mim]NTF2進(jìn)行篩選。由于離子液體是粘稠的液體，而有些咪唑類離子液體難溶于水，因此需要一定濃度的乙醇水溶液溶解。因此，本實(shí)驗(yàn)，用70%乙醇溶液配制摩爾濃度為0.2mol/L的離子液體。稱取大麻粉末1.0g，將其置于離心管中，按液料比20mL/g的比例，加入摩爾濃度為0.2mol/L的離子液體，在功率280W、溫度40℃的條件下，進(jìn)行超聲提取40min。而后進(jìn)行離心15min，取上清液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，過0.22μm有機(jī)膜，針入高效液相色譜中檢測，篩選出CBD得率最高的離子液體。
1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)
根據(jù)上述提取方法，固定初始條件超聲溫度為50 ℃、超聲時間40min、乙醇溶液濃度70%、超離子液體摩爾濃度0.2mol/L和液料比20mL/g，研究不同超聲功率（200、240、280、320、360和400W）對CBD得率的影響；固定條件超聲功率為280W、超聲時間40min、乙醇溶液濃度70%、超離子液體摩爾濃度0.2mol/L和液料比20mL/g，研究不同超聲溫度（20、30、40、50、60和70℃）對CBD得率的影響；固定條件超聲功率為280W、超聲溫度50℃、乙醇溶液濃度70%、超離子液體摩爾濃度0.2mol/L和液料比20mL/g，研究不同超聲時間（20、30、40、50、60和70min）對CBD得率的影響；固定條件超聲功率為280 W、超聲溫度50℃、超聲時間60min、離子液體摩爾濃度0.2mol/L和液料比20mL/g，研究不同乙醇溶液濃度（55%、60%、65%、70%、75%和80%）對CBD得率的影響；固定條件超聲功率為280W、超聲溫度50℃、超聲時間60min、乙醇溶液濃度65%和液料比20mL/g，研究不同離子液體摩爾濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6mol/L）對CBD得率的影響；固定條件超聲功率為280W、超聲溫度50℃、超聲時間60min、乙醇溶液濃度65%和離子液體摩爾濃度0.3mol/L，研究不同液料比（10、15、20、25、30和35mL/g）對CBD得率的影響。
1.2.5 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計
Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計是一種析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計，可根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取各因素的高、低兩水平最佳實(shí)驗(yàn)條件區(qū)間，評估各因素的顯著性，進(jìn)而從大量因素中篩選出關(guān)鍵因素[28]。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面軟件Design-expert8.0，對CBD得率（Y1）的6個因素（A為超聲功率、B為超聲溫度、C為超聲時間、D為乙醇溶液濃度、E為離子液體摩爾濃度、F為液料比）進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)評估，共12次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。因素和水平編碼見表1。
表1 因素與水平編碼表
1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
在Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面軟件Design-expert 8.0的Box－Benhnken試驗(yàn)設(shè)計[29]，建立以超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）、超聲時間（X3）和液料比為自變量（X4），CBD得率為響應(yīng)值的4因素3水平Box－Benhnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ?/font>[26]。因素水平和編碼見表2。
表2 因素水平編碼表
1.2.7 不同溶劑提取對CBD得率的影響
分別精密稱取1.0g預(yù)處理后的藥用大麻葉粉末，于50mL離心管中。在響應(yīng)面優(yōu)化后的CBD的最佳工藝條件下，分別用甲醇和65%乙醇溶液，進(jìn)行超聲提取。超聲結(jié)束后離心15min，取上清液1mL，用甲醇定容到10mL，得到供試品溶液，過0.22μm有機(jī)濾膜，針入高效液相色譜檢測。甲醇和65%乙醇溶液分別提取的CBD得率與離子液體超聲提取工藝優(yōu)化得到的最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行比較。
1.2.8 不同溶劑提取對CBD降解的影響
分別精密稱取10.0mgCBD標(biāo)準(zhǔn)品，于1mL離心管中。在響應(yīng)面優(yōu)化后的CBD的最佳工藝條件下，分別用甲醇、65%乙醇溶液和離子液體溶液進(jìn)行超聲提取。超聲結(jié)束后離心15min，取上清液0.1mL，用甲醇定容到10mL，得到供試品溶液，過0.22μm有機(jī)濾膜，針入高效液相色譜檢測。按下面公式計算CBD降解率：
式中：W2表示CBD降解率，%；c表示根據(jù)峰面積計算出的溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；V表示供試品溶液體積，mL；D表示溶液稀釋倍數(shù)；m表示取樣量，mg。
2 結(jié)果與分析
2.1 CBD得率的測定
CBD的線性回歸程為y =529.7x+49.442，相關(guān)系數(shù)R2 =0.9992，在0.38~1.5mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2 離子液體篩選結(jié)果
如表3所示，16種離子液體對CBD的得率各不同，在離子液體摩爾濃度為0.2mol/L（70%乙醇配制）時，[C8mim]NTF2提取CBD的得率最高。這是因?yàn)檫溥蝾愲x子液體的親脂性是由離子液體的陰離子種類和陽離子碳鏈長度決定的[30]。其中的陰離子親脂性NTF2->BF4->PF6->Br-，并且隨著陽離子碳鏈的增長，離子液體的親脂性也隨之增加[31]。CBD屬于親脂性化合物，根據(jù)相似相溶規(guī)律，CBD更容易溶解到親脂性強(qiáng)的離子液體中。而由于[C10mim]NTF2分子量過大，在同等摩爾濃度下，較[C6mim]NTF2和[C8mim]NTF2過于黏稠，不利于細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的溶出。因此，選取[C8mim]NTF2為最佳的提取劑，進(jìn)行下一步CBD提取工藝研究。
表3 離子液體的篩選
2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 超聲功率對CBD得率的影響
如圖1a所示，當(dāng)超聲功率在200~280W時，隨著功率的增大，超聲波的空化能力也逐漸增強(qiáng)[32]，當(dāng)超聲功率達(dá)到280W時CBD的得率最高，達(dá)5.17%±0.4%；當(dāng)超聲功率高于280W時，超聲波的空化能力過強(qiáng)，會破壞CBD結(jié)構(gòu)，得率下降。故將超聲功率定為280W。
2.3.2 超聲溫度對CBD得率的影響
如圖1b所示，當(dāng)超聲溫度升高時，CBD得率快速增長，在50℃時，達(dá)到最高點(diǎn)。此時CBD得率為6.58%±0.3%。這是由于，隨著溫度上升，提取溶液溶解能力增強(qiáng)，提升提取效率。而后，CBD得率隨著溫度繼續(xù)上升而緩慢下降。這是由于，隨著溫度超過50℃，繼續(xù)上升，熱敏性物質(zhì)CBD逐漸分解。故將超聲溫度定位在50℃。
2.3.3 超聲時間對CBD得率的影響
如圖1c所示，隨著超聲時間的增加，CBD得率呈上升趨勢，這是因?yàn)槌暜a(chǎn)生的能量隨時間的增加逐漸增強(qiáng)[33]；當(dāng)超聲時間在60min時得率最高，達(dá)6.55%±0.3%；當(dāng)超聲時間大于60min時，CBD得率的走勢平緩。這是因?yàn)镃BD基本從細(xì)胞中進(jìn)入溶液中。為節(jié)約時間及成本，將超聲時間定為60min。
2.3.4 乙醇溶液濃度對CBD得率的影響
如圖1d所示，隨著乙醇溶液濃度的增加，CBD得率總體呈先上升后下降趨勢，當(dāng)乙醇濃度在65% 時得率最高，達(dá)6.65%±0.3%。這是因?yàn)檫^高濃度的乙醇溶液會破壞離子液體的結(jié)構(gòu)[34]，影響其對CBD的提取效果。因此，選擇濃度為65%的乙醇與離子液體混合使用。
2.3.5 離子液體摩爾濃度對CBD得率的影響
如圖1e所示，隨著的[C8mim]NTF2摩爾濃度的增加，CBD得率呈先升高后快速下降的趨勢。這是因?yàn)?，離子液體摩爾濃度低時，無法將大麻葉中的CBD提取完全。離子液體摩爾濃度在0.3mol/L時得率最高，得率達(dá)7.02%±0.3%；當(dāng)摩爾濃度大于0.3mol/L時，離子液體粘度過大，將大麻粉末包裹起來，影響CBD得率，故將摩爾濃度定為0.3mol/L。
2.3.6 液料比對CBD得率的影響
實(shí)驗(yàn)參數(shù)按超聲功率280W，超聲溫度50℃，超聲時間為60min，[C8mim]NTF2摩爾濃度0.3mol/L（65%乙醇配制），液料比分別為10、15、20、25、30、35mL/g的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖1f所示，隨著液料比的增加，CBD得率呈現(xiàn)逐漸升高后下降的趨勢，當(dāng)液料比小于25mL/g時，大麻粉末不能充分溶解在提取液中，并且提取液對CBD的溶解度以達(dá)到飽和，使得CBD提取能力降低。當(dāng)液料比為25mL/g時，得率最高為7.52%±0.3%；液料比大于25mL/g，過多的提取液占比會破壞CBD結(jié)構(gòu)，同時也會溶出大麻葉中的雜質(zhì)，使得率下降，故將液料比定為25mL/g。
圖1 各單因素對CBD得率的影響
2.4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計篩選關(guān)鍵因素
在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計法，篩選影響的CBD得率（Y1）的關(guān)鍵因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值見表4。并利用響應(yīng)面軟件Design-expert 8.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。
表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值
表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計方差分析
由表5可知，CBD得率的回歸模型均為極顯著（P<0.01），說明回歸方程的因變量與自變量具有顯著的線性關(guān)系，說明回歸有效，實(shí)驗(yàn)設(shè)計可靠[35]。而且，CBD得率的模型決定系數(shù)R2值為95.48%，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj值為90.05%，均在90.0%以上，說明CBD得率的響應(yīng)值變化90.05%來源于所選因素，表明模型擬合良好[36]。另外，變量因素A和C對CBD得率影響極顯著，變量因素B和F影響顯著，因此將這4個因素作為CBD得率下一步響應(yīng)面分析的關(guān)鍵因素[37]。其他不顯著因素，采用單因素最佳條件，即乙醇濃度為65%，離子液體摩爾濃度為0.3mol/L。
圖2為6種單因素對CBD得率影響的帕累托圖，能直觀表現(xiàn)出自變量因素對目標(biāo)響應(yīng)值的影響，并統(tǒng)計展示自變量因素的顯著性。帕累托圖有兩條t值限位線，分別為t-value限位線（2.78）和Bonferroni限位線（5.75），用于確定因素的顯著性。當(dāng)因素的t值高于t-value限位線數(shù)值時，則表明它的置信水平超過95%，可以認(rèn)為其是顯著的。當(dāng)因素的t值高于Bonferroni限位線數(shù)值時，則可以認(rèn)為其是極顯著的[38]。由圖2可知，變量因素A和C對CBD得率影響極顯著，變量因素B和F對CBD得率影響顯著。這與表5的結(jié)果一致，說明帕累托圖是準(zhǔn)確可靠的。再次明確將因素A（超聲功率）、B（超聲溫度）、C（超聲時間）和F（液料比）作為CBD得率下一步響應(yīng)面分析的關(guān)鍵因素。
圖2 六因素對CBD得率影響的帕累托圖
2.5 響應(yīng)面優(yōu)化CBD提取工藝
2.5.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計
根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面Box-Behnken法以超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）、超聲時間（X3）以及液料比（X4），4個因素為自變量，以CBD得率（Y1）為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。設(shè)計方案及試驗(yàn)結(jié)果見表6。
表6 Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果
通過Design-Expert 8.06軟件對表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到CBD得率（Y1）回歸方程：
Y1=7.66+0.15X1-0.078X2+0.28X3+0.11X4+0.32X1X2-0.22X1X3-7.5×10-3X1X4+0.27X2X3+0.13X2X4-0.48X3X4-0.61X12-0.83X22-0.54X32-0.69X42
由表7可知，CBD得率（Y1）回歸模型的P值<0.01，極顯著，說明這兩個二次回歸方程模型可靠。并且，Y1模型的失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說明Y1模型未失擬，擬合可信。Y1模型決定系數(shù)R2=95.57%，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=91.15%，說明95.57%的響應(yīng)值的可變性可以被該模型解釋，該模型擬合良好。上述方差結(jié)果表明，Y1模型可以準(zhǔn)確描述各因素與CBD得率的關(guān)系。Y1模型中因素X3、X1X2、X3X4、X12、X22、X32和X42對CBD得率影響極顯著（P<0.01），因素X1、X1X3和X2X3對CBD得率的影響顯著（P<0.05），其余因素不顯著。通過F 值大小可知，各因素對CBD得率影響強(qiáng)弱的順序?yàn)閄3>X1>X4>X2，即超聲時間>超聲功率>液料比>超聲溫度。
表7 方差分析結(jié)果
2.5.2 各因素交互作用分析
如圖3到圖6所示，超聲功率與超聲溫度、超聲功率與超聲時間、超聲溫度與超聲時間、超聲時間與液料比的交互作用等高線圖均呈現(xiàn)橢圓狀，表明各組交互作用對CBD得率影響顯著，與Y1模型方差結(jié)果一致。而且深色部分主要集中在7.5%范圍內(nèi)，說明模型擬合出的最佳CBD得率大于7.5%。圖3超聲功率與超聲溫度交互作用3D圖中，直觀展現(xiàn)出超聲功率和超聲溫度對CBD得率的響應(yīng)曲線，均呈先上升后下降的趨勢。CBD得率最高點(diǎn)在280W和50℃附近。圖4展示，超聲功率和超聲溫度對CBD得率的響應(yīng)曲線，均呈快速上升，而后緩慢下降的趨勢。CBD得率最高點(diǎn)在280W和60min附近。圖5展示，超聲溫度和超聲時間對CBD得率的響應(yīng)曲線，均呈先上升后下降的趨勢。CBD得率最高點(diǎn)在50℃和60min附近。圖6展示，超聲溫度和超聲時間對CBD得率的響應(yīng)曲線，均呈快速上升，而后緩慢下降的趨勢。CBD得率最高點(diǎn)在60min和25mL/g附近。
圖3 超聲功率與超聲溫度交互作用對CBD得率的影響
圖4 超聲功率和超聲時間交互作用對CBD得率的影響
圖5 超聲溫度和超聲時間交互作用對CBD得率的影響
2.5.3 模型驗(yàn)證結(jié)果
根據(jù)二次回歸方程，擬合提取CBD最佳工藝條件及結(jié)果。預(yù)測最佳工藝條件為，超聲功率283.11W，超聲溫度50.08℃，超聲時間62.45min，液料比24.98mL/g，CBD得率為7.70%±0.3%。根據(jù)實(shí)際操作需要，現(xiàn)實(shí)最佳工藝條件為，超聲功率280W，超聲溫度50℃，超聲時間62.5min，液料比25.0mL/g，CBD得率為7.66%±0.2%。誤差在2.0%之內(nèi)，說明響應(yīng)面擬合的工藝模型準(zhǔn)確可靠。
2.5.4 不同溶劑對CBD提取效果對比
如圖7所示，在響應(yīng)面優(yōu)化后的CBD的最佳工藝條件下，即液料比25mL/g，超聲時間62.5min，功率280 W，溫度50℃的條件下，甲醇提取CBD得率為6.42%±0.3%，65%乙醇溶液提取CBD得率為5.81%±0.2%。由2.5.3結(jié)果知0.3 mol/L離子液體（65%乙醇配制）提取CBD的得率為7.66%±0.2%。即CBD得率0.3mol/L離子液體>甲醇>65%乙醇溶液。這表明65%乙醇溶液加入離子液體后，提高了CBD得率。根據(jù)Mazid等的研究結(jié)果，離子液體可以保護(hù)CBD分子穩(wěn)定，防止其提取過程中降解[25]。從而達(dá)到提高CBD得率的效果。而且，咪唑類離子液體的親脂疏水性是由離子液體的陰離子種類和陽離子碳鏈長度決定的。根據(jù)Fan Y等的研究結(jié)果表明[39]，[C6mim]PF6的疏水性大于乙腈。而[C8mim]NTF2的疏水性大于[C8mim]PF6[40]。所以疏水性由強(qiáng)到弱排序?yàn)椋?/font>[C8mim]NTF2>[C8mim]PF6>[C6mim]PF6>乙腈>甲醇>乙醇。CBD是親脂疏水性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，對CBD的提取能力由強(qiáng)到弱為[C8mim]NTF2>甲醇>乙醇。所以，65%乙醇溶液加入離子液體[C8mim]NTF2后，CBD得率有了較大提升。
圖7 不同溶劑提取對CBD得率的影響
（a為甲醇；b為65%乙醇溶劑；c為0.3mol/L離子液體）
2.5.5不同溶劑對CBD降解效果對比
CBD是光敏和熱敏性物質(zhì)，在提取過程中易降解。如圖8所示，在響應(yīng)面優(yōu)化后的CBD的最佳工藝條件下，即液料比25mL/g，超聲時間62.5min，功率280W，溫度50℃的條件下，甲醇的CBD降解率為24.65%±0.6%，65%乙醇溶液的CBD降解率為32.88%±0.5%，0.3mol/L離子液體（65%乙醇配制）的CBD降解率為16.40%±0.3%。即CBD的降解率，65%乙醇溶液>甲醇>0.3mol/L離子液體。這是由于CBD在乙醇水溶液中，水呈H+和羥基（OH-）離子狀態(tài)，溶液活動高，使CBD易降解。而在CBD甲醇溶液中，CBD分子與甲醇和乙醇相互作用的是范德華力，溶液相對穩(wěn)定。所以，CBD在甲醇溶液中的降解率小于乙醇水溶液的。而65%乙醇溶液加入離子液體[C8mim]NTF2后，CBD的降解率不但降低了，而且小于甲醇的降解率。這是由于，CBD分子與離子液體的陰離子氫鍵相互作用，形成弱相互作用，弱相互作用力要強(qiáng)于范德華力[41]。因此，CBD分子在離子液體中穩(wěn)定性更好，更不易被降解，離子液體對CBD具有保護(hù)作用。
圖8 不同溶劑提取對CBD降解率的影響
（a為甲醇；b為65%乙醇溶劑；c為0.3mol/L離子液體）
3 結(jié)論
CBD是工業(yè)大麻葉中重要的活性物質(zhì)，并具有藥用價值。對CBD的提取方法進(jìn)行優(yōu)化從而提高CBD得率具有很高的應(yīng)用價值。本研究先從16種咪唑類離子液體中篩選出最佳提取溶劑[C8mim]NTF2。再通過單因素實(shí)驗(yàn)，對影響離子液體超聲法提取CBD得率的6個因素（超聲功率、超聲溫度、超聲時間、乙醇溶液濃度、離子液體的摩爾濃度和液料比）進(jìn)行優(yōu)化。并在此結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計篩選出4個顯著因素（超聲功率、超聲溫度、超聲時間和液料比）。并利用響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化顯著因素。確定提取CBD的最佳工藝條件為：超聲功率280W，超聲溫度50℃，超聲時間62.5min，液料比25mL/g。在此最佳提取工藝條件下，CBD得率為7.66%±0.2%，高于同條件下甲醇CBD得率6.42%±0.3%和65%乙醇溶液的CBD得率5.81%±0.2%。這是由于親脂疏水性[C8mim]NTF2>甲醇>乙醇>65%乙醇，而CBD疏水性強(qiáng)，根據(jù)相似相溶原理，對CBD提取能力為[C8mim]NTF2>甲醇>乙醇>65%乙醇。因此65%乙醇加入離子液體后，對CBD提取能力增強(qiáng)，CBD得率提升。通過CBD降解實(shí)驗(yàn)，表明0.3mol/L離子液體（65%乙醇配制）的CBD降解率16.40%±0.3%小于甲醇的24.65%±0.6%和65%乙醇溶液的32.88%±0.5%。這說明了65%乙醇溶液加入離子液體后，降低了CBD的降解率，離子液體對CBD具有保護(hù)作用。這主要是由于離子液體能與CBD分子形成弱相互作用力，大于甲醇和乙醇與CBD分子形成的范德華力，離子液體CBD溶液更穩(wěn)定，從而提高CBD的得率。因此，咪唑類離子液體[C8mim]NTF2不但是CBD的保護(hù)劑，還是CBD的優(yōu)良萃取劑。離子液體在本實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，降低了乙醇的使用量，替代了有毒的甲醇，并提高了CBD的得率。因此，離子液體輔助超聲法提取CBD工藝，具備綠色生產(chǎn)的潛力，為CBD的提取工藝研究提供數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步離子液體水溶液完全取代有機(jī)溶劑的提取工藝研發(fā)，提供參考依據(jù)。
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