摘 要：目的 本研究主要通過對羅布麻葉配方顆粒有效成分進行鑒別及測定，建立羅布麻葉配方顆粒質(zhì)量標準。方法 薄層色譜法（TLC）條件：以甲醇和水飽和正丁醇為提取溶劑，三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶2.5∶0.1∶0.2)下層溶液為展開劑，3%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，紫外燈(365nm)下檢視；高效液相色譜法(HPLC)條件：Kromasil 100-5-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，流動相為乙腈-0.2%磷酸(15∶85)，檢測波長256nm，進樣量10μL，柱溫30℃，流速1.0mL/min。結(jié)果 對3批樣品進行鑒別及測定，薄層色譜斑點清晰；液相色譜方法可靠，可用于羅布麻葉配方顆粒中金絲桃苷的含量測定。結(jié)論 該方法準確可靠，可為羅布麻葉配方顆粒質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。
關鍵詞：羅布麻葉；金絲桃苷；質(zhì)量控制
羅布麻葉配方顆粒是夾竹桃科植物羅布麻Apocynu venetum L.的干燥葉經(jīng)炮制加工后制成的配方顆粒[1]。根據(jù)多批次樣品的實際性狀描述，本品為棕黃色的顆粒，氣微，味苦、澀。羅布麻作為一味名貴的中草藥，全草可入藥，其被李時珍寫入《本草綱目》[2]以前，就有對羅布麻的記載，例如三國時期陶弘景所著的《名醫(yī)別錄》[3]也有記載羅布麻的根可以入藥；《救荒本草》[4]等記載羅布麻葉具有平心悸、止眩暈的作用?，F(xiàn)代藥理研究[5-8]證明，羅布麻葉的臨床效果較好，在降血壓、降血脂、保肝、抗抑郁等方面具有十分明顯的功效。中藥配方顆粒，是指以單味中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、精制而成的一種顆粒狀制劑[9]。由于中藥配方顆粒具有便攜性及易服用性，因此成為近年來的研究熱點，但是其在質(zhì)量方面仍存在無統(tǒng)一標準的問題，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。本研究為了增加配方顆粒工藝的穩(wěn)定性以及質(zhì)量的可控性，對羅布麻葉配方顆粒進行質(zhì)量控制研究，同時為中藥配方顆粒質(zhì)量研究提供科學依據(jù)。
1 材料與設備
1.1 材料
羅布麻葉配方顆粒，批號：1907013、1908013、1908023，規(guī)格：3g/袋（相當于飲片量10g），濟川藥業(yè)集團有限公司。羅布麻葉對照藥材，批號：120979-201505，規(guī)格：2g/支，中國食品藥品檢定研究院。金絲桃苷，批號：111521-201809，規(guī)格：20mg/支，純度：94.9%，中國食品藥品檢定研究院。槲皮素，批號：100081-201610，規(guī)格：100mg/支，純度：99.1%，中國食品藥品檢定研究院。山柰素，批號：110861-202013，規(guī)格：20mg/支，純度：93.2%，中國食品藥品檢定研究院。糊精，190211，安徽山河藥用輔料股份公司。乙醇、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲酸、磷酸、無水氯化鋁為分析純，上海國藥集團。甲醇、乙腈為色譜純，德國默克公司。
1.2 儀器設備
硅膠G薄層板，青島海浪硅膠干燥劑有限公司；XSE 205DU電子天平，梅特勒-托利多（常州）稱重設備系統(tǒng)有限公司；SY8200T超聲波清洗器，上海聲源有限公司；Goodlook-2000薄層成像儀，大昌華嘉商業(yè)（中國）有限公司；KW-1000DC水浴鍋，江蘇中大有限公司；SHIMADZU LC20AD高效液相色譜儀，日本島津公司。
2 方法
2.1 薄層鑒別
2.1.1 鑒別方法
參考《中華人民共和國藥典》2020年版第一部中羅布麻葉飲片的薄層鑒別方法并進行優(yōu)化，該方法分別以羅布麻葉對照藥材和槲皮素對照品、山柰素對照品作為對照品。
精密稱取羅布麻葉配方顆粒0.3g，置于錐形瓶中，加甲醇溶液20mL，超聲處理25min（功率200W，頻率58kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加水20mL使溶解，用水飽和正丁醇20mL振搖提取，分取正丁醇溶液，置水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。取羅布麻葉對照藥材1g，同供試品溶液制備方法處理對照藥材，作為羅布麻葉對照藥材溶液。取槲皮素對照品、山柰素對照品適量，加乙醇制成每lmL各含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。
吸取2μL槲皮素對照品、2μL山柰素對照品溶液、5μL羅布麻葉對照藥材溶液、3μL供試品溶液，依次點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶2.5∶0.1∶0.2），顯色劑為3%三氯化鋁乙醇溶液，展開晾干噴顯色劑后放置于105℃烘箱中加熱2min，斑點顯色清晰后取出，置紫外燈（365nm）下檢視。
2.1.2 專屬性試驗
精密稱取糊精0.015g，置于錐形瓶中，按羅布麻葉供試品處理方法制得陰性樣品。分別取槲皮素和山柰素對照品溶液各2μL、羅布麻葉對照藥材溶液5μL、供試品和陰性樣品溶液各3μL，按優(yōu)化后的薄層鑒別方法進行操作。
2.1.3 樣品鑒別
精密稱取3批羅布麻葉配方顆粒0.3g，分別置于錐形瓶中，按優(yōu)化后的薄層鑒別方法進行操作。
2.2 含量測定
2.2.1 色譜條件
島津20AD高效液相色譜儀，Kromasil100-5-C18（250mm×4.60mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸（15∶85）為流動相，檢測波長為256nm，進樣量為10μL，柱溫30℃，流速1.0mL/min。
2.2.2 供試品溶液制備
取本品約0.2g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理30min，放冷，用50%甲醇定容，搖勻，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.2.3 專屬性試驗
取糊精0.015g，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液，分別精密吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀。
2.2.4 線性關系試驗
精密稱取金絲桃苷對照品，置20mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，濃度720μg/mL，作為母液。分別精密量取母液5份，置于容量瓶中，加甲醇稀釋100、50、20、10、5倍，搖勻，配制成濃度依次遞增的對照品溶液。分別精密吸取上述5種濃度的對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀。
2.2.5 進樣精密度試驗
精密吸取同一金絲桃苷對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次。
2.2.6 重復性試驗
取同一批樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法平行處理6份，精密吸取各10μL，注入高效液相色譜儀。
2.2.7 穩(wěn)定性試驗
取同一金絲桃苷對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、18、24h進樣，測定金絲桃苷峰面積的RSD值；取同一羅布麻葉配方顆粒供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24h精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀，測定金絲桃苷峰面積的RSD值。
2.2.8 加樣回收試驗
精密稱取金絲桃苷對照品15mg，置20mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得對照品溶液。取羅布麻葉配方顆粒約0.1g，共6份，精密稱定，置于50mL容量瓶中，分別精密加入上述金絲桃苷對照品溶液1mL，再加入適量50%甲醇，超聲處理（功率200W，頻率58kHz）30min，放冷，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，制得6份供試品溶液，精密吸取各10μL，注入高效液相色譜儀。
2.2.9 中間精密度試驗
取同一批羅布麻葉配方顆粒，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法處理樣品，由不同的操作人員、不同時間、在不同儀器上，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。2.2.10樣品測定取3批不同批次的羅布麻葉配方顆粒，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法處理樣品，按上述含量測定方法學的結(jié)果進行金絲桃苷含量的測定。
3 結(jié)果與討論
3.1 薄層鑒別結(jié)果
3.1.1 薄層鑒別方法優(yōu)化
使用《中華人民共和國藥典》2020年版一部中羅布麻葉飲片的薄層鑒別方法來鑒別羅布麻葉配方顆粒，雖能有效鑒別出與羅布麻葉對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品相應位置的熒光斑點，但該種方法供試品處理過程繁瑣，所用試劑多為乙醚、乙酸乙酯等有毒試劑，故本試驗以操作簡便和無毒環(huán)保為前提，參考了謝思敏等[10]的鑒別方法對羅布麻葉薄層鑒別的處理方法進行優(yōu)化，選擇合適的展開劑，并將羅布麻葉對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品、供試品點于同一硅膠板上進行顯色。供試品色譜與對照藥材和2個對照品色譜相應位置，有相同顏色的熒光斑點出現(xiàn)（見圖1）。且為了排除糊精對羅布麻葉配方顆粒薄層鑒別干擾的可能性，進行了專屬性試驗，未發(fā)現(xiàn)糊精在與對照藥材和2個對照品色譜相應位置有相同顏色的熒光斑點（見圖2），排除了糊精對本品薄層鑒別的干擾。
3.1.2 樣品檢測
使用上述優(yōu)化方法對3批羅布麻葉配方顆粒進行薄層鑒別，3批供試品與對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品在相應的位置均有相同顏色的熒光斑點出現(xiàn)（見圖3）。所以可將該薄層色譜方法列入羅布麻葉配方顆粒薄層色譜的質(zhì)量研究中。
3.2 含量測定結(jié)果
3.2.1 方法學
金絲桃苷是羅布麻葉配方顆粒的有效活性物質(zhì)之一，也是《中華人民共和國藥典》2020年版中羅布麻葉飲片的含量測定所要求的物質(zhì)，為考察輔料糊精是否會干擾金絲桃苷的含量測定，從原處方中去除羅布麻葉，按制劑工藝制備得陰性制劑，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。對比供試品以及陰性樣品色譜圖，結(jié)果顯示陰性樣品色譜圖在金絲桃苷相應的保留時間處無吸收峰，表明糊精對羅布麻葉配方顆粒含量測定無干擾，該方法專屬性較好。
線性關系試驗中，以進樣濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，所得回歸方程為Y=28965.5382X+10078.9254，R2=0.9999。以上表明，金絲桃苷在6.794～135.880μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。
進樣精密度試驗中，對照品峰面積RSD值為0.79%，表明該方法進樣精密度良好。
重復性試驗中，6份樣品含量測定結(jié)果的RSD值為0.64%，表明該方法重現(xiàn)性較好。
穩(wěn)定性試驗中，對照品峰面積RSD值為0.80%，供試品峰面積RSD為0.21%，表明對照品溶液以及供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
加樣回收試驗中，平均加樣回收率為95.44%，RSD值為1.40%，說明該方法準確度較好。
中間精密度試驗中，中間精密度RSD值為1.40%，表明該方法中間精密度良好。
以上含量測定方法學試驗表明，羅布麻葉配方顆粒中金絲桃苷的含量測定方法的專屬性強，進樣精密度、重復性、穩(wěn)定性等均符合規(guī)定，故此高效液相色譜條件可用于羅布麻葉配方顆粒中的金絲桃苷的含量測定。
3.2.2 樣品測定
取羅布麻葉配方顆粒（批號：1907013、1908013、1908023），按上述含量測定方法檢測，羅布麻葉配方顆粒的金絲桃苷的平均含量為7.13mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為64.74%。測定結(jié)果見表1。
3.3討論
薄層色譜鑒別試驗中，前期研究對供試品點樣量1μL、3μL、5μL進行了考察，發(fā)現(xiàn)點樣量過大易造成主要熒光斑點過大而聚集在一起，不易鑒別，點樣量過小易造成熒光斑點不清晰，而點樣量為3μL時，熒光斑點較為適宜，故最終選擇3μL的點樣量。
含量測定方法學試驗中，對超聲提取、加熱回流提取2種不同方式進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取方式效率高且易操作，故選擇超聲提??；考察了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和相同濃度的乙醇不同提取溶劑對含量測定的影響，結(jié)合《中華人民共和國藥典》2020年版中50%甲醇提取溶劑，仍采用50%甲醇作為提取溶劑；考察了25mL、50mL、70mL等提取溶劑量對含量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同提取溶劑量所測含量差異無顯著性，考慮到對照品與樣品峰面積不易過大且溶劑使用量最少的原則，選擇50mL作為最佳提取溶劑量；考察了15min、30min、45min3個不同提取時間對含量測定的影響，結(jié)果顯示超聲提取30min時所測金絲桃苷含量最大，故選擇超聲提取30min。
中藥配方顆粒作為中藥飲片的補充，質(zhì)量標準應充分考慮中藥配方顆粒與中藥飲片基本屬性的一致性[11]。本研究采用薄層色譜法對羅布麻葉配方顆粒進行鑒別，供試品與羅布麻葉對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。該方法較《中華人民共和國藥典》2020年版中薄層鑒別方法便于操作，且鑒別效果好，適用于生產(chǎn)實踐中。采用高效液相色譜法對金絲桃苷含量測定，方法學試驗結(jié)果均符合規(guī)定，并用此方法對3批羅布麻葉配方顆粒進行測定，金絲桃苷平均含量為7.13mg/g，轉(zhuǎn)移率平均值為64.74%?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版一部羅布麻葉飲片項下規(guī)定金絲桃苷的含量不得少于0.30%，按照轉(zhuǎn)移率按平均值±30%（即45.32%～84.16%）作為限度范圍，則羅布麻葉配方顆粒中含金絲桃苷的含量范圍為4.53～8.42mg/g（每袋3g，相當于飲片量10g），故暫定羅布麻葉配方顆粒的含量限度為：本品每1g含羅布麻葉以金絲桃苷（C21H20O12）計應為4.53～8.42mg/g。
4 結(jié)論
本試驗主要從薄層鑒別方法以及含量測定方法2個方面制定羅布麻葉質(zhì)量標準。薄層鑒別方法中，以甲醇及水飽和正丁醇為提取溶劑，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶2.5∶0.1∶0.2）為展開劑，以3%三氯化鋁乙醇為顯色劑，供試品與對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品在相應的位置均有相同顏色的熒光斑點出現(xiàn)；含量測定方法中，色譜條件為島津20AD高效液相色譜儀，Kromasil 100-5-C18（250mm×4.60mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸（15∶85）為流動相，檢測波長為256nm，進樣量為10μL，柱溫30℃，流速1.0mL/min。在此色譜條件下，測定的羅布麻葉配方顆粒的金絲桃苷平均含量為7.13mg/g，暫定羅布麻葉配方顆粒的含量限度為：本品每1g含羅布麻葉以金絲桃苷（C21H20O12）計應為4.53～8.42mg/g。
參考文獻
[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：211.
[2] 明·李時珍.本草綱目[M].金陵版點校本.陳貴廷，等，點校.北京：中醫(yī)古籍出版社，1994：363-365.
[3] 梁·陶弘景.名醫(yī)別錄[M].尚志鈞，輯校.北京：人民衛(wèi)生出版社， 1986.
[4] 朱橚.景印文淵閣四庫全書.救荒本草[M].影印本.臺北：臺灣商務印書館，1986：771.
[5] 李芝，王超云，張樹平，等.羅布麻葉總黃酮對高脂高鹽大鼠高血壓的影響及其分子機制[J].中草藥，2012，43（3）：540-545.
[6] 張素瓊，燕虹，李青山.羅布麻葉有效部位降血脂及抗動脈粥樣硬化的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5（9）：831-832.
[7] 于鳴蘭.羅布麻葉等中藥中化學成分的分離分析[D].聊城：聊城大學，2014.
[8] 鄭梅竹.羅布麻葉總黃酮抗抑郁作用及其機制研究[D].長春：吉林大學，2011.
[9] 王一戰(zhàn)，蘇芮，韓經(jīng)丹，等.中藥配方顆粒的發(fā)展現(xiàn)狀及思考[J].上海中醫(yī)藥雜志，2016，50（11）：10-13.
[10] 謝思敏，侯惠嬋，顧利紅，等.真?zhèn)瘟_布麻葉的薄層色譜鑒別研究[J]. 今日藥學，2019，29（5）：318-320，343.
[11] 何軍，朱旭江，楊平榮，等.中藥配方顆粒的現(xiàn)狀與發(fā)展新思路[J]. 中草藥，2018，49（20）：4717-4725.
文獻摘自：吳艷芳，秦海軍，俞周萍，于波，王靖婷，黃楊敏，沈治平，李超.羅布麻葉配方顆粒質(zhì)量控制研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2023，21(05)：147-150.
