摘  要：本發(fā)明提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：制備帶有熒光標(biāo)記的基因編輯載體pCPB-35S-Colour-hspCas9質(zhì)粒；將目的基因靶標(biāo)片段構(gòu)建入上述質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，擴(kuò)大培養(yǎng)后制備農(nóng)桿菌侵染液；將農(nóng)桿菌侵染液侵染亞麻花蕾，繼續(xù)種植收獲亞麻種子；挑選有熒光信號(hào)的種子進(jìn)行種植，對(duì)葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出熒光標(biāo)記基因序列的植株即為亞麻陽(yáng)性植株。本發(fā)明避免了愈傷組織的培養(yǎng)及植株再生過(guò)程，且添加了易于選擇的熒光標(biāo)記，節(jié)約了時(shí)間和人力，提高了亞麻遺傳轉(zhuǎn)化工作的效率，使亞麻轉(zhuǎn)化可以批量進(jìn)行，為亞麻種質(zhì)創(chuàng)制及品種改良奠定了基礎(chǔ)。

 

技術(shù)要點(diǎn)

1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）制備帶有熒光標(biāo)記的基因編輯載體pCPB-35S-Colour-hspCas9質(zhì)粒；

（2）將目的基因靶標(biāo)片段構(gòu)建入基因編輯載體pCPB-35S-Colour-hspCas9質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，擴(kuò)大培養(yǎng)后制備農(nóng)桿菌侵染液；

（3）將步驟（2）得到的農(nóng)桿菌侵染液侵染亞麻花蕾，繼續(xù)種植收獲亞麻種子；

（4）挑選有熒光信號(hào)的亞麻種子進(jìn)行種植，然后提取亞麻植株葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出熒光標(biāo)記基因序列的植株即為亞麻陽(yáng)性植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，將熒光標(biāo)記基因表達(dá)框連接至pCPB-35S-hspCas9載體的PmeI和HindIII雙酶切位點(diǎn)之間，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，得到帶有熒光標(biāo)記的基因編輯載體pCPB-35S-Colour-hspCas9質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述pCPB-35S-hspCas9載體的構(gòu)建方法為：將pCPB-ZmUbi-hspCas9載體中的玉米ZmUbi啟動(dòng)子替換為在雙子葉植物中高表達(dá)的35S啟動(dòng)子。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述熒光標(biāo)記包括紅色、綠色和黃色熒光標(biāo)記。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述質(zhì)粒為帶有紅色熒光標(biāo)記DsRed表達(dá)框的pCPB-35S-Red-hspCas9。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)后，菌液的OD600達(dá)到0.7-1.0，離心后棄上清，加入蔗糖溶液使OD600在0.5-0.7之間，之后加入SilwetL-77，獲得農(nóng)桿菌侵染液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中，將構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，質(zhì)粒的加入量為0.2-0.6μg/100μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）中，將大田健康生長(zhǎng)的亞麻植株在侵染前剪掉周圍的葉片、過(guò)小的花蕾、已開放的花或是莢果，選擇0.4-0.6cm的花蕾進(jìn)行侵染。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）中，所述侵染是將亞麻花蕾完全浸入農(nóng)桿菌侵染液中，不斷搖晃侵染液侵染亞麻花蕾110s-130s，侵染過(guò)的亞麻花蕾套上黑色紙袋以保持濕度并提供暗培養(yǎng)條件，23-25h后去掉紙袋，正常生長(zhǎng)直至亞麻成熟。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。

 

背景技術(shù)

亞麻是亞麻科一種重要的雙子葉植物，因其油用和纖維價(jià)值被廣泛種植。亞麻籽中的α-亞麻酸含量在55%以上，是人類從植物中獲取ω-3脂肪酸的最好來(lái)源之一。此外，亞麻籽中含有蛋白質(zhì)、維生素E、膳食纖維及木酚素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這使得亞麻籽具有增強(qiáng)免疫力，增強(qiáng)智力，預(yù)防心腦血管疾病及癌癥，減緩人體衰老等作用。亞麻纖維具有“纖維皇后”的美譽(yù)，是紡織工業(yè)非常重要的原材料。因此，基于亞麻重要的食用及纖用價(jià)值，提高亞麻產(chǎn)量并改善其品質(zhì)對(duì)亞麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是改良作物品質(zhì)和研究基因功能的重要途徑之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及作物基礎(chǔ)研究中具有非常廣泛的應(yīng)用前景。植物遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有基因槍法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法及病毒侵染。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于小麥、玉米、大豆、油菜及水稻等多種重要作物。

通過(guò)花粉管通道法、基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、病毒侵染都有可能進(jìn)行亞麻遺傳轉(zhuǎn)化。然而，這些方法存在一些缺陷，基因槍法需要愈傷誘導(dǎo)和較長(zhǎng)時(shí)間的組織培養(yǎng)才能獲得再生植株，而且操作復(fù)雜，成本較高，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成本低、操作簡(jiǎn)單，但傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化需要通過(guò)組織培養(yǎng)才能獲得植株，周期較長(zhǎng)，且轉(zhuǎn)化效率低。此外，傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法，或是首先在添加了抗生素等篩選試劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，移栽后通過(guò)PCR檢測(cè)再次確認(rèn)陽(yáng)性植株；或是全部種植后提取DNA通過(guò)PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性植株，費(fèi)事費(fèi)力且成本較高?；ǚ酃芡ǖ婪ú恍枰ㄟ^(guò)組織培養(yǎng)，但花粉管通道法需要相當(dāng)豐富的經(jīng)驗(yàn)，亞麻花較小，操作難度大，而且效率較低。病毒侵染雖不需要進(jìn)行組織培養(yǎng)，但外源基因無(wú)法整合到染色體，無(wú)法遺傳給后代，不適合進(jìn)行外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，而且病毒載體自身不穩(wěn)定，容易發(fā)生變異，可能會(huì)誘發(fā)病害及造成外源基因丟失，因此無(wú)法廣泛應(yīng)用。

 

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的方法不需要組織培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)便，易于掌握，適合進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)化；避免了愈傷組織誘導(dǎo)、分化和植株再生等人工培養(yǎng)過(guò)程，避免了對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作技術(shù)的高要求，大大節(jié)約了試驗(yàn)時(shí)間和成本；轉(zhuǎn)化速度快，可直接收獲種子，當(dāng)年即可獲得轉(zhuǎn)基因植株；添加了易于選擇的熒光標(biāo)記，可通過(guò)Ds-Red熒光對(duì)種子進(jìn)行初篩，篩選后的種子種植后再進(jìn)行PCR檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間和人力。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

（1）制備帶有熒光標(biāo)記的基因編輯載體pCPB-35S-Colour-hspCas9質(zhì)粒；

（2）將目的基因靶標(biāo)片段構(gòu)建入基因編輯載體pCPB-35S-Colour-hspCas9質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，擴(kuò)大培養(yǎng)后制備農(nóng)桿菌侵染液；

（3）將步驟（2）得到的農(nóng)桿菌侵染液侵染亞麻花蕾，繼續(xù)種植收獲亞麻種子；

（4）挑選有熒光信號(hào)的亞麻種子進(jìn)行種植，然后提取亞麻植株葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出熒光標(biāo)記基因序列的植株即為亞麻陽(yáng)性植株。

在本申請(qǐng)中，對(duì)于步驟（2）所述的目的基因靶標(biāo)片段不作限制，可以是為敲除任何亞麻內(nèi)源基因而設(shè)計(jì)的特定靶標(biāo)序列，只要最終能夠獲得帶有熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因亞麻即可。

作為優(yōu)選，步驟（1）中，將熒光標(biāo)記基因表達(dá)框連接至pCPB-35S-hspCas9載體的PmeI和HindIII雙酶切位點(diǎn)之間，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，得到帶有熒光標(biāo)記的基因編輯載體pCPB-35S-Colour-hspCas9質(zhì)粒。

作為優(yōu)選，步驟（1）中，所述pCPB-35S-hspCas9載體的構(gòu)建方法為：將pCPB-ZmUbi-hspCas9載體中的玉米ZmUbi啟動(dòng)子替換為在雙子葉植物中高表達(dá)的35S啟動(dòng)子。

作為優(yōu)選，步驟（1）中，所述熒光標(biāo)記包括紅色、綠色和黃色熒光標(biāo)記。

本申請(qǐng)可以使用現(xiàn)有技術(shù)中的常用熒光標(biāo)記，對(duì)于熒光標(biāo)記的類型沒(méi)有具體限制，比如可以使用紅色熒光標(biāo)記DsRed。

作為優(yōu)選，步驟（1）中，所述質(zhì)粒為帶有紅色熒光標(biāo)記DsRed表達(dá)框的pCPB-35S-Red-hspCas9。

作為優(yōu)選，步驟（2）中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)后，菌液的OD600達(dá)到0.7-1.0，離心后棄上清，加入蔗糖溶液使OD600在0.5-0.7之間，之后加入SilwetL-77，獲得農(nóng)桿菌侵染液。

作為優(yōu)選，步驟（2）中，將構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，質(zhì)粒的加入量為0.2-0.6μg/100μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

作為優(yōu)選，步驟（3）中，將大田健康生長(zhǎng)的亞麻植株在侵染前剪掉周圍的葉片、過(guò)小的花蕾、已開放的花或是莢果，選擇0.4-0.6cm的花蕾進(jìn)行侵染。

作為優(yōu)選，步驟（3）中，所述侵染是將亞麻花蕾完全浸入農(nóng)桿菌侵染液中，不斷搖晃侵染液侵染亞麻花蕾110s-130s，侵染過(guò)的亞麻花蕾套上黑色紙袋以保持濕度并提供暗培養(yǎng)條件，23-25h后去掉紙袋，正常生長(zhǎng)直至亞麻成熟。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染轉(zhuǎn)化方法，避免了愈傷組織的培養(yǎng)和植株再生過(guò)程，消除了組織培養(yǎng)過(guò)程中可能發(fā)生的微生物污染及體細(xì)胞變異的風(fēng)險(xiǎn)，而且操作簡(jiǎn)單、成本低、實(shí)驗(yàn)周期短。

本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染轉(zhuǎn)化方法，采用黑色紙袋進(jìn)行暗培養(yǎng)，不受植株生長(zhǎng)環(huán)境的限制，可在田間大規(guī)模操作。

本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染轉(zhuǎn)化方法，在分枝較少、開放花朵較少的植株中更容易操作，有利于追蹤侵染過(guò)的花朵及成熟期種子的挑選，同時(shí)通過(guò)熒光檢測(cè)先對(duì)陽(yáng)性種子進(jìn)行初篩，種植后再進(jìn)行PCR檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間和人力，提高了亞麻遺傳轉(zhuǎn)化工作的效率，使亞麻轉(zhuǎn)化可以批量進(jìn)行，為亞麻種質(zhì)創(chuàng)制及品種改良奠定了基礎(chǔ)。

 

附圖說(shuō)明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為pCPB-35S-hspCas9質(zhì)粒圖譜。

圖2為DsRed連接至pCPB-35S-hspCas9載體的菌液PCR鑒定電泳圖。其中，M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，1-9：9個(gè)大腸桿菌單菌落。

圖3為pCPB-35S-Red-hspCas9質(zhì)粒圖譜。

圖4為AtU6-26質(zhì)粒圖譜。

圖5為農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定電泳圖。其中，M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，1-12：12個(gè)農(nóng)桿菌單菌落。

圖6為亞麻轉(zhuǎn)化的最佳狀態(tài)。其中，圖A展示待轉(zhuǎn)化亞麻植株整體生長(zhǎng)狀態(tài)，圖B展示待轉(zhuǎn)化花蕾狀態(tài)。

圖7為T0代陽(yáng)性種子DsRed檢測(cè)。

圖8為陽(yáng)性苗待選株P(guān)CR鑒定電泳圖。其中，WT：野生型，1-5：陽(yáng)性苗待選株。

圖9為陽(yáng)性苗生長(zhǎng)狀態(tài)。

 

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)、完整的說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，以下實(shí)施例僅用于幫助理解本發(fā)明，并不以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。此外，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以做出一些變化和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明所述的試驗(yàn)材料、設(shè)備，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售常規(guī)產(chǎn)品，本發(fā)明中所用實(shí)驗(yàn)方法，若為特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。

實(shí)施例1

1亞麻轉(zhuǎn)化受體的獲取

以亞麻品種隴亞14號(hào)和隴亞15號(hào)為轉(zhuǎn)化受體植株，3月25-31日將其種植在大田，在自然條件下生長(zhǎng)，開花初期選擇健康生長(zhǎng)的植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

選擇0.4-0.6cm的花蕾（圖6B）用以轉(zhuǎn)化，侵染前剪掉周圍的葉片、過(guò)小的花蕾、已開放的花或是莢果。

注意：（1）花蕾太小，農(nóng)桿菌侵染后容易導(dǎo)致花朵敗育，為了保證轉(zhuǎn)化效率并獲得足夠的轉(zhuǎn)化種子，需選擇合適大小的花蕾進(jìn)行侵染；（2）侵染前剪掉周圍的葉片、過(guò)小的花蕾、已開放的花或是莢果，一是為了保證待侵染的花蕾能充分接觸侵染液，二是方便對(duì)侵染過(guò)的花蕾進(jìn)行區(qū)分。

2熒光篩選載體構(gòu)建

2.1pCPB-35S-hspCas9載體的構(gòu)建：為本申請(qǐng)發(fā)明人依托華中農(nóng)業(yè)大學(xué)保存的pCPB-ZmUbi-hspCas9載體（RNA-guided Cas9 as anin vivodesired-target mutator in maize中有該載體的構(gòu)建方法；High-Throughput CRISPR/Cas9 Mutagenesis Streamlines Trait Gene Identification in Maize中提到了該載體），經(jīng)過(guò)改造獲得，將玉米ZmUbi啟動(dòng)子替換為在雙子葉植物中高表達(dá)的35S啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)Cas9基因在亞麻中高效表達(dá)。具體構(gòu)建方法如下：

以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存的質(zhì)粒CaMV 35S-Red（Genome-wide identification andfunctional characterization ofLEA genes during seed development process in linseed flax (LinumusitatissimumL.)中提到了這個(gè)載體，該載體由此文章發(fā)表單位構(gòu)建）為模板，利用引物CRISPR-35S-F和CRISPR-35S-R擴(kuò)增35S啟動(dòng)子，大小為572bp；同時(shí)用引物Cas9-F和PmlI-Cas9-R擴(kuò)增pCPB-ZmUbi-hspCas9載體上Cas9起始位點(diǎn)和PmlI酶切位點(diǎn)之間的片段，大小為2944bp；最后以CRISPR-35S-F和PmlI-Cas9-R為引物，以前兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增overlap片段，大小為3496bp。

PCR擴(kuò)增體系如下：

總體系50μL

2×PCR buffer for KOD FX 25μL

dNTP（2mM）10μL

KOD FX聚合酶1μL

上游引物（10μM）1.5μL

下游引物（10μM）1.5μL

模板DNA（300ng/μL）1μL

ddH2O 10μL。

模板DNA分別為質(zhì)粒CaMV 35S-Red和pCPB-ZmUbi-hspCas9。

其中的引物序列為：

上游引物CRISPR-35S-F：

CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGATCCCATGGAGTCAAAGATTCAAA（SEQ ID No.1）；

下游引物CRISPR-35S-R：GGAATTCCCAGTCCCCCGTGTTCTC（SEQ ID No.2）。

上游引物Cas9-F：

CACGGgggactgGGAATTCCATGGACTATAAGGACCACGACGGAG（SEQ ID No.3）

下游引物PmlI-Cas9-R：TCCAGGATCTGTGCCACGTGCTTTGTGATCTGCCGGGTTTCCAC（SEQ ID No.4）

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2min；98℃變性10s；55℃退火30s，68℃延伸1kb/min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃結(jié)束。

引物CRISPR-35S-F和PmlI-Cas9-R擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit（AXYGEN，下同）進(jìn)行回收，片段大小為3496bp。

用HindIII+PmlI對(duì)載體質(zhì)粒pCPB-ZmUbi-hspCas9進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，采用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit回收大小為11.4kb左右的條帶。

HindIII+PmlI雙酶切體系及條件如下：

總體系50μL

HindIII 1μL

PmlI 1μL

10×NEB Buffer2.1 5μL

質(zhì)粒DNA 5μL

ddH2O 38μL

酶切程序：37℃24h。

用ClonExpress®MultiS One Step Cloning Kit同源重組連接試劑盒將CRISPR-35S-F和PmlI-Cas9-R擴(kuò)增片段連接至pCPB-ZmUbi-hspCas9。

連接體系如下：

5×CE Multis Buffer 4μL

Exnase Multis 2μL

CRISPR-35S-F/PmlI-Cas9-R擴(kuò)增產(chǎn)物1μL

pCPB-ZmUbi-hspCas9載體13μL

連接程序：37℃30min。

轉(zhuǎn)化：將DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上溶解10～15min，取上述連接產(chǎn)物10μL緩慢加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吸打混勻，置于冰上靜置30min；42℃水浴90s，之后立即置于冰上冷卻5min；加入800μLLB液體培養(yǎng)基（不含抗生素）；37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)45min；6000rpm，離心3min，吸掉700μL上清，用剩余液體重懸菌體涂于LB平板上（含50ug/mLKan）；37℃倒置培養(yǎng)16h左右；挑取單克隆于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（16h左右）；用引物CRISPR-35S-F和PmlI-Cas9-R做菌液PCR檢測(cè)，挑選陽(yáng)性菌液保存菌液并送測(cè)序。挑選測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，利用AxyPrep TM Plasmid Miniprep Kit（AXYGEN，下同）提取質(zhì)粒。將新載體命名為pCPB-35S-hspCas9，圖譜見(jiàn)圖1。

菌液PCR體系為：總體系25μL，包括PCR mix（2×）12.5μL、引物各0.5μL（0.2μmol/L）、模板2μL、水9.5μL；PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1kb/10s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

圖1為pCPB-35S-hspCas9質(zhì)粒圖譜。

2.2DsRed表達(dá)框制備

本發(fā)明中紅色熒光標(biāo)記DsRed表達(dá)框（CVMV-DsRed-Nos）的序列通過(guò)設(shè)計(jì)引物從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存的質(zhì)粒CaMV35S-Red中克隆獲得。

以質(zhì)粒CaMV35S-Red為模板，利用引物Red-F和Red-R擴(kuò)增DsRed表達(dá)框，用KOD FX聚合酶對(duì)DsRed表達(dá)框進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序同步驟2.1。凝膠回收后，利用ClonExpress®MultiS One Step Cloning Kit同源重組試劑盒，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pCPB-35S-hspCas9載體PmeI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間。其中上下游引物5’端均有14個(gè)核苷酸序列與載體相應(yīng)連接位置重復(fù)，且含有與載體相對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，以便進(jìn)行同源重組連接。

其中的引物序列為：

上游引物Red-F：

GTCAAACACTGATAGTTTAAACCTAGTAGAAGGTAATTATCCAAGATGTAGC（SEQ ID No.5）；

下游引物Red-R：GACTCCATGGGATCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGACACC（SEQ ID No.6）。

引物Red-F和Red-R擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收，片段大小為1568bp，即為DsRed表達(dá)框基因序列。

2.3DsRed篩選載體構(gòu)建

用PmeI+HindIII對(duì)載體質(zhì)粒pCPB-35S-hspCas9進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，采用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit回收大小為14.7kb左右的條帶，獲得pCPB-35S-hspCas9的線性片段。

PmeI+HindIII雙酶切體系及條件如下：

總體系50μL

HindIII 1μL

PmeI 1μL

10×NEB Buffer2.1 5μL

質(zhì)粒DNA 5μL

ddH2O 38μL

酶切程序：37℃24h。

用ClonExpress®MultiS One Step Cloning Kit同源重組連接試劑盒將DsRed表達(dá)框連接至pCPB-35S-hspCas9。

連接體系如下：

5×CE Multis Buffer4μL

Exnase Multis2μL

DsRed表達(dá)框回收產(chǎn)物1μL

pCPB-35S-hspCas9載體13μL

連接程序：37℃30min。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化過(guò)程同步驟2.1，用引物Red-F和Red-R做菌液PCR檢測(cè)（檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2），挑選陽(yáng)性菌液保存菌液并送測(cè)序。菌液PCR體系及程序同步驟2.1。挑選測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，利用AxyPrep TM Plasmid Miniprep Kit提取質(zhì)粒。將新載體命名為pCPB-35S-Red-hspCas9，圖譜見(jiàn)圖3。

圖2為DsRed連接至pCPB-35S-hspCas9載體的菌液PCR鑒定電泳圖。其中，M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，1-9：9個(gè)大腸桿菌單菌落。

圖3為pCPB-35S-Red-hspCas9質(zhì)粒圖譜。

3CYP79敲除載體構(gòu)建

本發(fā)明中的載體pCPB-35S-Red-hspCas9為基因編輯載體，可用于亞麻任何內(nèi)源基因的編輯。

本實(shí)施例中以亞麻CYP79基因?yàn)槔?，?gòu)建CYP79基因的敲除載體，并轉(zhuǎn)化亞麻。根據(jù)CYP79基因編碼序列設(shè)計(jì)特異性靶標(biāo)并進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠回收之后利用ClonExpress®MultiS One Step Cloning Kit同源重組試劑盒連接至步驟2制備的pCPB-35S-Red-hspCas9載體的HindIII酶切位點(diǎn)。靶標(biāo)擴(kuò)增引物上下游引物5’端均有14個(gè)核苷酸序列與載體相應(yīng)連接位置重復(fù)，且含有與載體相對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，以便進(jìn)行同源重組連接。

3.1靶標(biāo)設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

利用http://crispr.dbcls.jp/網(wǎng)站在線對(duì)CYP79基因進(jìn)行靶標(biāo)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性靶標(biāo)。靶標(biāo)擴(kuò)增過(guò)程如下：

3.1.1以AtU6-26F1和AtU6-26R做引物，本研究室構(gòu)建的AtU6-26質(zhì)粒為模板（將合成的AtU6-26啟動(dòng)子序列連接至pUC57載體的HindIII酶切位點(diǎn)，測(cè)序正確后將新載體命名為AtU6-26，圖譜見(jiàn)圖4），擴(kuò)增第一個(gè)靶標(biāo)的U6Promotor，大小為458bp；以AtU6-26F2和AtU6-26R做引物，AtU6-26質(zhì)粒為模板擴(kuò)第二個(gè)靶標(biāo)的U6Promotor，大小為458bp；用KODFX聚合酶對(duì)兩個(gè)靶標(biāo)的promoter進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序與步驟2.1相同。

圖4為AtU6-26質(zhì)粒圖譜。

AtU6-26啟動(dòng)子序列如下：

CGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTG（SEQ ID No.7）

3.1.2以AtU6-26-CYP79-TargetF1和Red-gRR為引物，phU6-gRNA（上海昂羽生物技術(shù)有限公司）為模板擴(kuò)增第一個(gè)靶標(biāo)+SgRNA片段，大小為138bp；用AtU6-26-CYP79-TargetF2和Red-gRR為引物，phU6-gRNA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增第二個(gè)靶標(biāo)+SgRNA片段，大小為138bp；用KOD FX聚合酶對(duì)兩個(gè)靶標(biāo)+SgRNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序與步驟2.1相同。

3.1.3以AtU6-26F1和Red-gRR為引物，將步驟3.1.1中擴(kuò)增得到的第一個(gè)靶標(biāo)的U6Promotor和步驟3.1.2中擴(kuò)增得到的第一個(gè)靶標(biāo)+SgRNA片段各稀釋50倍后，作為模板共同加入到同一PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序與步驟2.1相同。1%瓊脂糖凝膠電泳后，用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收，片段大小為577bp，測(cè)序確認(rèn)序列正確后，得到靶標(biāo)1插入片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?/font>

以AtU6-26F2和Red-gRR為引物，將步驟3.1.1中擴(kuò)增得到的第二個(gè)靶標(biāo)的U6-Promotor和步驟3.1.2中擴(kuò)增得到的第二個(gè)靶標(biāo)+SgRNA片段各稀釋50倍后，作為模板共同加入到同一PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序與步驟2.1相同。1%瓊脂糖凝膠電泳后，用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收，片段大小為577bp，測(cè)序確認(rèn)序列正確后，得到靶標(biāo)2插入片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?/font>

引物序列：

AtU6-26F1：CCATGGGATCAAGCTCGTTGAACAACGGAAACTCGACT（SEQ ID No.8）

AtU6-26F2：TGCTTTTTTTAAGCTCGTTGAACAACGGAAACTCGACT（SEQ ID No.9）

AtU6-26R：CAATCACTACTTCGACTCTAGCTGT（SEQ ID No.10）

AtU6-26-CYP79-targetF1：

TAGAGTCGAAGTAGTGATTGGCCATGAACACCTCCGACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT（SEQ ID No.11）

AtU6-26-CYP79-targetF2：

TAGAGTCGAAGTAGTGATTGAATGAAGGCGGTGGGTGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT（SEQ ID No.12）

Red-gRR：CTAGATCGGGAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCG（SEQ ID No.13）。

3.2靶標(biāo)連接

用HindIII對(duì)載體質(zhì)粒CPB-35S-Red-hspCas9進(jìn)行單酶切，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，采用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit回收大小為16kb左右的條帶，獲得CPB-35S-Red-hspCas9的線性片段。

HindIII酶切體系及條件如下：

總體系50μL

HindIII 1μL

10×NEB Buffer2.1 5μL

質(zhì)粒DNA 5μL

ddH2O 39μL

酶切程序：37℃2h。

用ClonExpress®MultiS One Step Cloning Kit同源重組試劑盒將靶標(biāo)1回收片段連接至CPB-35S-Red-hspCas9載體。

連接體系如下：

5×CE Multis Buffer 4μL

Exnase Multis2μL

靶標(biāo)1回收產(chǎn)物1μL

CPB-35S-Red-hspCas9載體13μL

連接程序：37℃30min。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化過(guò)程與步驟2.1相同，用引物Red-CRISPR-F和Red-CRISPR-R進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)后保存菌液并送陽(yáng)性菌液去測(cè)序，擴(kuò)增片段大小為1022bp。菌液PCR體系及程序與步驟2.1相同。挑選測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，利用AxyPrep TM Plasmid Miniprep Kit試劑盒提取質(zhì)粒。

引物序列：

Red-CRISPR-F：GAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGC（SEQ ID No.14）

Red-CRISPR-R：TCACCTCCCACAACGAGGACTACA（SEQ ID No.15）。

連接靶標(biāo)1后的質(zhì)粒進(jìn)行酶切回收，之后連接靶標(biāo)2回收片段，菌液PCR檢測(cè)后挑選陽(yáng)性菌液測(cè)序，挑選測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，所有程序與連接靶1相同，得到CYP79基因敲除載體質(zhì)粒，菌液PCR擴(kuò)增片段大小為1573bp。

4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆鑒定

4.1GV3101感受態(tài)制備

取2μL保存的農(nóng)桿菌GV3101菌液于LB固體培養(yǎng)基（含50ug/mL Rif）劃平板，28℃培養(yǎng)48h左右；挑取單克隆加入含有1mL LB（含50ug/mL Rif）的無(wú)菌離心管中，28℃培養(yǎng)過(guò)夜；吸取100μL菌液加入含有50mL LB（含50ug/mL Rif）的無(wú)菌三角瓶中，28℃培養(yǎng)過(guò)夜，至OD600=0.8-1.0；在超凈工作臺(tái)上將菌液轉(zhuǎn)移至50mL無(wú)菌離心管中，并置于冰上；4℃4000rpm，離心10min，倒掉上清；用10mL100mMCaCl2溶液（-20℃預(yù)冷5min），輕輕懸浮菌體，冰浴30min。4℃4000rpm，離心10min，倒掉上清；加入4mL預(yù)冷的100mMCaCl2溶液與1mL75%的甘油（-20℃預(yù)冷5min），輕輕吸打混勻；快速分裝于1.5ml的無(wú)菌離心管中，每管100μL，并立即于液氮中速凍，-80℃保存。

4.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定

將凍存的100μL農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，之后加入2μL（0.2-0.6μg）步驟3.2制備的CYP79基因敲除載體質(zhì)粒，輕輕混勻后冰浴30min，液氮冷凍10min，之后立即于37℃水浴5min，取出后冰浴2min，加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)4h，6000rpm，離心3min后留100μL上清重懸菌體涂于含利福平（Rif）和卡那霉素（Kan）（利福平和卡那霉素濃度均為50ug/mL）的LB固體培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)48h左右。

挑取若干單克隆分別加入含有1mL LB（含50ug/mL Rif和50ug/mL Kan）的2ml無(wú)菌離心管中，28℃，200rpm，培養(yǎng)過(guò)夜；取2μl菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定，所用引物、擴(kuò)增體系及程序與連接靶標(biāo)2后的菌液PCR鑒定相同。

從圖5可以看出，挑取的12個(gè)單菌落在1600bp附近均具有目的條帶，說(shuō)明均為陽(yáng)性克隆。

圖5為農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定電泳圖。其中，M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，1-12：12個(gè)農(nóng)桿菌單菌落。

4.3制備農(nóng)桿菌侵染液

將農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌液接種于50mL新的LB液體培養(yǎng)基（含50ug/mL Rif和50ug/mL Kan）中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)15-20h，OD600達(dá)到0.7-1.0后，4000rpm離心10min后棄上清，用新鮮配制的滅菌的5%蔗糖溶液重懸菌體，使OD600在0.5-0.7之間，之后加入體積百分比0.05%Silwet L-77（Silwet L-77是一種高效有機(jī)硅表面活性劑，能夠極大的降低水的表面張力，可濕潤(rùn)幾乎所有植物組織的表面，相較于傳統(tǒng)助劑，可以使農(nóng)桿菌更加充分地覆蓋花蕾），從而獲得農(nóng)桿菌侵染液。

菌液OD值對(duì)侵染效率至關(guān)重要，OD600在0.7-1.0之間農(nóng)桿菌活性較高，侵染效率高。

4.4亞麻花序侵染

將適合侵染的亞麻花蕾完全浸入農(nóng)桿菌侵染液中，不斷搖晃侵染液，時(shí)間2min，侵染過(guò)的花蕾做好標(biāo)記并套上黑色紙袋以保持濕度并提供暗培養(yǎng)條件，24h后去掉紙袋，正常生長(zhǎng)直至種子成熟。轉(zhuǎn)化后及時(shí)去除新長(zhǎng)出的未轉(zhuǎn)化的花序。

本發(fā)明中最佳侵染時(shí)間為2min，時(shí)間過(guò)短會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，過(guò)長(zhǎng)則容易對(duì)花蕾造成損傷，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致花蕾敗育，無(wú)法結(jié)實(shí)；本發(fā)明選擇黑色紙袋保持濕度并提供暗培養(yǎng)條件，是因?yàn)楸緦?shí)施例是在大田進(jìn)行侵染，且植株花蕾期正值高溫，如果使用塑料袋或透氣性差的其他材料，高溫會(huì)導(dǎo)致花蕾損傷甚至枯萎；如果是在可以控制溫度的人工氣候室進(jìn)行轉(zhuǎn)化，則黑色紙袋、黑色塑料袋或其他可提供黑暗條件的材料皆可。

圖6為亞麻轉(zhuǎn)化的最佳狀態(tài)。其中，圖A展示待轉(zhuǎn)化亞麻植株整體生長(zhǎng)狀態(tài)，圖B展示待轉(zhuǎn)化花蕾狀態(tài)。

4.5亞麻陽(yáng)性植株的獲得

種子收獲后，利用Hand-Held Lamp（LUYOR-3415RG）熒光裝置觀察DsRed熒光進(jìn)行挑選，將有熒光信號(hào)的種子（圖7）于溫室中進(jìn)行種植，幼苗期用CTAB法提取葉片DNA，用引物Red-CRISPR-JCF2和Red-CRISPR-JCR2進(jìn)行PCR檢測(cè)，可以擴(kuò)增出目的條帶（紅色熒光標(biāo)記基因）的植株即為陽(yáng)性苗，條帶大小為1526bp。PCR體系為：總體系25μL，包括PCR mix（2×）12.5μL、引物各0.5μL（0.2μmol/L）、模板2μL、水9.5μL；PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

注：通過(guò)觀察DsRed熒光初步挑選陽(yáng)性種子，在很大程度上減少了陽(yáng)性植株鑒定的工作量，提高了工作效率，而且可以降低檢測(cè)成本。

圖7為T0代陽(yáng)性種子DsRed檢測(cè)。

引物序列：

Red-CRISPR-JCF2：CTAGTAGAAGGTAATTATCCAAGATGTAGC（SEQ ID No.16）

Red-CRISPR-JCR2：CCCGATCTAGTAACATAGATGACACC（SEQ ID No.17）。

由圖8看出，未轉(zhuǎn)化野生型（WT）植株無(wú)目的條帶，與理論一致；1號(hào)植株沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，不是陽(yáng)性植株；除1號(hào)外，2-5號(hào)植株均能夠擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明這些為陽(yáng)性植株。

圖8為陽(yáng)性苗待選株P(guān)CR鑒定電泳圖。其中，WT：野生型，1-5：陽(yáng)性苗待選株。

圖9為陽(yáng)性苗生長(zhǎng)狀態(tài)。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

  

  

  

  

  

  

  

  

  

 

摘自國(guó)家發(fā)明專利，發(fā)明人：齊燕妮，李聞娟，張建平，王利民，謝亞萍，趙瑋，黨照，申請(qǐng)?zhí)枺?/font>202211066001.7，申請(qǐng)日：2022.09.01