摘 要：本發(fā)明公開了一種紅麻干旱響應(yīng)基因EST SSR引物及試劑盒。所述引物共有11對(duì)，其中的一對(duì)或者多對(duì)作為EST SSR多態(tài)性標(biāo)記用于鑒定紅麻親緣關(guān)系、遺傳多樣性或者抗旱相關(guān)基因特定外顯子區(qū)簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性差異。本發(fā)明為紅麻分子標(biāo)記輔助育種提供良好的標(biāo)記儲(chǔ)備，也為在紅麻自然變異中篩選關(guān)鍵基因的功能等位變異提供一種檢測(cè)的候選分子標(biāo)記。
權(quán)力要求書
1.一種紅麻干旱響應(yīng)基因EST-SSR引物組，其特征在于，所述引物組由11對(duì)引物組成，具體如下：
第1對(duì)引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2所示；
第3對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
第4對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
第5對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
第6對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
第7對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
第8對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示；
第9對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
第10對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO：19所示；
第11對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。
2.一種鑒定紅麻親緣關(guān)系、遺傳多樣性或者抗旱相關(guān)基因特定外顯子區(qū)簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性差異的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1中所述的引物組。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及EST-SSR標(biāo)記，具體而言，是紅麻干旱響應(yīng)基因EST-SSR引物及試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
紅麻（Hibiscus cannabinus L.）是錦葵科木槿屬的一年生重要的韌皮纖維作物,主要用于紡織，也用于制作紙漿、生物質(zhì)能源、建材等方面。因此，大力發(fā)展麻類作物尤其是紅麻是滿足人們對(duì)天然纖維不斷增加的需求量的重要途徑之一。紅麻生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，尤其是抗旱能力強(qiáng)，能在山坡丘陵地區(qū)種植，不與糧食爭(zhēng)地。隨著全球氣候惡性變化和水資源日益短缺，選育抗旱性較強(qiáng)的紅麻品種也顯得越來越重要。
EST-SSR標(biāo)記是對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag , EST)中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat , SSR)進(jìn)行開發(fā)的一種新型分子標(biāo)記，與其他的分子標(biāo)記相比，EST-SSR標(biāo)記具有高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定以及分子輔助育種工作中。此外，有目的性地針對(duì)某一類基因開發(fā)EST-SSR標(biāo)記，可以對(duì)種質(zhì)資源特定性狀相關(guān)的基因外顯子區(qū)功能性變異的多態(tài)性差異進(jìn)行分析，反映種質(zhì)資源在這些基因特定區(qū)段的差異，可更方便快捷地定位和克隆相關(guān)性狀功能基因。
目前，已相繼在黃瓜、小麥、水稻、花生、棉花等物種中開展了EST-SSR標(biāo)記研究。與這些物種相比，紅麻EST-SSR標(biāo)記開發(fā)滯后，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的紅麻核苷酸序列僅423條（截至2018年1月3日）。紅麻的分子標(biāo)記目前主要為隨機(jī)標(biāo)記，如RAPD、ISSR和SRAP等，有針對(duì)性的分子標(biāo)記開發(fā)較少，相對(duì)信息量較少且缺乏可以參考的基因組圖譜信息，嚴(yán)重限制了紅麻的遺傳改良。例如，鄭海燕等以來源于不同國(guó)家和地區(qū)的51份紅麻野生種、近緣種和栽培種為材料,利用ISSR和RAPD標(biāo)記構(gòu)建紅麻種質(zhì)資源分子身份證；劉倩等以來源于不同國(guó)家和地區(qū)的127份紅麻栽培種、野生種和近緣種為材料，利用SRAP標(biāo)記構(gòu)建紅麻種質(zhì)資源分子身份證；徐偉等利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)紅麻12個(gè)野生種、7個(gè)常規(guī)栽培種和5個(gè)近緣種進(jìn)行了親緣關(guān)系研究；萬(wàn)雪貝等開發(fā)的85個(gè)轉(zhuǎn)錄因子EST-SSR標(biāo)記在至少2個(gè)紅麻材料之間存在多態(tài)性。而分子標(biāo)記的數(shù)量和質(zhì)量影響著種質(zhì)源遺傳多樣性分析的準(zhǔn)確性，現(xiàn)有的紅麻SSR分子標(biāo)記遠(yuǎn)不能滿足需求。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種紅麻干旱響應(yīng)基因EST-SSR引物及試劑盒。
一種紅麻干旱響應(yīng)基因EST-SSR引物，所述引物共有11對(duì)，其中的一對(duì)或者多對(duì)作為EST-SSR多態(tài)性標(biāo)記用于鑒定紅麻親緣關(guān)系、遺傳多樣性或者抗旱相關(guān)基因特定外顯子區(qū)簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性差異；所述引物，分別為 ：
第1對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2所示；
第3對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
第4對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
第5對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
第6對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
第7對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
第8對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示；
第9對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
第10對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO：19所示；
第11對(duì)引物，其序列如 SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。
一種鑒定紅麻親緣關(guān)系、遺傳多樣性或者抗旱相關(guān)基因特定外顯子區(qū)簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性差異的試劑盒，所述的引物中的一對(duì)或者多對(duì)。列多態(tài)性差異的試劑盒，所述的引物中的一對(duì)或者多對(duì)。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明的11個(gè)EST-SSR標(biāo)記是標(biāo)記了紅麻響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵基因外顯子區(qū)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性，并且在遺傳變異來源廣泛的紅麻品種中具有多態(tài)性，可以區(qū)分44個(gè)紅麻品種。通過5個(gè)品種的初步篩選和44個(gè)品種的驗(yàn)證，這11個(gè)多態(tài)性標(biāo)記可穩(wěn)定檢測(cè)，可以直接將本發(fā)明所開發(fā)的標(biāo)記應(yīng)用于更多紅麻品種的檢測(cè)，進(jìn)行種質(zhì)資源分子遺傳多樣性評(píng)價(jià)、親緣關(guān)系鑒定和關(guān)鍵抗旱基因的特定外顯子區(qū)簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性分析，為紅麻分子標(biāo)記輔助育種提供良好的標(biāo)記儲(chǔ)備，也為在紅麻自然變異中篩選關(guān)鍵基因的功能等位變異提供一種檢測(cè)的候選分子標(biāo)記。
附圖說明
圖1是紅麻響應(yīng)干旱脅迫代謝途徑關(guān)鍵基因EST-SSR標(biāo)記開發(fā)流程圖；
圖2是本發(fā)明的部分紅麻EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增44個(gè)紅麻品種的擴(kuò)增效果圖；
圖3是基于11個(gè)標(biāo)記基因型的44個(gè)紅麻品種非加權(quán)類平均(UPGMA)聚類分析圖。
具體實(shí)施方式
紅麻響應(yīng)干旱脅迫代謝途徑關(guān)鍵基因的EST-SSR標(biāo)記，是對(duì)紅麻干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、響應(yīng)干旱脅迫代謝途徑富集分析、EST-SSR標(biāo)記開發(fā)、DNA提取、SSR引物篩選及品種鑒定等過程得到的（圖1）。
本發(fā)明中，用紅麻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)得到干旱脅迫關(guān)鍵基因開發(fā)紅麻EST-SSR引物的具體做法是：
一、紅麻干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
利用RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen生物技術(shù)，中國(guó))從對(duì)照組(正常澆水6天)、干旱處理組(抑制澆水6天)、復(fù)水處理組（抑制澆水5天后復(fù)水1天）的紅麻葉片中提取總RNA，3次重復(fù)。然后通過凝膠電泳和NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)）來檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量、濃度和完整性。從六個(gè)樣本中分別提取20 ug RNA做cDNA文庫(kù)構(gòu)建。六個(gè)樣品的RNA完整度分別是為6.7、7.5、6.5、7.4、6.9和7.5。在Illumina HiSeq4000基因組分析儀中進(jìn)行測(cè)序。
二、SSR標(biāo)記開發(fā)
通過紅麻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到差異表達(dá)基因的KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書)通路顯著性富集分析，確定差異表達(dá)基因，及其參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。干旱處理組與對(duì)照組比較，富集顯著的通路是光合通路（Photosynthesis）（表1）；復(fù)水處理組與對(duì)照組比較，富集顯著的通路是淀粉和蔗糖代謝通路（Starch and sucrose metabolism）（表1）；復(fù)水處理組與干旱處理組比較，富集顯著的通路是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Plant hormone signal transduction）（表1）。很顯然，這一結(jié)果表明：對(duì)干旱脅迫信號(hào)響應(yīng)最靈敏的是光合通路，受到干旱脅迫之后，最難恢復(fù)正常水平的是淀粉和蔗糖代謝通路，而明顯受到干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這三個(gè)通路中的差異表達(dá)基因中，干旱處理組與對(duì)照組比較表達(dá)上調(diào)的unigene（Unique Gene，拼接基因）（表1）、復(fù)水處理組與干旱處理組比較表達(dá)下調(diào)的unigene（表1）、復(fù)水處理組與對(duì)照組比較表達(dá)上調(diào)的unigene（表1），利用MISA(1.0版)含有SSR的重復(fù)基元，選擇SSR位點(diǎn)的重復(fù)基元為以單核苷酸為重復(fù)單位時(shí)，其重復(fù)次數(shù)≥10，二核苷酸重復(fù)次數(shù)≥6次，三、四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次進(jìn)行SSR檢測(cè)。SSR序列用軟件Primer3.0（2.3.5版）進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)。
三、品種DNA提取
利用改良CTAB方法提取44個(gè)紅麻品種（表2）基因組DNA，具體步驟如下：
(1)配置DNA提取緩沖液：4% CTAB , 100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0）,20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl、2% β-巰基乙醇和10 mg/ml的RNAase酶。
(2)對(duì)上述紅麻品種進(jìn)行如下處理：
A、稱取紅麻葉片約0.5g，在液氮中迅速冷卻后，將其研磨至粉末，隨后將粉末樣品轉(zhuǎn)入2ml干燥無(wú)菌離心管中，加入850ul 65℃預(yù)熱的CTAB提取液后，輕柔緩慢顛倒混勻約2min，放入65℃水浴鍋中裂解30-45min，期間每隔5min左右輕輕顛倒混勻；加入等體積850ml氯仿：異戊醇（24:1）顛倒混勻3min，4℃10000rpm條件下離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌離心管中，加入850ml等體積的氯仿：異戊醇（24:1）顛倒混勻約3min，4℃10000rpm條件下離心10min。
B、吸取上述步驟A所得的上清液轉(zhuǎn)入2ml新的無(wú)菌離心管中，分別加入1/3體系的2.5mol/L的NaAc及等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕柔顛倒混勻至DNA絮狀沉淀出現(xiàn)，然后冰上靜置30min；16℃ 2000rpm條件下離心10min，棄上清液。
C、將上述步驟B所得DNA沉淀轉(zhuǎn)入1.5ml新的無(wú)菌離心管中，用1ml的75%無(wú)水乙醇漂洗2min，室溫條件下10000rpm離心2min，棄上清液，重復(fù)洗一次。
D、將上述步驟C洗滌后的DNA室溫下風(fēng)干4小時(shí)，加入37℃條件下預(yù)熱的100ulTE溶解風(fēng)干后的DNA，加入1ul的RNAase（10mg/ml），37℃水浴1小時(shí)。
E、然后通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)）來檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量、完整性和濃度。
四、EST-SSR標(biāo)記引物篩選
以步驟三提取的待測(cè)樣品中，選擇來源廣泛、表型差異大的5個(gè)紅麻品種（來源于危地馬拉的HC8、來源于日本的HC19、來源于美國(guó)的HC20、來源于泰國(guó)的HC36和來源于中國(guó)長(zhǎng)沙的HC62）(表2)基因組DNA為模板進(jìn)行步驟二所得的64對(duì)EST-SSR標(biāo)記引物的篩選。PCR 體系采用20μl反應(yīng)體系：10×含rTaq的Mix 10μl，Sense Primer 1μl，Anti-sense Primer 1μl，基因組DNA 1μl，ddH2O 7μl。在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性3分鐘，94℃ 30秒，56℃ 15秒，72℃ 30秒，返回第二步，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72℃ 5分鐘，然后4℃保存。PCR產(chǎn)物在6%的PAGE膠上進(jìn)行電泳，電泳完成后經(jīng)過漂洗，染色和顯色，在背光燈下進(jìn)行讀帶記錄和拍照。64個(gè)EST-SSR標(biāo)記在5個(gè)品種中有12個(gè)標(biāo)記可以擴(kuò)增得到多態(tài)性片段（部分引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示）。
五、遺傳多樣性分析
根據(jù)步驟四分析結(jié)果，得到了12對(duì)多態(tài)性標(biāo)記引物，然后將這12個(gè)標(biāo)記在44個(gè)紅麻品種(表2)中進(jìn)行上述步驟四中相同條件的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以步驟四相同方法電泳，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增得到的條帶。出乎我們的預(yù)料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12對(duì)多態(tài)性標(biāo)記引物只有11個(gè)標(biāo)記穩(wěn)定地重復(fù)出了多態(tài)性擴(kuò)增片段（部分引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示）。對(duì)這11個(gè)得到驗(yàn)證的EST- SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，11個(gè)EST-SSR標(biāo)記，總計(jì)得到了19個(gè)等位基因。平均每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)主要等位基因頻率（MAF）平均為0.747，分布在0.5208-0.9792之間；每位點(diǎn)基因型數(shù)目平均為2.7273，分布在2-5之間；每位點(diǎn)等位基因數(shù)目平均為2.3636，分布在2-4之間；基因多樣性平均為0.3388，分布在0.0408-0.5182之間；多態(tài)性信息含量（PIC）平均為0.2767，分布在0.0400-0.4038之間。
六、品種鑒定
根據(jù)群體驗(yàn)證的11個(gè)多態(tài)性標(biāo)記的基因型計(jì)算44個(gè)品種(表2)兩兩間的遺傳相似系數(shù)，兩兩間遺傳相似系數(shù)平均為0.5650，HC16與HC19遺傳相似系數(shù)最小，為0.1765；HC31與HC32、HC47與HC62遺傳相似系數(shù)最大，為0.9167。顯然，這一結(jié)果表明：這11個(gè)標(biāo)記可以較好的區(qū)分開這44個(gè)品種，可以將除HC16和HC19之外的其他42個(gè)品種聚類為明顯的兩大類（圖3）。這說明，這11個(gè)標(biāo)記在對(duì)品種鑒定區(qū)分上也有非常高的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明提供11個(gè)紅麻EST-SSR標(biāo)記，11個(gè)EST-SSR標(biāo)記的特征如表3所示：
最后，還需要注意的是，以上所述僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例而已，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有各種改動(dòng)和變形。
摘自國(guó)家發(fā)明專利，發(fā)明人：安霞，金關(guān)榮，王斌，吳文嬙，駱霞虹，陳常理，李文略，李蘋芳，朱關(guān)林，申請(qǐng)?zhí)枺?/font>201810056728.4，申請(qǐng)日：2018.01.21
