摘 要：研究以4份黃麻(圓果種和長果種各2份)為試驗(yàn)材料，采用黃麻組培苗的莖段為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷組織，建立植株再生體系。結(jié)果表明：利用均勻設(shè)計(jì)法進(jìn)行培養(yǎng)基配制，圓果種黃麻愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于長果種黃麻，4個(gè)黃麻品種的排序?yàn)?79＞梅峰4號(M4)＞尤溪長果(YC)＞廣巴矮(GBA)。4個(gè)黃麻品種的最佳培養(yǎng)基如下，179：MS+0.53mg/L 2，4－D+2.0mg/L 6－BA，愈傷組織誘導(dǎo)率100%；梅峰4號：MS+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L 2，4－D，誘導(dǎo)率100%；尤溪長果：MS+2.0mg/L TDZ+2.0mg/L 6－BA，誘導(dǎo)率63%；廣巴矮：MS+2.0mg/L TDZ+2.0mg/L 2，4－D+2.0mg/L 6－BA，誘導(dǎo)率52%。以生長良好的愈傷組織為材料，采用正交設(shè)計(jì)配制培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽和不定根誘導(dǎo)分化，結(jié)果表明，4個(gè)品種的誘導(dǎo)與再生能力差異顯著，圓果種依然優(yōu)于長果種，其誘導(dǎo)效果黃麻179＞M4＞YC＞GBA。篩選出對4個(gè)品種都最佳的不定芽培養(yǎng)基9號，適合179的13號，適合M4和GBA的14號不定根培養(yǎng)基。黃麻179和M4獲得再生植株，YC誘導(dǎo)出不定根，GBA只誘導(dǎo)出不定芽。
關(guān)鍵詞：黃麻；愈傷組織；再生體系
黃麻是世界上種植規(guī)模僅次于棉花的重要纖維作物，其生產(chǎn)主要分布在亞洲的印度、孟加拉國等，是這些國家重要的經(jīng)濟(jì)作物。其主要的栽培品種有：“圓果種”(Corchorus capsularis L.)和“長果種”(Corchorus olitorius L.)。黃麻具有纖維產(chǎn)量高、質(zhì)地柔軟、吸濕性能好等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于商業(yè)、工業(yè)和建筑業(yè)領(lǐng)域。
植物組織培養(yǎng)經(jīng)過百余年的發(fā)展，已經(jīng)成為生物科學(xué)中一項(xiàng)不可或缺的技術(shù)，其對作物育種與遺傳轉(zhuǎn)化有重要的意義［1］。而構(gòu)建植物組織的再生體系，尤其是植物愈傷組織的獲得，更是原生質(zhì)體融合、遺傳轉(zhuǎn)化、植株再生等的研究基礎(chǔ)［2－3］。目前，國內(nèi)外有關(guān)黃麻再生體系的研究報(bào)道較少，且多采用子葉和下胚軸作為離體培養(yǎng)的材料，同時(shí)存在愈傷組織易褐化，不定芽再生困難等問題［4－5］。目前已建立的黃麻再生體系的通用性仍然較差，建立穩(wěn)定的黃麻再生體系十分必要。
本研究以不同基因型的黃麻幼莖為外植體，研究不同濃度的激素配比對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)，以及愈傷組織分化不定芽、不定根的差異，建立不同品種黃麻品種的再生體系，以期為進(jìn)一步利用原生質(zhì)體融合和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對黃麻種質(zhì)資源進(jìn)行改良奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1供試材料
試驗(yàn)種子為2份圓果種黃麻“梅峰4號”(以下稱M4)、“179”，以及2份長果種黃麻“尤溪長果”(以下稱YC)、“廣巴矮”(以下稱GBA)，均由福建農(nóng)林大學(xué)麻類作物遺傳育種與綜合利用實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2儀器與試劑
儀器與設(shè)備：超凈工作臺、冰箱、光照培養(yǎng)箱、微波爐、高壓蒸汽滅菌鍋、烘干箱、pH計(jì)；
藥品與試劑：無水乙醇、工業(yè)酒精、蒸餾水、次氯酸鈉、氫氧化鈉、蔗糖、瓊脂粉等；
植物激素：噻苯隆(TDZ)、2.4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)、6－芐氨基嘌呤(6－BA)、α－萘乙酸(NAA)、抗壞血酸(Vc)、吲哚丁酸(IBA)。
MS培養(yǎng)基見表1。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1黃麻無菌苗的獲得
4個(gè)黃麻品種均選取籽粒飽滿、大小一致的種子，用純凈水清洗半小時(shí)后晾干，備用。
(1)滅菌處理篩選
按照文獻(xiàn)［6］的方法，在超凈工作臺上將準(zhǔn)備好的黃麻種子進(jìn)行滅菌處理，而后接種于3種MS培養(yǎng)基。3種培養(yǎng)基的配制方法參考文獻(xiàn)［8－9］。
(2)培養(yǎng)條件
接種后，培養(yǎng)基置于光照培養(yǎng)箱，處理?xiàng)l件：光/暗交替16h/8h，溫度25℃/20℃(白天/黑夜)，光照強(qiáng)度為2000YC［6］。
表1 MS培養(yǎng)基配方
1.3.2愈傷組織的誘導(dǎo)
培養(yǎng)15d后，取無菌苗莖段，接種于MS培養(yǎng)基(不同激素配方)。15d轉(zhuǎn)接一次，40d進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)情況統(tǒng)計(jì)。每個(gè)激素組合處理20個(gè)莖段，4次重復(fù)。采用均勻設(shè)計(jì)法培養(yǎng)［7］(表2)。
1.3.3不定芽誘導(dǎo)
按表3的方案設(shè)計(jì)不定芽誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基，愈傷組織切成小塊，置于不同的培養(yǎng)基中，每個(gè)激素組合處理20個(gè)莖段，4次重復(fù)［6］。30d后統(tǒng)計(jì)分化率，40d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。
1.3.4不定根誘導(dǎo)
取4～5cm不定芽，置于不同激素組合的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(表4)，每個(gè)激素組合處理20個(gè)不定芽，4次重復(fù)［6］，30d統(tǒng)計(jì)生根率。
1.3.5再生苗移栽
黃麻再生根3～4cm時(shí)，煉苗處理。3d后，移栽花盆煉苗。一個(gè)月后，移栽大田觀察。
1.4數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過excel進(jìn)行方差分析和多重比較；采用SPSS軟件對不同激素組合對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以得出最優(yōu)激素組合。
表2 愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)均勻設(shè)計(jì)表
表3 不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)表
表4 不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)表
2結(jié)果與分析
2.1預(yù)處理結(jié)果分析
2.1.1次氯酸鈉處理
設(shè)置6種不同時(shí)間的次氯酸鈉處理，考察其對黃麻種子發(fā)芽率和污染率的影響，結(jié)果表明(表5)，次氯酸鈉處理對不同黃麻品種的萌發(fā)率和污染率有極顯著影響。所有品種的黃麻種子發(fā)芽率整體上均隨處理時(shí)間增加而上升，處理20～30min時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到最大，而后隨著處理時(shí)間增加，發(fā)芽率開始下降；種子污染率則隨處理時(shí)間增加而下降。
綜合考慮污染率與發(fā)芽率，次氯酸鈉處理的最佳時(shí)間為：黃麻179和梅峰4號20min，廣巴矮和尤溪長果為30min。
表5 次氯酸鈉處理對黃麻發(fā)芽率與污染率的影響
注：不同大寫字母代表0.01顯著水平。下同。
2.1.2不同培養(yǎng)基處理
設(shè)計(jì)3種不同培養(yǎng)基，考察其對黃麻種子發(fā)芽率和污染率的影響，結(jié)果表明(表6)，不同培養(yǎng)基對黃麻品種的影響差異較大。在3種培養(yǎng)基上，梅峰4號和179的發(fā)芽率均在89%以上，污染率10%左右，差異不明顯。而長果種黃麻種子的發(fā)芽率和污染率卻差異顯著，2個(gè)長果種黃麻品種在MS(s－)培養(yǎng)基中的發(fā)芽率明顯高于其他兩種培養(yǎng)基，而污染率明顯低于其他兩種培養(yǎng)基。
綜上，圓果種黃麻可采用普通的MS培養(yǎng)基，而長果種黃麻則以MS(s－)培養(yǎng)基為佳。
表6 不同培養(yǎng)基對黃麻發(fā)芽的影響
2.2愈傷組織誘導(dǎo)
采用均勻設(shè)計(jì)法進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合試驗(yàn)，該方法通過少量組合，即可篩選出最優(yōu)解，并確定出回歸方程。結(jié)果表明，4種黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)率差異明顯(表7)。其中，在設(shè)定的激素組合中誘導(dǎo)，179的最高誘導(dǎo)率為90%，M4為70%，而長果種黃麻YC和GBA最高誘導(dǎo)率分別為45%和42%，其誘導(dǎo)效果為：179＞M4＞YC＞GBA。
(1)179：采用SPSS軟件對黃麻179的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以Y代表誘導(dǎo)率，X1代表TDZ，X2代表2，4－D，X3代表6－BA，X4代表NA，X5代表VC，得到回歸方程：Y=0.71+0.39X12－0.77X1X2－0.17X1X3－0.02X1X4+0.28X22+0.2X2X3+α。說明4種激素對黃麻179愈傷組織的誘導(dǎo)率具有顯著影響，而VC則無顯著影響。
表7 不同激素組合對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果
上述回歸方程中的α為隨機(jī)誤差項(xiàng)，對回歸方程求解最大值，得到X1=0，X2=0.53，X3=2，X4=0。為驗(yàn)證該方程，將黃麻179莖段接種到MS+0.53mg/L 2，4－D+2.0mg/L 6－BA培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，接種15d后，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，由此得出該培養(yǎng)基激素組合即為黃麻179的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
(2)梅峰4號：方法同黃麻179。獲得最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L 2，4－D，最大誘導(dǎo)率為100%。
(3)尤溪長果：方法同黃麻179。獲得最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L TDZ+2.0mg/L 6－BA，最大誘導(dǎo)率為63%。
(4)廣巴矮：方法同黃麻179。獲得最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+2.0mg/L TDZ+2.0mg/L 2，4－D+2.0mg/L 6－BA，最大誘導(dǎo)率為52%。
從愈傷組織誘導(dǎo)率的結(jié)果分析，圓果種黃麻的誘導(dǎo)率顯著高于長果種黃麻。
圖1 不同黃麻品種的愈傷組織
2.3不同溫度處理
試驗(yàn)表明，培養(yǎng)溫度為27℃時(shí)，4個(gè)黃麻品種愈傷組織的初代和二代培養(yǎng)均可快速增殖，且褐化程度低，但從第三代培養(yǎng)開始，褐化率明顯提高。為此，設(shè)置不同溫度處理進(jìn)行第三代愈傷組織培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)其愈傷組織的增長量和未褐化比率。結(jié)果表明(圖2)，4種黃麻愈傷組織的增殖速度均隨溫度的升高而升高，但褐化率也隨之升高。不同溫度處理對愈傷組織褐化率具有顯著影響(表8)。溫度為21℃時(shí)，4種黃麻愈傷組織的增殖量都在0.1～0.5g，但褐化率小于等于30%。而溫度為27℃時(shí)，增殖量都在0.9g以上，但褐化率高達(dá)62%～70%。綜合愈傷組織的增殖量和褐化情況，確定黃麻的第三代愈傷組織在23℃培養(yǎng)。
圖2 不同溫度對黃麻愈傷組織的影響
表8 不同溫度對黃麻愈傷組織褐化率的影響
注：不同小寫字母代表0.05顯著水平。
2.4不定芽誘導(dǎo)
按照正交設(shè)計(jì)，配制了12組不定芽誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基，方差分析表明，基因型間、激素組合間均存在極顯著差異(表9)。從基因型差異分析，圓果種黃麻愈傷組織的不定芽誘導(dǎo)率明顯優(yōu)于長果種黃麻。其誘導(dǎo)效果排序?yàn)?/font>：179＞M4＞YC＞GBA。從激素組合差異分析，4個(gè)品種愈傷組織不定芽
誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(圖3)。在9號培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，每個(gè)品種均表現(xiàn)為最高的不定芽誘導(dǎo)率，黃麻179為35.0%，梅峰4號30%，尤溪長果22.6%，廣巴矮15%。
表9 黃麻愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率的方差分析
圖3 不同激素組合對黃麻不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果
從分化的表型分析，愈傷組織前期形成顆粒狀的生長點(diǎn)，中期繼續(xù)生長的同時(shí)，褐化嚴(yán)重，后期僅少數(shù)生長點(diǎn)能長出健康的不定芽(圖4)。而長果種黃麻廣巴矮誘導(dǎo)出的不定芽隨著愈傷組織褐化的加劇而全部死亡。
圖4 誘導(dǎo)的黃麻不定芽
2.5不定根誘導(dǎo)
按照正交設(shè)計(jì)，配制了16組不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，由于GBA的不定芽全部衰亡，因此，僅將分化出健康不定芽的3個(gè)黃麻品種接種到生根培養(yǎng)基上。方差分析表明，基因型間、激素組合間均存在顯著差異(表10)。從基因型差異分析，圓果種黃麻愈傷組織的不定根誘導(dǎo)率也明顯優(yōu)于長果種黃麻，其誘導(dǎo)效果排序?yàn)?/font>：179＞M4＞YC(圖5)。
表10 黃麻愈傷組織不定根誘導(dǎo)率的方差分析
圖5 不同激素組合對黃麻不定根的誘導(dǎo)結(jié)果
從激素組合差異分析，黃麻179在13號培養(yǎng)基上的不定根誘導(dǎo)率最高，為50.2%，梅峰4號和尤溪長果在14號培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率達(dá)到最大，分別為45.8%和25.4%(圖5)。
對不定根影響因子的分析表明，基因型和激素組合對黃麻不定芽的影響顯著(表10)。試驗(yàn)中表現(xiàn)為(圖6)：圓果種黃麻的不定根誘導(dǎo)容易，不定根數(shù)量多且長勢良好。而尤溪長果的不定根數(shù)量少，且多為主根，沒有須根，不定根的長勢較差，幼苗葉片逐漸脫落，死亡。
圖6 黃麻的不定根
2.6再生苗的生長情況
選取具有健康不定根和不定芽的愈傷組織，經(jīng)煉苗處理，轉(zhuǎn)入外界培養(yǎng)，圓果種黃麻179和梅峰4號黃麻長勢較好(圖7)。而長果種黃麻尤溪長果雖然誘導(dǎo)出不定根，但不定根數(shù)量較少，不定芽長勢極差，培養(yǎng)幾天后，不定芽葉片脫落死亡，無法再生植株。
圖7 再生的黃麻幼苗
3討論與結(jié)論
3.1基本培養(yǎng)基對黃麻種子發(fā)芽的影響
基本培養(yǎng)基對植物離體培養(yǎng)植株再生有顯著的影響，大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的愈傷組織的誘導(dǎo)和芽的分化一般都是采用MS培養(yǎng)基［10］。Saha等［8］研究發(fā)現(xiàn)，對圓果種黃麻而言，液體培養(yǎng)基更適合于其種子發(fā)芽，且黃麻幼苗長勢好、污染率低。本研究選用3種不同的基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)圓果種黃麻種子的萌發(fā)基本不受培養(yǎng)基差異的影響，但3種培養(yǎng)基對長果種黃麻的發(fā)芽率有顯著影響，其中不添加有機(jī)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基效果最好。這可能與長果種黃麻種子表面多“褶皺”，可能潛藏有較多的細(xì)菌和真菌有關(guān)。MS(s－)培養(yǎng)基由于不添加有機(jī)元素，不利于菌類的生長，可抑制其生長發(fā)育。
3.2激素對黃麻愈傷組織誘導(dǎo)和再生的影響
黃麻再生體系的研究多集中在外源激素對植株再生過程的調(diào)控作用。張高陽［6］研究表明，黃麻愈傷組織誘導(dǎo)需要植物激素TDZ、6－BA和IAA。Bharadwaj等［11］利用黃麻子葉在MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L BAP+36g/L蔗糖上成功誘導(dǎo)出不定芽。T.saha等［12］利用圓果種黃麻的子葉在MS+2.7mmol/L NAA+4.4mmol/L 6－BA上不僅誘導(dǎo)出不定芽，還成功誘導(dǎo)出不定根。本試驗(yàn)通過均勻設(shè)計(jì)選用不同的TDZ、6－BA、2，4－D和NAA激素組合，發(fā)現(xiàn)不同的激素組合對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)差異顯著。長果種黃麻的不定芽和不定根誘導(dǎo)效率較差，說明植物組織再生的不同階段對外源激素的敏感程度不同。這可能與不同激素的種類和濃度會(huì)引起植物細(xì)胞在不同發(fā)育階段做出不同的反應(yīng)有關(guān)。
3.3基因型的影響
基因型對作物組培效率的影響已經(jīng)得到廣泛證明。秦先超等［13］研究表明，福紅992的不定芽誘導(dǎo)率最高，福紅952最差。Saha等［8，12］在研究不同基因型的黃麻組織再生過程中，也發(fā)現(xiàn)了基因型差異導(dǎo)致的再生效率不同。苧麻研究中，基因型是苧麻外植體誘導(dǎo)愈傷組織和再生植株的決定因素，相同條件下綠芽誘導(dǎo)率湘苧6號＞湘苧2號＞蘆竹青＞湘苧3號＞C5［14］。相同培養(yǎng)條件下，黃殼早、湘苧2號、巴西麻6號基因型適應(yīng)性強(qiáng)，華苧1號適應(yīng)性差［15］。Ｒaoul等［16］對兩種基因型玫瑰茄的愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)表明，兩種基因型的差異明顯。本研究的結(jié)果也表明，圓果種黃麻的誘導(dǎo)、分化及植株再生能力均高于長果種黃麻，尤其是在不定芽和不定根的分化及再生植株方面，長果種黃麻的高效再生體系還有待進(jìn)一步的探索和完善。王曉玲等［15］認(rèn)為基因型能控制外植體的狀態(tài)，決定苧麻是否脫分化和愈傷組織增殖的狀態(tài)，而基因型差異造成的黃麻誘導(dǎo)和分化能力差異的原因尚未明確。
3.4后續(xù)研究建議
本研究以4個(gè)黃麻品種為研究材料，研究了以黃麻幼莖為外植體構(gòu)建的組培再生體系。構(gòu)建的黃麻再生體系為今后的黃麻遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。但是，由于研究中的長果種黃麻再生體系還不完善，只選用了尤溪長果和廣巴矮兩個(gè)品種，沒有嘗試更多的基因型和激素組合，需在此基礎(chǔ)上做進(jìn)一步研究。
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文章摘自：方平平,王建勇,祁建民,陶愛芬,徐建堂,張立武.黃麻組培再生體系的研究[J].中國麻業(yè)科學(xué),2022,44(03)：133-142.
