摘 要：以甘肅省甘南藏族自治州的蕨麻作為本實(shí)驗(yàn)的研究材料，用超聲波清洗機(jī)輔助提取蕨麻的總黃酮，探究了超聲時(shí)間、功率級(jí)別、溶劑乙醇濃度、超聲溫度以及料液比5個(gè)單因素對(duì)總黃酮提取率的影響，并采用響應(yīng)面法對(duì)蕨麻總黃酮提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化.試驗(yàn)結(jié)果表明，甘南蕨麻總黃酮最佳提取工藝條件為：料液比1∶30，提取時(shí)間30min，50%乙醇濃度，32℃提取溫度，2級(jí)功率，在此條件下，蕨麻總黃酮的提取量最高，為4.217mg/g.
關(guān)鍵詞：蕨麻；總黃酮；提取率；單因素；響應(yīng)面
0 引言
蕨麻(Potentilla anserina L.)，學(xué)名鵝絨委陵菜，薔薇科，主要分布于我國(guó)西藏、青海、甘肅和四川等地.蕨麻富含人類(lèi)必需的18種氨基酸以及多糖、維生素等[1-2].此外，蕨麻具有健脾胃、益氣補(bǔ)血和止咳止血的作用，故用于治療腹瀉、嘔血、肝炎和脾胃虛弱等疾病[3].如今，隨著“綠色食品”成為主流發(fā)展趨勢(shì)，蕨麻作為一種藥食兩用的植物，市場(chǎng)需求量大幅度增加，經(jīng)濟(jì)價(jià)值持續(xù)上漲，然而由于缺乏對(duì)蕨麻有效成分的研究和開(kāi)發(fā)，導(dǎo)致蕨麻大部分仍以原材料的形式發(fā)揮作用.近年來(lái)隨著蕨麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視蕨麻有效成分的研究，除發(fā)現(xiàn)多糖、三萜等有效成分外[4]，研究表明蕨麻還含有生物類(lèi)黃酮[5]，黃酮具有抗腫瘤和抗炎鎮(zhèn)痛活性，還具有降血壓、膽固醇以及抗老化等作用[6].
本試驗(yàn)以黃酮提取率作為指標(biāo)，利用單因素法和響應(yīng)面法對(duì)甘肅地區(qū)蕨麻黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的提取條件，使黃酮提取率達(dá)到最佳，在減少損耗的基礎(chǔ)上提高蕨麻的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為蕨麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論支撐.
1 材料與方法
1.1 材料
蕨麻，甘肅甘南藏族自治州的野生蕨麻，購(gòu)于綿陽(yáng)市高新區(qū)永興鎮(zhèn)康貝大藥房.
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[7]
20mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-84082)于50%乙醇溶解并定容到100mL，搖勻，準(zhǔn)確吸取定容后的溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，并分別置于25mL的比色管中，各加入1mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置5min；各加入1mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置5min；加入10mL的4%氫氧化鈉溶液，最后加入50%的乙醇至刻度，搖勻，靜置15min；分別在紫外分光光度計(jì)510nm處測(cè)吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線.提取率按照下面公式計(jì)算，總黃酮的提取率(%)=
式中，C：測(cè)定樣品溶液的濃度(mg·mL-1)；V：樣品溶液定容后的體積(mL)；W：樣品重量(g)；F：測(cè)定時(shí)溶液的稀釋倍數(shù).
1.2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響
稱(chēng)取5份0.1000g蕨麻粉于5只25mL的比色管中，分別加入3mL60%乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中，分別超聲10、20、30、40、50min，溫度設(shè)置為50℃，提取功率級(jí)別為3級(jí)，超聲完成后，考察不同超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響.
1.2.3 超聲功率級(jí)別對(duì)提取率的影響
稱(chēng)取5份0.1000g樣品于5只10mL比色管中，分別加入3mL60%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20min，提取溫度50℃，超聲功率級(jí)別為1、2、3、4、5級(jí)，考察不同超聲功率對(duì)提取率的影響.
1.2.4 超聲溫度對(duì)提取率的影響
稱(chēng)取5份0.1000g樣品于5只10mL比色管中，分別加入3mL60%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20min，提取溫度30、40、50、60、70℃，超聲功率級(jí)別為4級(jí)，考察不同溫度對(duì)提取率的影響.
1.2.5 料液比對(duì)提取率的影響
稱(chēng)取5份0.1000g樣品于5只10mL比色管中，在5只試管中分別加入1、2、3、4、5mL60%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20min，超聲溫度50℃，功率級(jí)別為4級(jí)，考察不同料液比對(duì)提取率的影響.
1.2.6 乙醇濃度對(duì)提取率的影響
稱(chēng)取5份0.1000g樣品于5只10mL比色管中，分別加入3mL30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20min，提取溫度50℃，功率級(jí)別設(shè)置為4級(jí)，超聲完成后，考察不同乙醇濃度對(duì)提取率的影響.
1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用三因素三水平BOX-Behnken design(BBD)實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)優(yōu)化蕨麻總黃酮提取率的自變量(乙醇濃度、超聲溫度和功率級(jí)數(shù))，自變量的水平以及BOX-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示.
表1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)條件水平
1.2.8 數(shù)據(jù)處理
采用Microsoft Excel2016和Design-Expert10.0.4軟件數(shù)據(jù)處理并分析.
2 結(jié)果與分析
2.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線
蘆丁在0.008～0.048mg/mL的濃度范圍內(nèi)的線性方程為：y=20.025x+0.0205(R2=0.9994)，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其中橫坐標(biāo)為蘆丁含量，縱坐標(biāo)為蘆丁在510nm處的吸光度.表明在此范圍內(nèi)，蘆丁濃度與其吸光度之間呈良好的線性關(guān)系.
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響
根據(jù)1.2.2的方法，分析超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：在50℃下，提取劑為50%濃度乙醇，料液比為1：30，功率級(jí)別為4級(jí).結(jié)果如圖2所示，總黃酮提取率隨著提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先緩慢增加，達(dá)到最高值后呈下降趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為30min時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到峰值，為2.81%.
圖2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響
2.2.2 超聲功率級(jí)別對(duì)提取率的影響
根據(jù)1.2.3的方法，分析功率級(jí)別對(duì)總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：料液比為1∶30，提取溫度50℃，乙醇濃度50%，提取20min.結(jié)果如圖3所示，在1～5的功率級(jí)別范圍內(nèi)，總黃酮提取率先增加后降低，當(dāng)功率級(jí)別為2級(jí)(100～150W)范圍內(nèi)時(shí)，總黃酮提取率最高，為3.70%.
圖3 功率級(jí)別對(duì)總黃酮提取率的影響
2.2.3 超聲溫度對(duì)提取率的影響
根據(jù)1.2.4的方法，分析提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：料液比為1∶30，功率級(jí)別為4級(jí)，提取時(shí)間20min，乙醇濃度50%.結(jié)果如圖4所示，隨著提取溫度增加，總黃酮提取率先緩慢增加達(dá)到峰值后迅速降低，當(dāng)提取溫度在40℃時(shí)，總黃酮提取率最高，為4.18%.通過(guò)比較賈曉東等[8]的研究方法和結(jié)果，分析出現(xiàn)以上情況可能是由于溫度升高分子運(yùn)動(dòng)加速，黃酮提取率增大，但溫度繼續(xù)升高部分黃酮成分受到高溫破壞，使得提取率降低.
圖4 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響
2.2.4 料液比對(duì)提取率的影響
根據(jù)1.2.5的方法，分析料液比對(duì)總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：超聲時(shí)間為20min，超聲的溫度為50℃，功率級(jí)別為4級(jí)，用50%的乙醇為提取劑.結(jié)果如圖5所示，總黃酮提取率隨著料液比的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，總黃酮提取率最高，為2.89%.李桂娟等[9]采用超聲輔助提取黃酮的操作結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致，分析原因可能是隨著料液比的增加，雜質(zhì)也會(huì)隨著增加，導(dǎo)致溶解在體系中的黃酮比例下降.
圖5 料液比對(duì)提取率的影響
2.2.5 乙醇濃度對(duì)提取率的影響
根據(jù)1.2.6的方法，分析乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：料液比為1∶30，提取溫度50℃，功率級(jí)別4級(jí)，提取時(shí)間20min.結(jié)果如圖6所示，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率先增加后降低最后趨于平穩(wěn)，當(dāng)乙醇濃度為50％時(shí)，總黃酮提取率最高，為3.04%.康坤等[10]對(duì)總黃酮提取工藝優(yōu)化時(shí)，研究乙醇濃度對(duì)提取率的影響方法與試驗(yàn)結(jié)果一致，分析原因可能是較高濃度的乙醇導(dǎo)致非黃酮類(lèi)的一些脂溶性物質(zhì)溶出，造成體系中黃酮含量下降.
圖6 乙醇濃度對(duì)蕨麻總黃酮提取率的影響
2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 響應(yīng)面模型的建立與顯著性檢驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面對(duì)甘南蕨麻超聲提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，分別選取乙醇濃度、提取溫度和功率級(jí)別，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示.
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
表3 蕨麻黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析
利用軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到以黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸方程為：Y=4.15+0.15A+0.084B+0.14C-0.25AB-0.16AC+0.32BC-0.38A2-0.44B2-0.38C2(R2=0.9807，P<0.0001).由表3可知，回歸方程的P<0.0001，說(shuō)明該回歸方程模擬效果極顯著，失擬項(xiàng)P=0.0816>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，回歸方程模型擬合度高，試驗(yàn)誤差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾性較低.R2=0.9807，說(shuō)明響應(yīng)面的理論值和實(shí)際值呈現(xiàn)較為顯著的相關(guān)性.此外，模型A、B、C對(duì)黃酮提取率的影響顯著(P<0.05).通過(guò)F值大小可以看出，蕨麻提取的3個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響大小為：A乙醇濃度>C功率級(jí)別>B提取溫度，且AB、BC、AC交互作用P<0.05，說(shuō)明乙醇濃度、提取溫度和功率級(jí)別對(duì)總黃酮的提取率的交互影響較顯著.
2.3.2 響應(yīng)面曲面圖及分析
利用Design-Expert軟件繪制乙醇濃度、功率級(jí)別以及提取溫度3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)黃酮提取率的響應(yīng)面，結(jié)果如圖7所示.
根據(jù)響應(yīng)面坡度的陡峭程度以及等高線密集程度和形成橢圓形的程度表示兩因素之間交互作用影響大小的原則，由圖7可知，功率級(jí)別與提取溫度之間所形成的交互作用最強(qiáng)，而乙醇濃度和功率級(jí)別之間所形成的交互作用最弱，結(jié)合方差分析可知各因素交互作用大小為BC>AB>AC.
圖7 兩因素交互作用對(duì)黃酮提取率的影響
2.3.3 優(yōu)化及驗(yàn)證
通過(guò)軟件測(cè)定，模擬出最優(yōu)的提取條件為乙醇濃度50.911%，提取溫度為31.550℃，功率級(jí)別為2.233時(shí)，蕨麻總黃酮的提取能達(dá)到4.180%，但考慮具體情況，將優(yōu)化條件改為：乙醇濃度50%，提取溫度32℃，功率級(jí)別為2.在此條件下，做5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表4，最后得到平均值為4.217±0.342，與理論值4.180符合，因此該模型有效可靠.
表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3 結(jié)論
本研究以甘南蕨麻為材料，通過(guò)超聲輔助提取黃酮，結(jié)合單因素法與響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，從而得到黃酮提取的最佳條件.研究表明：黃酮提取優(yōu)化條件為提取時(shí)間30min，料液比為1∶30，超聲時(shí)的溫度32℃，功率級(jí)別2，提取劑為50%乙醇，在此條件下，總黃酮提取率達(dá)到4.217%；提取條件對(duì)黃酮提取率影響的大小順序?yàn)椋汗β始?jí)數(shù)>乙醇濃度>提取溫度；以黃酮提取率為目標(biāo)函數(shù)的模型為：Y=4.15+0.15A+0.084B+0.14C-0.25AB-0.16AC+0.32BC-0.38A2-0.44B2-0.38C2(R2=0.9807，P<0.0001).
蕨麻作為一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其應(yīng)用廣泛、前景廣闊，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻中富含的蕨麻素具有抑制乙肝病毒復(fù)制、保肝降酶等作用[11].但目前針對(duì)蕨麻的研究大部分仍停留于初步研究或宏觀水平的分析上[12]，其有效成分、活性成分以及藥用機(jī)理等亟待進(jìn)一步研究.要完善蕨麻在理論方面的研究缺陷，為蕨麻發(fā)展提供可靠準(zhǔn)確的理論支撐，就要從不同角度對(duì)蕨麻進(jìn)行全面系統(tǒng)的科學(xué)研究，這樣才能更好的發(fā)揚(yáng)我國(guó)的中醫(yī)藥文化，才能更加科學(xué)合理的利用蕨麻，有效的推動(dòng)蕨麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.
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