摘 要：該文以苧麻 Boehmeria nivea（L.）Gaudich 為實驗材料，研究內(nèi)生細菌在鎘脅迫下對苧麻幼苗葉綠素、可溶性糖、蛋白質(zhì)、脯氨酸和谷胱甘肽等生理生化指標的影響。研究表明，重金屬鎘毒害降低苧麻幼苗葉綠素、可溶性糖和谷胱甘肽等含量；而蛋白質(zhì)和脯氨酸的含量在低鎘濃度時上升，但隨著鎘濃度的增加也呈現(xiàn)下降趨勢；加入內(nèi)生細菌處理后，苧麻各生理生化指標相比對照都有上升。結(jié)果表明內(nèi)生細菌在一定程度上通過改善苧麻的生理生化特性來緩解鎘對苧麻幼苗造成的脅迫。
關(guān)鍵詞：內(nèi)生細菌；鎘脅迫；苧麻；生理生化；重金屬污染
鎘（Cd）是一種生物毒性非常強的重金屬。土壤受到鎘污染后，會使農(nóng)作物的生長發(fā)育受到阻礙，產(chǎn)量下降[1]。植物體內(nèi)吸收的過量的重金屬易通過干擾植物細胞正常代謝，影響光合系統(tǒng)，對植物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致植物生長發(fā)育受阻，所以在重金屬高度污染的地區(qū)很難有植物能生長存活[2-3]。因此，了解重金屬脅迫對植物生長發(fā)育的影響對于尋找提高植物抗逆性方法具有重要意義。重金屬治理修復(fù)最常見的技術(shù)大致可分為物理修復(fù)、化學修復(fù)及生物修復(fù)[4]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是一種效率高、低成本、低污染的極具潛力的方案[5]。
至今為至，已有500多種重金屬超富集植物，其中用于Cd污染的富集植物較少，主要有寶山堇菜（Viola baoshanensis）、大花金雞菊（Coreopsis grandiflora Hogg）、忍冬（Lonicera japonica Thunb）和苧麻[6]。苧麻蕁麻科，多年生草本宿生植物，原產(chǎn)于東亞，高可達0.5~1.5m，是世界上最古老的纖維作物之一[7]。我國是苧麻的原產(chǎn)地，擁有約2 000份苧麻種質(zhì)資源，其遍布我國21個?。▍^(qū)）。此外，苧麻生物量較大，一年可收割3次，根系深度可達60cm[8]。康萬利等[9]研究表明，苧麻根系入土深、主根發(fā)達、根系分布廣、固土能力強及葉面積指數(shù)大等，是一種優(yōu)良的水土保持和環(huán)境治理植物，在湖南境內(nèi)大部分地區(qū)都有分布。
目前，重金屬想要徹底治理又不造成二次污染的方法還未見報道，只能將重金屬轉(zhuǎn)移或遷移，不能被降解。研究證明，植物與內(nèi)生細菌聯(lián)合修復(fù)是一種綠色的修復(fù)技術(shù)，不會造成二次污染[10]。植物修復(fù)因其生長周期長，與物理、化學修復(fù)等相比缺點顯而易見，因此，利用微生物結(jié)合植物修復(fù)顯得尤為重要。
內(nèi)生細菌在植物修復(fù)研究中受到廣泛關(guān)注[11]。植物相關(guān)細菌在宿主適應(yīng)不斷變化的環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。研究表明，超富集植物的內(nèi)生細菌可能是重金屬生物吸附的高效生物吸附劑的潛在資源[12]。內(nèi)生細菌特別受關(guān)注，因其具有相對免受土壤競爭性高應(yīng)力環(huán)境影響的優(yōu)勢[13]。
此外，微生物還能促進植物的旺盛生長，增大其生物量。由于內(nèi)生細菌存在于植物體內(nèi)，不易受外界環(huán)境的影響，可長期持續(xù)作用，具有良好開發(fā)利用前景[14]。本研究將內(nèi)生細菌運用接種到處于不同程度鎘脅迫下的苧麻上，從生長情況、葉綠素相對含量、葉綠素熒光參數(shù)及丙二醛含量等生理方面研究該內(nèi)生細菌對鎘脅迫下苧麻生長的影響，以期為重金屬抗性微生物在鎘污染領(lǐng)域緩解植物生長毒害作用的應(yīng)用提供理論支撐，發(fā)現(xiàn)良好的重金屬抗性內(nèi)生細菌應(yīng)用于輔助苧麻修復(fù)重金屬鎘污染環(huán)境的修復(fù)中。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
苧麻種子于湖南人文科技學院校園內(nèi)采集。所用菌株是本實驗室從婁底市冷水江錫礦石重金屬污染區(qū)的作物中分離篩選出來的對鎘有抗性的植物內(nèi)生細菌xks-03。
1.2 實驗方法
選取均勻飽滿的苧麻種子分成2組分別在清水和稀釋100倍的菌液中浸種24h，再分別分成3組擺放于培養(yǎng)皿中即6個處理組，清水浸種的3組分別用含Cd2+濃度為0mg/L、50mg/L、100mg/L的溶液和蒸餾水進行澆灌，菌液浸種的3組則用含Cd2+濃度為0mg/L、50mg/L、100mg/L的溶液和菌液進行澆灌，每次各加入10mL，一起放入恒溫培養(yǎng)箱中（25℃）進行培養(yǎng)，待發(fā)芽后移植到土壤栽培，繼續(xù)澆灌。約半個月后，隨機從每組抽取一植株測定總糖含量（蒽酮比色法）、蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍染料結(jié)合法）、葉綠素含量（丙酮法）與谷胱甘肽（DTNB法）和脯氨酸（磺基水楊酸法）等指標。
1.2.1 葉綠素的測定
稱取0.1g鮮葉，用丙酮和95%乙醇混合液提取，然后在663、645nm波長下測定吸光度，計算葉綠素含量。
1.2.2 可溶性糖的測定
稱取新鮮葉片0.25g，研磨勻漿，加入5mL蒸餾水，100℃沸水煮40min，快速冷卻后過濾，定容至25mL按蒽酮比色法測定可溶性糖的含量。
1.2.3 可溶性蛋白的測定
稱取苧麻幼苗倒數(shù)第三葉0.23g，用5mL生理鹽水研磨成勻漿，通過考馬斯亮藍染料結(jié)合法測定苧麻幼苗中可溶性蛋白。
1.2.4 脯氨酸的測定
剪取苧麻上部分0.2g新鮮葉片，用3%的磺基水楊酸溶液研磨成勻漿，通過酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸的含量用。
1.2.5 谷胱甘肽的測定
稱取0.1g新鮮葉片，加入5%三氯乙酸（TCA）溶液后進行研磨，定容。13000rpm，-4℃離心10min，取上清液定容至1.5mL。取0.5mL上清液，加入0.5mL蒸餾水，測定谷胱甘肽的含量。
苧麻所測各種生理生化指標的含量或變化均以鮮重（FW）為單位計算，每個處理組重復(fù)3次測定，實驗結(jié)果以平均值±標準偏差（SD）來表示。首先用Excel 2020軟件完成基本的數(shù)據(jù)錄入與計算，用SPSS.20軟件進行差異性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 內(nèi)生細菌在不同鎘濃度下苧麻幼苗葉綠素的變化
不同濃度的鎘脅迫對苧麻葉片葉綠素含量的影響不同。圖1中，在不加鎘溶液時，空白處理組中葉綠素含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量高，兩組無顯著性差異（P<0.05）；50mg/L鎘溶液時，空白處理組葉綠素含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，加內(nèi)生細菌處理顯著高于空白處理（P<0.05）；100mg/L鎘溶液時，空白處理組葉綠素含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，兩組無顯著性差異（P<0.05）。
2.2 內(nèi)生細菌在鎘脅迫下苧麻幼苗可溶性總糖的變化
可溶性糖的含量是衡量植株生理活性的一個指標，鎘毒害使可溶性糖含量降低。圖2中，在無鎘脅迫時，空白處理組中可溶性糖含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，加內(nèi)生細菌處理顯著高于空白處理（P<0.05），且具有極顯著性差異（P<0.01）；在50mg/L鎘溶液時，空白處理組中可溶性糖含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，加內(nèi)生細菌處理顯著高于空白處理（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時，空白處理組中可溶性糖含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，兩組無顯著性差異（P<0.05）。
2.3 內(nèi)生細菌在鎘脅迫下苧麻幼苗蛋白質(zhì)的變化
內(nèi)生細菌在鎘脅迫下苧麻幼苗蛋白質(zhì)的變化見圖3。圖3中，在無鎘脅迫時，空白處理組中蛋白質(zhì)含量低于加內(nèi)生細菌處理組的含量，加內(nèi)生細菌處理組顯著高于空白處理組（P<0.05）；在50mg/L鎘溶液時，空白處理組中蛋白質(zhì)含量低于加內(nèi)生細菌處理組的含量，但無顯著性差異（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時，空白處理組中蛋白質(zhì)含量低于加內(nèi)生細菌處理組的含量，加內(nèi)生細菌處理組高于空白處理組（P<0.05）達到顯著水平。
2.4 內(nèi)生細菌在鎘脅迫下苧麻幼苗脯氨酸的變化
內(nèi)生細菌在鎘脅迫下苧麻幼苗脯氨酸的變化見圖4。由圖4可以看出，隨鎘濃度的增加，苧麻的脯氨酸含量呈先上升后降低趨勢。在無鎘脅迫時，空白處理組中脯氨酸含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，兩者無顯著性差異（P<0.05）；在50mg/L鎘溶液時，空白處理組中脯氨酸含量明顯低于加內(nèi)生細菌處理組的含量，但兩者無顯著性差異（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時，空白處理組中脯氨酸含量比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，兩組無顯著性差異（P<0.05）。
2.5 內(nèi)生細菌在鎘脅迫下苧麻幼苗谷胱甘肽的變化
從圖5中可以看出，在3個鎘溶液處理中，加入菌液處理中的谷胱甘肽含量都比不加菌液處理的高。在無鎘脅迫時，空白處理組中谷胱甘肽含量低于加內(nèi)生細菌處理組的含量，但兩組無顯著性差異（P<0.05）；在50mg/L鎘溶液時，空白處理組中谷胱甘肽含量明顯比加內(nèi)生細菌處理組的含量低，加內(nèi)生細菌處理組顯著高于空白處理組（P<0.05）；在100mg/L鎘溶液時，空白處理組中谷胱甘肽含量明顯低于加內(nèi)生細菌處理組的含量，加內(nèi)生細菌處理組顯著高于空白處理組（P<0.05）。隨著鎘濃度的增加，內(nèi)生細菌對苧麻谷胱甘肽含量的合成效果越顯著。
3 結(jié)論
本實驗主要研究在重金屬鎘污染土壤上苧麻利用內(nèi)生細菌進行處理后，重金屬鎘對苧麻幼苗的脅迫影響及內(nèi)生細菌對苧麻受重金屬鎘污染的緩解作用。
葉綠素是植物中的綠色物質(zhì)，是一種復(fù)雜的有機酸，與作物葉片葉綠素含量具有顯著水平的相關(guān)性，而葉綠素含量是反映葉片光合能力的重要指標，與光合作用的性能密切相關(guān)[15]。耐銻促生菌能通過顯著提高植物中的葉綠素含量來促進光合作用。苧麻幼苗在鎘脅迫下，葉綠素含量在內(nèi)生細菌處理組均顯著高于空白組。而且隨著鎘濃度增加，葉綠素含量呈下降趨勢，說明了鎘脅迫會破壞苧麻葉綠素的合成，但通過添加內(nèi)生細菌，能夠緩和重金屬鎘對苧麻的毒害。
植物體內(nèi)可溶性糖含量代表其體內(nèi)碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)化與輸出代謝情況。本研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量是隨著鎘濃度的增加而顯著下降的，這表明鎘對苧麻幼苗產(chǎn)生可溶性糖的脅迫較強。但可以明顯看出，加入內(nèi)生細菌后，可溶性糖含量有所提高。
可溶性蛋白的變化是衡量重金屬污染的重要指標。研究表明，一定范圍的鎘濃度處理能夠促進苧麻的可溶性蛋白含量的合成，隨著鎘濃度的增加苧麻的可溶性蛋白含量也隨之增加[16]。同時也表明，隨著鎘處理濃度增加，蛋白質(zhì)含量上升。這可能是由于鎘作為一種逆境因子，激活了苧麻幼苗一些抗性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，但是高濃度鎘使可溶性蛋白含量明顯減少。但添加內(nèi)生細菌，對苧麻的可溶性蛋白合成明顯高與未加菌組，說明內(nèi)生細菌能夠促進植物的可溶性蛋白的合成。
脯氨酸是植物體內(nèi)水溶性最大的氨基酸，具有較強的水合能力，是理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在鎘濃度低時，脯氨酸含量上升；鎘濃度高時，脯氨酸含量下降，這說明鎘脅迫導(dǎo)致苧麻葉片中游離脯氨酸大量積累，脯氨酸的累積可能是苧麻對鎘毒害的一種保護性適應(yīng)。但高濃度鎘則對植物造成迫害，導(dǎo)致脯氨酸不能合成。從研究結(jié)果中看出，加入內(nèi)生細菌處理后，脯氨酸含量明顯提高。說明內(nèi)生細菌能夠有效修復(fù)植物合成脯氨酸。
植物內(nèi)的谷胱甘肽含量能有效衡量植株對鎘富集和耐受能力的大小。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鎘濃度的增加，谷胱甘肽的含量極具減少，發(fā)現(xiàn)表明鎘處理濃度的增加加強對苧麻幼苗的脅迫作用。加入內(nèi)生細菌處理后與同濃度鎘相比，谷胱甘肽含量比顯著提高，表明內(nèi)生細菌在一定程度上緩解了鎘對苧麻幼苗的抑制。
本實驗結(jié)果說明，在重金屬鎘污染下苧麻幼苗生長受到明顯抑制，苧麻幼苗的生長和各生理指標都受到影響，表現(xiàn)為重金屬鎘毒害使苧麻幼苗葉綠素、可溶性糖和谷胱甘肽等含量呈現(xiàn)下降趨勢；而蛋白質(zhì)和脯氨酸的含量在鎘濃度低時上升，并隨著鎘濃度的增加而下降。加入內(nèi)生細菌與鎘處理后，內(nèi)生細菌具有緩解或抑制鎘毒害的作用。
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