摘 要：本試驗采用超聲輔助-乙醇浸提法，對水麻果中綠原酸的提取工藝進(jìn)行研究。通過四因素三水平的響應(yīng)面法對水麻果中綠原酸的提取展開試驗。結(jié)果表明：在乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度分別為65%、60:1mL/g、50min、80℃條件下，水麻果中綠原酸的提取率最高，為1.79%，表明該工藝可行。本研究為水麻果這種野生食物資源的開發(fā)利用提供參考。
關(guān)鍵詞：水麻果；綠原酸；超聲提取；響應(yīng)面法
水麻(Debregeasia orientalis C.J.Chen)，蕁麻科大葉苧麻的一種野生纖維植物。別稱溝邊木、比滿、水細(xì)麻、柳莓等，主要生長在我國西南地區(qū)、甘肅南部、陜西南部、西藏東南部、臺灣等地區(qū)。水麻全草有消積，止血解毒，消炎的功效，水麻葉可作草食畜類的飼料。水麻果實香甜可口，營養(yǎng)價值高，人體食用可補充氨基酸與微量元素，亦可用來釀酒。由于水麻具有對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，養(yǎng)護(hù)管理簡單，葉、果的景觀效果好等優(yōu)點，常用作園林綠化的優(yōu)選植物（張應(yīng)團(tuán)等，2013）。
綠原酸別稱咖啡鞣酸，屬于半水合物，為針狀結(jié)晶，是由咖啡酸和奎尼酸形成的酯類化合物。綠原酸具有較強(qiáng)的抗衰老、清除自由基、殺菌、抗病毒、抗癌、降血脂、保護(hù)心血管等作用（胡居吾等，2017；Hao，2016；Yan，2015）。楊超等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸在釀酒發(fā)酵中，通過改變細(xì)胞內(nèi)一些酶的活性和丙二醛的含量來改善酵母的抗逆能力，關(guān)鍵香氣物質(zhì)濃度隨時間的延長而升高并趨于穩(wěn)定。肖媚等（2021）對綠原酸在釀酒酵母中的作用機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的綠原酸對釀酒酵母的發(fā)酵特性影響較顯著。代重山等（2015）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中添加綠原酸后，可提高動物生產(chǎn)性能，抗病、抗環(huán)境應(yīng)激力、抗禽畜脂肪沉積和改善肉質(zhì)品的營養(yǎng)價值（萬凡等，2021；劉靜慧等，2020）。李新南等（2021）研究綠原酸眼用溫敏凝膠在兔眼內(nèi)的動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，此藥物可延長在眼內(nèi)的滯留時間，增長與病灶的接觸時間，提高凝膠的鋪展性，使凝膠滴眼液的生物利用度提高。
高林曉等（2021）發(fā)現(xiàn)，水麻葉中總黃酮抗氧化活性良好。Wang等（2020）發(fā)現(xiàn)，水麻葉多酚通過干擾宮頸癌細(xì)胞周期進(jìn)程或使其停滯生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，進(jìn)而抑制宮頸癌。王國良等（2019）對水麻果多酚提取分離和純化，表征抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)水麻果可作為新食品開發(fā)原料。目前水麻這種野生植物資源還沒有得到應(yīng)有的重視和開發(fā)，關(guān)于它的研究報道也很少。作為一種具有悠久歷史藥用價值的植物資源，其潛在的功能價值應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)。本試驗是以水麻果為原料，采用超聲波輔助提取法和乙醇浸提法來提取水麻果中綠原酸，對開發(fā)水麻果這種野生植物資源具有重大意義。
1材料與方法
1.1材料與儀器
水麻果樣品采自都勻市濕地公園，烘干、粉碎、過篩即得試驗用樣品。綠原酸對照品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號院LC202009）；無水乙醇（成都金山化學(xué)試劑有限公司）。
T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；AR224CN電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；KH2200DE數(shù)控超聲波清洗器（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）。
1.2試驗方法
1.2.1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
移液槍分別移取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的0.1mg/mL綠原酸對照液于10mL的量瓶中，無水乙醇定容并搖勻，室溫靜置15min后在328nm處測定以上溶液的吸光度A（石艷賓等，2019）。用Excel軟件做C-A關(guān)系圖，得到A=0.0494C-0.0363，R2=0.9947，綠原酸在濃度為2～30μg/mL時呈良好的線性關(guān)系。
1.2.2綠原酸提取工藝
水麻果→烘干→粉碎→過篩→稱重→超聲提取→離心分離→綠原酸提取液。
1.2.3水麻果中綠原酸含量的測定
準(zhǔn)確稱量水麻果樣品粉末0.25g，放入量瓶中，在一定的溫度下，按照液料比加入適量的無水乙醇進(jìn)行超聲提取，超聲提取后靜置一段時間，進(jìn)行離心操作，移液槍移取離心上清液1.0mL放入10mL量瓶中，并用無水乙醇定容，按照1.2.1方法測定水麻果中綠原酸提取液的吸光度A。計算公式如下：
Y/%=（c×Q×V×10-6）/m×100；
式中：Y為水麻果中綠原酸提取率，%；c為由吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)方程得到的提取液中綠原酸濃度，μg/mL；Q為稀釋倍數(shù)；V為樣品提取液體積，mL；m為水麻果質(zhì)量，g。
1.2.4綠原酸提取的單因素試驗設(shè)計
按照1.2.3的試驗方法，單因素試驗設(shè)計見下表1。
表1 單因素試驗設(shè)計
1.2.5響應(yīng)面試驗設(shè)計
參考單因素試驗結(jié)果，響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計見表2。
表2 響應(yīng)面因素水平
2結(jié)果與分析
2.1單因素試驗
2.1.1乙醇濃度對水麻果中綠原酸提取率的影響
準(zhǔn)確稱取0.25g水麻果樣品粉末6份加入具塞比色管中，按照表1中的試驗設(shè)計進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖1。造成綠原酸提取率先增大后減小的原因可能是，當(dāng)乙醇濃度比較低的時候水麻果中的綠原酸無法被全部溶解，而當(dāng)乙醇濃度高時其他脂溶性、醇溶性等雜質(zhì)的溶出，溶劑極性和介電性能的影響都會導(dǎo)致綠原酸含量減少提取率下降（張燕麗等，2021）。因此，當(dāng)乙醇濃度為65%比較適宜。
圖1 乙醇濃度對水麻果中綠原酸提取率的影響
2.1.2液料比對水麻果中綠原酸提取率的影響
準(zhǔn)確稱取0.25g水麻果樣品粉末6份加入具塞比色管中，按照表1中的試驗設(shè)計進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖2。造成綠原酸提取率先增大且趨于穩(wěn)定后稍微下降的原因可能是，一定條件下乙醇溶劑越多越有利于綠原酸的提取，隨溶劑增加其他色素、蛋白質(zhì)、脂類等雜質(zhì)溶出量也增大，導(dǎo)致綠原酸略有降低。液料比增加，溶劑的用量大，致使生產(chǎn)成本和后續(xù)工序處理增大（趙夢瑤等，2019）。因此，液料比為60:1mL/g比較適宜。
圖2 液料比對水麻果中綠原酸提取率的影響
2.1.3提取時間對水麻果中綠原酸提取率的影響
準(zhǔn)確稱取0.25g水麻果樣品粉末6份加入具塞比色管中，按照表1中的試驗設(shè)計進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖3。隨著提取時間的增加，綠原酸提取率先急劇增大后逐漸減小。超聲波的充分振蕩及空穴效應(yīng)促使了綠原酸的溶出，但是當(dāng)超聲時間過長時，由于綠原酸分子鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性而部分降解（張燕麗等，2021）。因此，提取時間為45min比較適宜。
圖3 提取時間對水麻果中綠原酸提取率的影響
2.1.4超聲溫度對水麻果中綠原酸提取率的影響
準(zhǔn)確稱取0.25g水麻果樣品粉末6份加入具塞比色管中，按照表1中的試驗設(shè)計進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖4。溫度從30益到80益時，綠原酸提取率先基本不變后驟然增大再隨著溫度的上升而下降。可能是因為溫度升高加快了水麻果內(nèi)綠原酸的分子運動使其更易析出，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，綠原酸分子水解和分子內(nèi)酯基遷移而形成同分異構(gòu)體。因而導(dǎo)致綠原酸提取率下降（宋越冬等，2020）。因此，超聲溫度70益比較適宜。
圖4 超聲溫度對水麻果中綠原酸提取率的影響
2.2響應(yīng)面試驗
2.2.1響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果
按照響應(yīng)面因素水平設(shè)計表2進(jìn)行試驗，結(jié)果見表3。可得多元回歸方程模型為：Y=-33.37640+0.42332A+0.33768B+0.40091C+0.032075D+7.2500×10-4AB-2.32500×10-3AC-3.00000×10-4AD-4.75000×10-4BC+1.75000×10-4BD+2.75000×10-4CD-2.64250×10-3A2–3.10500×10-3B2-2.60500×10-3C2-9.25000×10-5D2。
2.2.2響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ图胺讲罘治?/span>
由表4可知，模型F=140.64，P<0.0001表明此試驗影響顯著。失擬項F=0.99，P=0.5537>0.05，表明失擬檢驗不顯著，模型與試驗值差異小。模型的決定系數(shù)R2=0.9929，校正決定系數(shù)Radj2=0.9859，表明98.59%水麻果中綠原酸提取率的變化都可用此模型進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)表4中各項的F值可知:B、C、D、AB、AC、A2、B2、C2等對綠原酸提取率的影響極顯著，A、BC兩項影響較顯著，其余項影響不顯著。由F值的大小還可以判斷影響水麻果中綠原酸提取率大小的順序是:超聲溫度>超聲時間>液料比>乙醇濃度。
表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果
2.2.3響應(yīng)面交互項圖形分析
從圖5三維曲面和等高線圖可直觀看出，A、B、C等側(cè)的坡度都比D側(cè)的平緩，表明D項對水麻果綠原酸提取率的影響最顯著。A、B、C和D項之間的等高線較稀疏，表明AD、BD、CD交互作用不顯著。B側(cè)的坡度比A側(cè)的陡峭，C側(cè)的坡面較A側(cè)的陡峭，C側(cè)的坡面較B側(cè)的陡峭，表明C項對于綠原酸提取率影響大于B項，A項次之。AB、AC的等高線密集且呈橢圓形，表明AB、AC交互作用極顯著。BC項的等高線較密集，形狀接近橢圓形，表明BC交互作用較顯著（郝曉華等，2021；唐森等，2021）。以上分析與表4結(jié)果相符，表明此模型具有可行性。
表4 試驗方差分析結(jié)果
注：*P<0.05，表示差異性顯著，**P<0.01，表示差異性極顯著。
2.2.4響應(yīng)面優(yōu)化驗證試驗
采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件為62.89%乙醇濃度，60.33:1mL/g液料比，47.60min超聲時間，80℃超聲溫度，水麻果中綠原酸提取率預(yù)測值為1.83%。從試驗實際操作考慮調(diào)整為65%乙醇濃度，60:1mL/g液料比，50min超聲時間，80℃超聲溫度，重復(fù)試驗三次，得到水麻果中綠原酸提取率平均值為1.79%。與預(yù)測值誤差小，表明該試驗?zāi)Ｐ涂尚?/font>、可操作。
3結(jié)論
本試驗采用超聲輔助提取水麻果中的綠原酸，并對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到在65%乙醇濃度，60:1mL/g液料比，50min超聲時間，80℃超聲溫度下水麻果中綠原酸提取率最大。此研究為水麻果野生植物資源的進(jìn)一步開發(fā)和生產(chǎn)加工提供理論指導(dǎo)。
圖5 交互項對水麻果中綠原酸提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖
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文章摘自：高林曉，文冬冬，郭蒙，楊再波.響應(yīng)面法優(yōu)化水麻果中綠原酸提取工藝[J/OL].中國飼料:1-7[2022-11-10].
DOI:10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20220101-57.
