摘  要：磷脂酶A1(PhospholipaseA1，PLA1)在植物生長發(fā)育及脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，但目前關(guān)于PLA1在亞麻中的鑒定與表達特征尚未見報道。本研究利用生物信息學方法對包括亞麻在內(nèi)的7個物種PLA1基因家族進行鑒定，分析了亞麻PLA1(LuPLA1)的序列特征、系統(tǒng)進化關(guān)系、順式作用元件、共線性關(guān)系及其復(fù)制事件，并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了其在不同遺傳背景、不同器官中的表達模式，利用qRT-PCR分析了其在不同組織、不同發(fā)育時期及脅迫處理下的表達模式。結(jié)果表明，在亞麻、擬南芥、玉米、水稻、大豆、蓖麻及木薯基因組中分別鑒定到14、21、15、20、41、18和35個PLA1成員；LuPLA1基因分布于8條染色體上。序列特征分析發(fā)現(xiàn)，除LuPLA1-7和LuPLA1-10外，其他家族成員都具有內(nèi)含子且多數(shù)含有1個內(nèi)含子；LuPLA1蛋白序列長度為388~1759aa，等電點為5.99~9.19，分子量為41.55~192.61kD，均為親水性蛋白，大多數(shù)定位于液泡，含有4~25個Motif。系統(tǒng)進化分析將PLA1蛋白分為4個分支，其中第IV分支PLA1成員數(shù)量最多。共線性分析表明，LuPLA1在擬南芥、玉米、水稻、木薯及大豆中均具有同源基因且與大豆、木薯的同源基因最多。LuPLA1家族成員中共有2對基因發(fā)生串聯(lián)復(fù)制，7對基因發(fā)生片段復(fù)制，且都經(jīng)歷了純化選擇。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)大多LuPLA1成員表現(xiàn)為器官特異性表達。LuPLA1啟動子區(qū)含大量激素與逆境響應(yīng)相關(guān)元件，qRT-PCR分析進一步證實LuPLA1基因受激素、干旱、高鹽、低溫及高溫誘導表達。其中LuPLA1-1受IAA誘導表達；LuPLA1-1和LuPLA1-6受NAA誘導表達；LuPLA1-1、LuPLA1-5和LuPLA1-6受GA3誘導表達；LuPLA1-12/14受NaCl和PEG誘導表達；除LuPLA1-2/4外，其余基因均受高溫誘導表達；所有LuPLA1受低溫誘導表達，對低溫的響應(yīng)最為明顯。本研究為進一步解析LuPLA1基因家族的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：亞麻；LuPLA1；基因家族；表達分析

 

亞麻(LinumusitatissimumL.)屬于亞麻科亞麻屬，自花授粉，是一種一年生的二倍體草本雙子葉植物(2n=2x=30)。亞麻是我國重要的油料作物及經(jīng)濟作物，具有耐旱、耐寒、耐瘠薄等特點，廣泛應(yīng)用于油脂、紡織、印刷、制革、醫(yī)藥、食品等工業(yè)，具有良好的經(jīng)濟價值[1-3]。近年來，隨著人們健康意識的不斷增強，開發(fā)亞麻籽中的有益成分(α-亞麻酸、木酚素、膳食纖維等)已成為亞麻加工業(yè)的重點目標之一[4]。

磷脂是細胞膜的主要成分，磷脂酶(Phospholipase，PLs)是磷脂切割酶，參與植物生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答等多種生命過程[5]。磷脂酶因磷脂分子內(nèi)的水解位點不同而被分為5類，分別為磷脂酶A1(PhospholipaseA1，PLA1)、磷脂酶A2(PhospholipaseA2，PLA2)、溶血磷脂酶(PhospholipaseB，PLBs)、磷脂酶C(PhospholipaseC，PLCs)和磷脂酶D(PhospholipaseD，PLDs)，其中PLBs不存在于植物中。甘油主鏈上的疏水脂肪酸尾部由PLAs和PLBs去除，而親水磷酸頭部附著在其上的側(cè)鏈由PLCs和PLDs去除[6-7]。植物幾乎所有的生命活動和應(yīng)答機制都有磷脂酶的參與，如種子萌發(fā)[8]、細胞伸長[9]、植株衰老[10]、植物抗逆性的提高[11]等。與其他磷脂酶相比，PLA1相關(guān)研究相對較少。

PLA1廣泛存在于自然界中，許多微生物和動植物組織細胞都具有PLA1活性[12]。磷脂分子sn-1位酯鍵可以被PLA1特異性水解進而生成游離脂肪酸和溶血磷脂，包括亞麻酸等不飽和脂肪酸[13-14]。在哺乳動物中鑒定到9個PLA1蛋白，其中6個是細胞外酶，3個是細胞內(nèi)酶，其氨基酸序列具有較大差異，且表現(xiàn)出不同的功能[15]。相關(guān)研究表明，PLA1在微生物中也廣泛存在，其中液化沙雷氏菌、假單孢菌及曲霉菌等均具有PLA1蛋白[16]。PLA1在植物中的發(fā)現(xiàn)較遲于動物和微生物，1995年，首次在植物中發(fā)現(xiàn)的PLA1蛋白為花藥不開裂蛋白1(DAD1)[17]。擬南芥中DAD1蛋白參與植物生長調(diào)控因子茉莉酸的合成[18]。此外，擬南芥中AtLCAT3蛋白也具有PLA1活性[19]。Seo等[20]在辣椒中克隆到了PLA1的cDNA序列，并在擬南芥中對其進行了過表達，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系的根、葉和葉柄明顯較長，生長速度更快，引起過早抽苔并且具有較長的花序，這表明PLA1可能參與細胞及組織生長的一系列正向調(diào)控機制。姜惠娜等[21]在西藏野生垂穗披堿草中克隆到PLA1基因并對其進行了表達分析，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下PLA1基因表達量明顯上調(diào)。有研究表明，PLA1在植物響應(yīng)機械損傷的過程中也起著十分重要的作用[22]。近年來在玉米單倍體誘導的研究中[23]發(fā)現(xiàn)，在ZmPLA1的C端編碼區(qū)插入一個四堿基對，導致其編碼磷脂酶基因功能的減弱或喪失，最終誘導單倍體的產(chǎn)生，且在水稻[24]、小麥[25]等作物中對PLA1/MATL基因進行編輯，也成功獲得了單倍體誘導系，推測ZmPLA1同源基因在禾本科植物中單倍體誘導具有保守的功能。到目前為止，亞麻中尚未有PLA1相關(guān)的研究。

本研究利用生物信息學手段，對亞麻PLA1基因家族進行全基因組鑒定，并對其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、進化關(guān)系、染色體定位、復(fù)制事件及啟動子順式元件等進行了系統(tǒng)分析，同時采用qRT-PCR分析該家族成員在亞麻不同時期、不同器官及非生物脅迫下的表達模式，旨在為深入研究亞麻PLA1家族各成員的功能奠定基礎(chǔ)，為亞麻分子育種提供基因資源。

1材料與方法

1.1 試驗材料

亞麻品種隴亞15號、隴亞10號和黑亞14號由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所胡麻課題組提供。供試材料隴亞15號于2021年3月種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蘭州試驗基地。開花后采集不同時期花藥以及開花后10d、20d、30d、40d、50d的種子。在培養(yǎng)皿中萌發(fā)隴亞15號種子，10d后選取生長一致的幼苗移至1/2MS液體培養(yǎng)基中，3d后進行脅迫處理同時更換新的培養(yǎng)液。分別對亞麻幼苗進行鹽脅迫(150mmol·L-1氯化鈉)、聚乙二醇處理(20%PEG)、吲哚乙酸處理(15µmol·L-1IAA)、萘乙酸處理(5µmol·L-1NAA)、赤霉素處理(5µmol·L-1GA3)、低溫脅迫(4℃處理3h)及高溫脅迫(45℃處理3h)，分別在處理后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、72h及恢復(fù)后48h取其葉片。所有樣品用液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 PLA1基因家族的鑒定

從NCBI下載亞麻基因組序列(登陸號為QMEI02000000)，從網(wǎng)址https：//doi.org/10.6084/m9.figshare.13614311.v3下載CDS序列，蛋白質(zhì)序列及gff文件。從網(wǎng)址http：//www.phytozome.net/下載擬南芥、玉米、水稻、大豆、蓖麻及木薯全基因組蛋白序列，水稻及玉米等已知MATL/PLA1蛋白序列從NCBI獲取(登錄號分別為XP_015630145.1和XP_008656522.1)。利用Blastp，將已知PLA1蛋白序列與亞麻、擬南芥、玉米、水稻、大豆、蓖麻及木薯全基因組蛋白序列進行比對，之后用Pfam(http：//pfam.xfam.org/search#searchBatchBlock)進行結(jié)構(gòu)域確認，剔除不含PLA1蛋白典型結(jié)構(gòu)域的序列。

 

1.3 LuPLA1基因家族染色體定位、復(fù)制分析及共線性分析

根據(jù)LuPLA1基因在染色體上的位置對其進行命名，并利用MapGenetoChromosome(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)繪制LuPLA1家族成員的染色體定位圖譜。利用MCScanX分析其復(fù)制事件，之后采用DnaSP6計算基因?qū)χg的非同義替換率(Ka)、同義替換率(Ks)及Ka/Ks比值，利用Ka/Ks比值分析選擇壓力?；?qū)χg的分歧時間(millionyearsago，MYA)用Mya=Ks/(2×6.1×10-9)´10-6計算[26]。利用TBtools分析亞麻基因組內(nèi)及亞麻與擬南芥、大豆、木薯、水稻及玉米之間的共線性并進行可視化。

1.4 LuPLA1蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

利用ExPASyProtParam(http：//web.wxoasy.org/protparam/)[27]對LuPLA1蛋白的分子量、等電點、氨基酸組成等理化性質(zhì)進行預(yù)測；利用Plant-mPloc[28](http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對LuPLA1蛋白的亞細胞定位進行預(yù)測；同時使用ExPASyProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)預(yù)測LuPLA1蛋白的親疏水性；利用SOPMA[29](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測LuPLA1蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.5 LuPLA1蛋白系統(tǒng)進化分析

利用MEGA7.0軟件對亞麻、擬南芥、玉米、水稻、大豆、蓖麻及木薯的PLA1蛋白序列進行多序列比對，隨后采用鄰接法(Neighbor-Joiningmethod)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap校驗參數(shù)為1000次。

1.6 LuPLA1家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)保守基序分析

利用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行LuPLA1基因結(jié)構(gòu)分析及可視化；利用MEME在線軟件(http：//alternate.meme-suite.org/tools/meme)分析LuPLA1蛋白的保守基序，預(yù)測值設(shè)置為25個，最后采用TBtools對保守基序進行可視化繪圖。

1.7 LuPLA1基因家族成員啟動子分析

提取LuPLA1基因轉(zhuǎn)錄起始位置上游2000bp作為啟動子序列，通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析順式作用元件。

1.8 LuPLA1基因表達分析

利用Primer5.0軟件設(shè)計熒光定量引物(附表1)，由于LuPLA1-2與LuPLA1-4、LuPLA1-3與LuPLA1-11、LuPLA1-7與LuPLA1-10、LuPLA1-8與LuPLA1-9、LuPLA1-12與LuPLA1-14序列相似性分別達到了94.07%、97.19%、89.74%、96.20%和95.58%，無法設(shè)計特異性引物，故分別共用一對定量引物。采用RNA提取試劑盒(BIOMGA)提取所采樣品總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop-2000對RNA的濃度和質(zhì)量進行檢測，隨后用Prime-ScriptII試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，保存于-20℃冰箱用于qRT-PCR。以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2×SYBRMixture(Biomiga)熒光定量試劑盒進行qRT-PCR。每個樣品3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法計算目標基因的相對表達量[30]，最后利用GraphPadPrism8.0.1軟件作圖。本研究所用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從NCBI下載(登錄號見附表2)，利用TBtools繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LuPLA1基因家族的鑒定、染色體定位及共線性分析

通過Blastp比對、Pfam數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)域確認，在亞麻、擬南芥、玉米、水稻、大豆、蓖麻及木薯中分別鑒定到14、21、15、20、41、18及35個PLA1成員。根據(jù)亞麻PLA1基因在染色體上的位置，將其依次命名為LuPLA1-1~LuPLA1-14。LuPLA1基因染色體定位結(jié)果顯示，14個LuPLA1基因分布于8條染色體上，呈不均勻分布(圖1)。對LuPLA1基因進行復(fù)制分析發(fā)現(xiàn)，有2對基因發(fā)生串聯(lián)復(fù)制，分別為LuPLA1-7和LuPLA1-8、LuPLA1-9和LuPLA1-10；7對基因發(fā)生片段復(fù)制，分別為LuPLA1-2和LuPLA1-4、LuPLA1-3和LuPLA1-11、LuPLA1-3和LuPLA1-12、LuPLA1-7和LuPLA1-9、LuPLA1-11和LuPLA1-12、LuPLA1-11和LuPLA1-14、LuPLA1-12和LuPLA1-14(表1)。計算上述基因?qū)Φ腒a/Ks比值進行選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生復(fù)制的基因?qū)a/Ks比值在0.05~0.3之間，均小于1，表明這些LuPLA1基因在進化過程中均受到純化選擇。對復(fù)制事件發(fā)生的分歧時間進行計算發(fā)現(xiàn)，LuPLA1發(fā)生串聯(lián)復(fù)制的分歧時間分別為4174.59和4435.25萬年前，發(fā)生片段復(fù)制的分歧時間最短和最長分別在692.623和8250萬年前。分析LuPLA1基因在亞麻基因組內(nèi)部的共線性關(guān)系，顯示發(fā)生片段復(fù)制的7對LuPLA1基因存在共線性關(guān)系(圖2-A)。為進一步解析LuPLA1家族的進化機制，對單子葉植物玉米、水稻，雙子葉植物擬南芥、大豆、木薯、蓖麻與亞麻分別進行共線性分析。結(jié)果顯示分別有8個、9個、2個、1個和1個LuPLA1基因與GmPLA1、MePLA1、AtPLA1、ZmPLA1和OsMATL具有共線性，與RcPLA1無共線性，與上述作物形成的直系同源基因?qū)Ψ謩e為20對、17對、3對、2對和1對(圖2-B)。此外，LuPLA1-1、LuPLA1-7、LuPLA1-LuPLA1-9及LuPLA1-10與以上作物均無共線性，其中大部分為串聯(lián)重復(fù)基因。

  

圖1 LuPLA1基因染色體定位

  

圖2 亞麻基因組內(nèi)LuPLA1基因共線性及其與其他物種間的共線性

表1 亞麻LuPLA1基因復(fù)制分析

  

2.2 LuPLA1蛋白理化性質(zhì)分析

亞麻LuPLA1蛋白理化性質(zhì)分析如表2所示。結(jié)果表明，LuPLA1蛋白序列長度在388~1759aa之間；LuPLA1-13分子量為192.61kD，其他LuPLA1蛋白質(zhì)均在40~60kD之間；蛋白質(zhì)等電點(PI)介于5.99(LuPLA1-1)與9.19(LuPLA1-7)之間，所有LuPLA1蛋白均為親水性蛋白(附圖1)。亞細胞定位結(jié)果表明，10個LuPLA1蛋白定位于液泡，3個定位于葉綠體和液泡，還有1個定位于細胞膜和液泡(表2)。對LuPLA1蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示所有LuPLA1蛋白主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成(附圖2)。

表2 LuPLA1家族成員基本特征

  

2.3 LuPLA1家族成員系統(tǒng)進化分析

將亞麻、擬南芥、水稻、玉米、蓖麻、大豆及木薯PLA1家族成員的蛋白序列進行多序列比對并進行系統(tǒng)進化分析(圖3-A)。結(jié)果表明，PLA1家族成員可以分為四大支，各分支中均含有單子葉和雙子葉植物PLA1，且各分支成員數(shù)量具有明顯差異，其中第II分支和第III分支成員數(shù)分別為40和42個，分別含有1個和10個LuPLA1；第I分支成員最少(8個)，且無LuPLA1的存在；第IV分支成員最多(74個)，含有全部7個物種PLA1成員，且具有3個LuPLA1。LuPLA1-1、LuPLA1-5及LuPLA1-6與單倍體誘導基因ZmPLA1和OsMATL都在第IV分支[23-24]，又對亞麻、玉米及水稻PLA1家族成員單獨進行系統(tǒng)進化分析(圖3-B)，發(fā)現(xiàn)LuPLA1-1、LuPLA1-5及LuPLA1-6與單倍體誘導基因ZmPLA1和OsMATL也分布于同一分支，LuPLA1-1、LuPLA1-5及LuPLA1-6為ZmPLA1和OsMATL的同源基因，所以初步推測它們可能與單倍體誘導相關(guān)。

  

圖3 不同物種PLA1家族系統(tǒng)進化樹

2.4 LuPLA1家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)Motif分析

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，除LuPLA1-7和LuPLA1-10外，其他成員都具有內(nèi)含子且多數(shù)含有1個內(nèi)含子，其中LuPLA1-13所含內(nèi)含子最多(27個)(圖4)。結(jié)合LuPLA1系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的各成員之間具有相似的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，親緣關(guān)系較遠的各成員間內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)有明顯差異。LuPLA1蛋白保守基序分析結(jié)果表明，14個LuPLA1蛋白共鑒定到25個Motif，其中LuPLA1-13含有的Motif最少，只具有4個Motif。Motif2、Motif3和Motif8存在于所有LuPLA1成員，除LuPLA1-13外，Motif5、Motif7、Motif9和Motif12存在于其他13個LuPLA1蛋白中。整體來看，除LuPLA1-13外，其他LuPLA1成員均含有10個以上Motif(圖4)。

  

圖4 LuPLA1基因家族的系統(tǒng)進化樹、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

2.5 LuPLA1基因家族啟動子順式作用元件分析

對LuPLA1基因家族各成員啟動子順式元件進行分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，所有LuPLA1基因都含有核心元件CAAT-box、TATA-box、光響應(yīng)元件(如TCT-motif、Sp1、ATCT-motif、ACA-motif、AE-box、chsCMA1a和ACE等)、MYB結(jié)合位點(如CCAAT-box)及MYC結(jié)合位點；LuPLA1啟動子區(qū)還含有四種激素響應(yīng)元件，分別為脫落酸(ABA)響應(yīng)相關(guān)元件(如ABRE)、茉莉酸甲酯(MEJA)響應(yīng)相關(guān)元件(如CGTCAmotif，TGACG-motif)、赤霉素(GA3)響應(yīng)相關(guān)元件(如P-box、TATC-box、GARE-motif)和生長素(Auxin)響應(yīng)相關(guān)元件(如TGA-element)。此外，LuPLA1啟動子區(qū)還含有2種與逆境脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，分別為低溫響應(yīng)元件(如LTR)和干旱響應(yīng)元件(如MBS)，這2種元件均存在于10個LuPLA1中。大多數(shù)LuPLA1啟動子區(qū)含有厭氧誘導響應(yīng)元件(如ARE)，少數(shù)LuPLA1啟動子區(qū)還含有獨特的作用元件，如LuPLA1-13含有種子特異性元件(如RY-element)，LuPLA1-12含有損傷響應(yīng)元件(如WUN-motif)，LuPLA1-6含有細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)元件(如MSA-like)。

  

圖5 LuPLA1基因家族各成員啟動子區(qū)順式作用元件

2.6 LuPLA1基因表達模式分析

2.6.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析LuPLA1基因在不同品種、不同器官中的表達模式

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，除LuPLA1-1在黑亞14號果實，LuPLA1-5在黑亞14號莖中無表達外，其他基因在不同品種、不同器官中均有表達(圖6)。LuPLA1-1、LuPLA1-3、LuPLA1-7、LuPLA1-8、LuPLA1-10、LuPLA1-11、LuPLA1-12和LuPLA1-14在2個品種莖中的表達量均高于在果實中的表達量，其中LuPLA1-7、LuPLA1-8和LuPLA1-10在纖維用品種黑亞14號中的表達量高于油用品種隴亞10號；而LuPLA1-4、LuPLA1-5和LuPLA1-13在2個品種的果實中表達量均高于莖中的表達量，其中LuPLA1-5在隴亞10號中的表達量高于黑亞14號。

  

圖6 LuPLA1基因在不同品種，不同器官中的表達量熱圖

2.6.2 LuPLA1在不同發(fā)育階段種子及花藥中的表達模式

qRT-PCR分析結(jié)果(附圖3)顯示，LuPLA1-1在開花后30d種子中表達量最高，在開花后10d種子中表達量最低；LuPLA1-5和LuPLA1-6在開花后20d種子中的表達量最高，LuPLA1-5在成熟花藥中表達量最低，LuPLA1-6在未成熟花藥中表達量最低。考慮到系統(tǒng)進化分析中LuPLA1-1、LuPLA1-5、LuPLA1-6與單倍體誘導基因ZmPLA1和OsMATL為同源基因，而LuPLA1-1、LuPLA1-5、LuPLA1-6的表達模式與其同源基因ZmPLA1和OsMATL不同，初步推測PLA1在雙子葉作物與單子葉作物中具有不同的功能。

2.6.3 LuPLA1在脅迫處理下的表達模式

為進一步解析LuPLA1基因家族各成員的功能，利用qRT-PCR分析14個LuPLA1成員在非生物脅迫(IAA、NAA、GA3、NaCl、PEG、低溫、高溫)下的表達模式發(fā)現(xiàn)，除LuPLA1-13外，其余成員在逆境脅迫下均有不同程度的表達。在IAA處理下(圖7-A)，LuPLA1-1在不同時期的表達量整體高于對照，且在24h時達到最高，相較對照上調(diào)了2倍以上；LuPLA1-2/4、LuPLA1-3/11和LuPLA1-7/10的表達量較對照呈下調(diào)趨勢，且表達量整體較低；其他LuPLA1的表達量在某些特定時間高于對照，如LuPLA1-5、LuPLA1-6、LuPLA1-8/9、LuPLA1-12/14的表達量分別在處理后72h、12h、12h、24h時達到峰值，各自為對照的5.38、3.54、1.73、1.31倍，但整體較對照呈下降趨勢。

在NAA處理下(圖7-B)，LuPLA1-1的表達量在12h時差異最大，較對照上調(diào)了將近6倍，在恢復(fù)48h時表達量最低；LuPLA1-2/4、LuPLA1-7/10表達量整體低于對照；LuPLA1-3/11在3h和72h時，其表達量高于對照，其他時間段均低于對照；LuPLA1-5、LuPLA1-6和LuPLA1-8/9分別在處理后72h、6h和72h時表達量達到最高，分別為對照的3、1.7和3.5倍以上；LuPLA1-12/14在處理后48h和72h時表達量最高，為對照的3.85倍。

  

圖7 LuPLA1基因在IAA(A)和NAA(B)脅迫下的表達模式

在GA3處理下(圖8-A)，LuPLA1-1的表達量整體表現(xiàn)為上調(diào)，且在3h表達量最高，是對照的2.4倍；LuPLA1-5和LuPLA1-6表達量較對照整體也呈增長趨勢，最高可達到對照的3倍以上；LuPLA1-2/4、LuPLA1-3/11和LuPLA1-7/10的表達量在各時間段均低于對照，且最低時基本無表達；LuPLA1-8/9和LuPLA1-12/14的表達量較對照整體降低，但在有些時間段高于對照，分別在處理后48h和72h時達到峰值。

在NaCl處理下(圖8-B)，LuPLA1-1表達量在處理后12h達到峰值，為對照的1.8倍；LuPLA1-2/4的表達量在各時間段均低于對照；LuPLA1-3/11和LuPLA1-7/10的表達量呈不規(guī)律變化，分別在處理后72h時和恢復(fù)48h時達到最高，但較對照無明顯增長；LuPLA1-5、LuPLA1-6、LuPLA1-8/9和LuPLA1-12/14表達量較對照既有增長也有下降，但整體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，最高分別為對照的1.85、2.02、3.07及4.48倍。

  

圖8 LuPLA1基因在GA3(A)和NaCl(B)脅迫下的表達模式

在PEG處理下(圖9-A)，LuPLA1-1、LuPLA1-2/4和LuPLA1-6的表達量與對照相比整體呈下調(diào)趨勢，LuPLA1-3/11和LuPLA1-5的表達量僅在個別時間點較對照上調(diào)，大部分時間點均低于對照；LuPLA1-7/10的表達量較對照雖整體下調(diào)但在恢復(fù)48h時差異倍數(shù)最大，為對照的8.9倍；LuPLA1-8/9及LuPLA1-12/14表達量較對照整體呈增長趨勢，且分別在處理后6h和48h時達到峰值。

在高溫和低溫脅迫下(圖9-B)，除LuPLA1-2/4在高溫脅迫下表達量低于對照外，其余LuPLA1基因表達量均明顯高于對照。在低溫脅迫下，LuPLA1-8/9的表達量較對照差異最大，達到了對照的2906倍；在高溫脅迫下，各基因表達量較低溫脅迫差異程度較小，差異倍數(shù)均未超過百倍，其中LuPLA1-3/11的表達量較對照差異最大，差異倍數(shù)為53.6倍。

  

圖9 LuPLA1基因在PEG(A)和不同溫度(B)脅迫下的表達模式

3 討論

3.1 LuPLA1基因家族進化分析

磷脂酶在植物中普遍存在，在植物生長、發(fā)育過程中扮演著重要角色，同時也是生長素信號通路的重要調(diào)控因子，參與調(diào)控植物器官發(fā)育、形態(tài)建成和抗逆應(yīng)答等生理過程[31]。不同的磷脂酶存在于不同的組織器官，發(fā)揮不同的功能。其中，PLA1在植物非生物脅迫應(yīng)答中具有重要作用，此外，PLA1還與單倍體誘導相關(guān)[23，32]，通過對PLA1/MATL進行編輯，成功在玉米[23]、水稻[24]、小麥[25]等作物中獲得了單倍體誘導系。然而目前關(guān)于PLA1的研究主要集中在單子葉植物，在雙子葉植物中尚未有相關(guān)報道。

本研究共鑒定到14個LuPLA1基因，分布于8條染色體上。LuPLA1蛋白大多定位于液泡，表明PLA1家族成員主要在液泡中起作用。另外，保守基序分析結(jié)果顯示，Motif2、Motif3和Motif8存在于所有LuPLA1成員，說明這3個Motif是LuPLA1家族的保守基序。基因結(jié)構(gòu)分析顯示，14個LuPLA1成員中有5個含有1個內(nèi)含子，說明1個內(nèi)含子是LuPLA1基因的主要結(jié)構(gòu)形式?；驈?fù)制事件是造成基因功能多樣化及特異性的重要原因之一。LuPLA1在進化中片段復(fù)制基因占全部基因的57.1%，說明片段復(fù)制在LuPLA1基因家族擴張中起主要作用，且LuPLA1的Ka/Ks比值均小于1，說明LuPLA1家族經(jīng)歷了純化選擇，證實了其在進化過程中的保守性。共線性分析結(jié)果顯示，亞麻與雙子葉作物擬南芥、大豆、木薯間分別有3、20、17對直系同源基因，與單子葉作物玉米、水稻間分別存在2對和1對同源基因，這符合14LuPLA1與其他物種PLA1的系統(tǒng)進化關(guān)系。LuPLA1-1、LuPLA1-7、LuPLA1-8、LuPLA1-9及LuPLA1-10

在6種植物中均未鑒定到，其中80%為串聯(lián)重復(fù)基因，這些基因可能是單子葉與雙子葉植物PLA1功能差異相關(guān)基因。

3.2 LuPLA1基因具有器官特異性表達模式

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，3個LuPLA1成員(LuPLA1-1/5/6)與玉米、水稻單倍體誘導基因PLA1/MATL同在第IV支，親緣關(guān)系較近，故將LuPLA1-1/5/6作為單倍體誘導候選基因進行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示LuPLA1-1/5/6在亞麻不同時期的種子、未成熟花藥和成熟花藥中均有表達且在未成熟花藥和成熟花藥中的表達量低于其在種子中的表達量，這說明PLA1在亞麻中的表達模式與其在玉米、水稻、小麥中的表達模式不同，初步推測PLA1在雙子葉作物與單子葉作物中具有不同的功能，但其在雙子葉作物中的具體功能還有待進一步研究。此外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，有8個LuPLA1基因在2個品種莖中的表達量均大于果實中的表達量，其中LuPLA1-7、LuPLA1-8和LuPLA1-10在纖維品種中的表達量高于油用品種，初步推測其可能與莖的生長發(fā)育相關(guān)；而有3個基因在果實中的表達量較高，特別是LuPLA1-5在油用品種隴亞10號中的表達量高于黑亞14號，初步推測它與果實發(fā)育或脂肪酸含量相關(guān)。

3.3 LuPLA1基因參與調(diào)控亞麻對非生物脅迫的響應(yīng)

基因表達通常受其上游啟動子序列中順式元件的調(diào)控，這些順式元件調(diào)節(jié)不同環(huán)境條件下基因的表達行為[33]。因此，本研究對LuPLA1啟動子順式元件進行分析發(fā)現(xiàn)，LuPLA1家族成員均具有與光響應(yīng)相關(guān)的順式元件，大多成員還具有干旱響應(yīng)、低溫響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)等相關(guān)元件。此外，部分家族成員具有獨特的順式作用元件。為判斷啟動子順式元件分析的準確性，利用qRT-PCR分析LuPLA1家族成員在非生物脅迫下的表達模式。結(jié)果表明，在IAA處理下，LuPLA1-1的表達量較對照整體呈增長趨勢，且最大差異倍數(shù)為2.19倍，推測其與IAA響應(yīng)相關(guān)。相同的，在NAA處理下，LuPLA1-1和LuPLA1-6表達量較對照上調(diào)，最高分別為對照的2.56和1.76倍，推測這2個基因參與亞麻生長發(fā)育中NAA的調(diào)控；GA3處理下，LuPLA1-1、LuPLA1-5和LuPLA1-6較對照明顯上調(diào)，推測其可能參與GA3調(diào)控；LuPLA1-12/14的表達量在NaCl和PEG處理下整體呈上調(diào)趨勢，最大差異倍數(shù)分別為4.48和2.64倍，推測LuPLA1-12/14可能受NaCl和PEG誘導表達；低溫和高溫脅迫下，除LuPLA1-2/4在高溫脅迫下表達量低于對照外，所有LuPLA1基因在高溫、低溫脅迫下表達量均高于對照且差異倍數(shù)較大，最大達到了2000倍以上，表明LuPLA1基因與低溫和高溫響應(yīng)相關(guān)。總的來說，在不同脅迫處理下各成員具有不同的表達模式，表明這些基因參與調(diào)控亞麻對激素和非生物逆境脅迫的響應(yīng)，與順式作用元件分析結(jié)果一致，但具體功能還需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究在亞麻基因組中共鑒定到14個LuPLA1家族成員，對其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件、種內(nèi)和種間共線性關(guān)系、基因復(fù)制事件及表達模式等進行分析發(fā)現(xiàn)，LuPLA1基因含有激素及逆境脅迫相關(guān)作用元件，且在不同處理下LuPLA1基因家族各成員具有不同的表達模式，LuPLA1-1、LuPLA1-5、LuPLA1-6與單倍體誘導基因ZmPLA1/OsMATL表達模式不同。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)LuPLA1-7、LuPLA1-8和LuPLA1-10與LuPLA15可能分別參與莖和果實生長發(fā)育的調(diào)控。

 

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附表 1qRT-PCR引物

  

附表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)登錄號

  

  

附圖1 亞麻PLA1家族成員的親水性與疏水性預(yù)測

  

附圖2 LuPLA1基因編碼的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

  

附圖3 LuPLA1基因在隴亞15號不同時期種子及花藥中的表達模式

 

文章摘自：趙麗蓉，李雯，王利民等.亞麻PLA1基因家族的鑒定及表達分析[J/OL].作物學報：1-20[2023-05-31].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230519.1811.002.html.