摘 要：目的：優(yōu)化提取羅布麻黃酮成分最佳工藝條件。方法：選用乙醇回流提取法對(duì)羅布麻中黃酮化合物的提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳的提取工藝參數(shù)。結(jié)果：最佳提取工藝為乙醇濃度70％，提取溫度70℃，提取回流時(shí)間60min，液料比30ml/g。結(jié)論：乙醇回流提取法工藝簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，由試驗(yàn)得出的羅布麻黃酮最佳提取率可達(dá)到24.6％，對(duì)植物黃酮的提取分離工藝具有參考價(jià)值。
關(guān)鍵詞：羅布麻；黃酮；響應(yīng)面法；正交法
羅布麻（Apocynumvenetum），在我國(guó)新疆、青海和甘肅等省區(qū)均有分布，有清熱利濕、降血脂、平抑旰陽(yáng)、安神等作用。現(xiàn)代藥理研究表明，羅布麻葉中起主要作用的是黃酮類化合物成分，具有抗氧化、保肝、抗神經(jīng)衰弱等多種生物活性[1，,2]?！吨袊?guó)藥典》記載其性味淡、微苦、性平，有清熱平肝、益心利水之效，主治頭痛、尿少、水腫、失眠等癥[3]。實(shí)現(xiàn)其藥用價(jià)值的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為黃酮類化合物的有效提取，當(dāng)前有很多黃酮類化合物的提取方法，其中包括回流提取法、堿提酸沉法、微波提取法、酶輔助提取法、超臨界流體萃取法等。其中乙醇回流提取法工藝簡(jiǎn)單、成本低，在中藥制藥、植物天然產(chǎn)物提取中發(fā)揮著不可或缺的重要作用。
黃酮類化合物是一類具有多酚結(jié)構(gòu)的植物次生代謝產(chǎn)物，較廣泛分布于雙子葉植物中，在治療癌癥、阿海茨默?。?/font>AD）、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病中均有應(yīng)用，且具顯著提高免疫機(jī)能作用[4]。為實(shí)現(xiàn)自然資源的合理運(yùn)用，減少有效成分的流失，其分離純化尤為重要。該試驗(yàn)通過(guò)乙醇回流法提取羅布麻黃酮，采用正交法和響應(yīng)面法進(jìn)行工藝設(shè)計(jì)，通過(guò)對(duì)優(yōu)化結(jié)果的分析比較，明確提取的最佳條件，為羅布麻黃酮新產(chǎn)品的開發(fā)提供實(shí)踐依據(jù)［5，,6］。
1材料與方法
1.1材料
取羅布麻葉為材料磨粉，過(guò)100目篩，密封保管備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；蒸餾水；95%乙醇；無(wú)水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。
1.2儀器
DK-S26型水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A，鄭州市亞榮儀器有限公司；FA2004N電子分析天平；V-5000可見分光光度計(jì)，METASH上海元儀器有限公司；UV-1800型紫外可見光分光光度計(jì)；多功能粉碎機(jī)；立式高壓蒸汽滅菌鍋；電熱鼓風(fēng)干燥箱。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1單因素試驗(yàn)
采取控制變量法對(duì)提取羅布麻黃酮的工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別考察液料比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)羅布麻黃酮提取率的影響[7]。即控制乙醇濃度為70%，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為60min，在液料比為10ml/g、20ml/g、30ml/g、40ml/g、50ml/g的條件下測(cè)定黃酮提取率；控制乙醇濃度為70%，液料比為30ml/g，提取時(shí)間為60min，在提取溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的條件下測(cè)定黃酮提取率；控制乙醇濃度為70%，液料比為30ml/g，提取溫度為70℃，在提取時(shí)間為40min、50min、60min、70min、80min的條件下測(cè)定黃酮提取率；控制液料比為30ml/g，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為60min，在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%條件下測(cè)定黃酮提取率。
1.3.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)明確液料比，提取時(shí)間，乙醇濃度，提取溫度等因素的最佳影響條件，優(yōu)化羅布麻葉中黃酮的提取工藝[8]。
1.3.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Design-Expert8.0.6.1軟件中的設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）、液料比（D）為四個(gè)考察因素，黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析法分析得出羅布麻黃酮的最佳提取工藝條件[9]。
1.3.4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
向50mL容量瓶中加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，加入幾滴無(wú)水乙醇使其溶解，加入60%乙醇稀釋至刻度得到0.1mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取6支10mL的容量管，分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml上述0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每管再加入0.3mL的5%NaNO3溶液，搖勻后放置5min；加入0.3mL的10%A（lNO3）3溶液，搖勻后放置6min；再加入4mL4%NaOH溶液，蒸餾水稀釋至10mL，搖勻靜置15min。以第一管樣品溶液為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度作圖，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。
2結(jié)果與分析
2.1羅布麻黃酮類化合物的粗提
將20.00g羅布麻粉末、600mL70%乙醇溶液加入到1000mL回流瓶中，即液料比選擇30ml/g，乙醇回流提取1h后過(guò)濾雜質(zhì)，同法進(jìn)行提取3次[11]，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀合并提取液，得到濃縮液，將濃縮液水浴加熱90℃直至葉綠素完全析出，過(guò)濾去除葉綠素沉淀，接著進(jìn)行醇沉，即加入3倍體積的95%乙醇靜置48h，過(guò)濾去除雜蛋白，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏，可得到4.86g黃酮類化合物粗提物，提取率為24.3％。
2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線用最小二乘法作線性回歸，回歸方程為y=0.0105x+0.0166（R2=0.9933），經(jīng)檢驗(yàn)P<0.01。因此，該回歸方程可適用于定量測(cè)定檢驗(yàn)。
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.3羅布麻粗提物黃酮的測(cè)定
向10mL的刻度試管中加入1.00mL過(guò)濾后的提取液。測(cè)定提取液吸光度為1.47，代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到提取液黃酮的濃度0.138mg/ml[12]。黃酮提取率=（[提取液總黃酮質(zhì)量濃度×樣品提取液總體積）（/測(cè)定用提取液體積×原料質(zhì)量×1000）]×100%。經(jīng)計(jì)算后的濃度算出樣品溶液中黃酮化合物的含量為67mg/g[13]。
2.4單因素試驗(yàn)分析
2.4.1乙醇濃度
稱取5份10g的羅布麻粉末，分別加入300ml不同濃度乙醇于回流裝置內(nèi)，70℃反應(yīng)60min，結(jié)果如圖2。由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度高于70%后，黃酮提取率隨乙醇濃度的升高而降低。因此本試驗(yàn)選取乙醇濃度為70%。
2.4.2提取時(shí)間
稱取5份10g的羅布麻粉末，加入300ml70%的乙醇，在提取溫度為70℃的條件下，提取不同時(shí)間，結(jié)果由圖2。由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60min后，黃酮提取率逐漸降低。因此本試驗(yàn)選取提取時(shí)間為60min。
2.4.3提取溫度
稱取5份10g的羅布麻粉末，加入300ml70%乙醇于回流裝置中，在不同溫度下提取60min，結(jié)果如圖2。由圖2可知，當(dāng)提取溫度高于70℃時(shí)，黃酮提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此本試驗(yàn)選取提取溫度為70℃。
2.4.4液料比
稱取5份10g的羅布麻粉末，按不同料液比加入70%的乙醇于回流裝置中，70℃下反應(yīng)60min，結(jié)果如圖2。由圖2可知，當(dāng)液料比超過(guò)30ml/g時(shí)，黃酮的提取率隨液料比的增大而下降。因此本試驗(yàn)選取液料比為30ml/g。
A.不同乙醇濃度下的黃酮提取率；B.不同提取時(shí)間下的黃酮提取率；C.不同提取溫度下的黃酮提取率；D.不同料液比下的黃酮提取率
圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果
在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平進(jìn)行四因素三水平的L（934）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1。結(jié)果表明，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的重要次序依次為液料比，乙醇濃度，提取溫度，提取時(shí)間[14]。
表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果
|
處理 |
因素 |
黃酮提取率/% |
|||
|
提取時(shí)間 |
乙醇濃度 |
提取溫度 |
液料比 |
||
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
20.83 |
|
2 |
2 |
2 |
2 |
1 |
20.38 |
|
3 |
3 |
3 |
3 |
1 |
18.17 |
|
4 |
3 |
2 |
1 |
2 |
23.35 |
|
5 |
1 |
3 |
2 |
2 |
20.85 |
|
6 |
2 |
1 |
3 |
2 |
23.31 |
|
7 |
2 |
3 |
1 |
3 |
19.12 |
|
8 |
3 |
1 |
2 |
3 |
18.44 |
|
9 |
1 |
2 |
3 |
3 |
18.97 |
|
K1 |
60.65 |
62.58 |
63.3 |
59.38 |
|
|
K2 |
62.66 |
62.7 |
59.67 |
67.51 |
|
|
K3 |
59.96 |
58.14 |
60.45 |
56．53 |
|
|
R |
2.7 |
4.44 |
3.66 |
10.98 |
|
2.6響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果
響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如圖3所示。由圖3可看出，本試驗(yàn)中液料比對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面圖坡度較陡，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，因而可知在四個(gè)因素中液料比對(duì)黃酮提取率最顯著[15]。各因素對(duì)羅布麻黃酮提取率的影響最大的是液料比，乙醇濃度次之，接著為提取溫度，提取時(shí)間影響最小。由Design-Expert8.0.6.1軟件預(yù)測(cè)的最佳提取條件為：提取時(shí)間60min，提取溫度70℃，液料比30ml/g，乙醇濃度70%，此時(shí)羅布麻黃酮提取率為24.6%。
圖3 兩因素交互作用對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖
圖3中，A為提取時(shí)間和液料比對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖；B為乙醇濃度和液料比對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖；C為提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖；D為提取溫度和液料比對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖；E為乙醇濃度和提取溫度對(duì)黃酮提取率影響響應(yīng)面圖；F為提取時(shí)間和提取溫度對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖。
由以上結(jié)果可知，正交實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化的提取條件一致，按照工藝優(yōu)化條件，進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得總黃酮的最高提取率為24.6%，和相關(guān)研究結(jié)果相近[16]，表明正交試驗(yàn)所得工藝條件可靠，所建立的回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)性，通過(guò)響應(yīng)面得到的羅布麻黃酮成分提取最佳條件準(zhǔn)確可靠[17]。
3結(jié)論
采用乙醇回流法提取羅布麻黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響羅布麻黃酮提取率的四個(gè)因素即乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液料比進(jìn)行對(duì)比研究，優(yōu)化羅布麻黃酮提取工藝。綜合以上因素得到的羅布麻黃酮最佳提取條件為：乙醇濃度70%，提取時(shí)間60min，提取溫度70℃，液料比30ml/g，在此條件下羅布麻黃酮的提取率為24.6%。
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文章摘自：周永萍，鄭芝琳，朱月瀅，王亞玲，郭曉農(nóng).響應(yīng)面法和正交法優(yōu)化羅布麻黃酮提取工藝［J］.輕工科技2022年第38卷第3期。
