摘 要：本發(fā)明公開了一種羅布麻提取物的制備方法，包括：步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過20～40目篩，得羅布麻粉末備用；步驟二、用體積濃度50～70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2～3次，離心得濾液和濾渣；步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50～70℃酶解2～3h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1～4％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3～6；步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70～90％的堿性乙醇溶液在50～60℃下回流提取2～3次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物。本發(fā)明總黃酮收率最高可達4.31％，其中槲皮素含量占羅布麻粗提物71.32％。
權(quán)利要求書
1.羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，包括：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過20～40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度50～70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2～3次，離心得濾液和濾渣；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50～70℃酶解2～3h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1～4％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3～6；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70～90％的堿性乙醇溶液在50～60℃下回流提取2～3次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物。
2.如權(quán)利要求1所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，步驟一中所述預(yù)處理具體為：
第一步、將羅布麻葉低溫冷凍至脆化；
第二步、將脆化后的羅布麻葉干燥至含水率不超過15～25％；
第三步、將干燥過的羅布麻葉在0.01～0.1MPa的壓力條件下超低壓爆破，其中低溫冷凍的溫度范圍為 40℃～ 20℃。
3.如權(quán)利要求2所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，步驟一中羅布麻葉經(jīng)粉末化后先用石油醚浸泡12～24h，干燥后過20～40目篩。
4.如權(quán)利要求3所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，還包括對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15～25％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
5.如權(quán)利要求所述4的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，所述酸性乙醇溶液和堿性乙醇溶液中還加有氫鍵給體。
6.如權(quán)利要求5所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，所述氫鍵給體為甘油。
7.如權(quán)利要求6所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，步驟二所述酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為5～6的溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，步驟四中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8～10的溶液。
9.如權(quán)利要求8所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂的型號為D101、D130、AB8和NKA中的一種。
10.如權(quán)利要求1所述的羅布麻提取物的制備方法，其特征在于，步驟二中羅布麻粉末和酸性乙醇溶液的料液比(w/v)為1：20～25；步驟四中堿性乙醇溶液的體積是步驟二中酸性乙醇溶液體積的2～3倍。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及天然植物提取物的制備領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種羅布麻提取物的制備方法。
背景技術(shù)
羅布麻，別稱紅麻、茶葉花、紅柳子等，為夾竹桃科羅布麻屬直立半灌木，其生長環(huán)境主要是鹽堿荒地、沙漠邊緣及河流兩岸、沖積平原、湖泊周圍、戈壁荒灘上，在我國主要分布于華北、西北及吉林、遼寧、山東、江蘇、安徽、河南等地。羅布麻除了其莖桿中的纖維可用作高檔紡織原料外，其葉中富含黃酮，黃酮能清除心血管中垃圾和自由基，去除細菌、寄生蟲，修復(fù)呼吸道組織和皮膚受損組織，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，修復(fù)機體組織，促進新陳代謝，平衡機體內(nèi)營養(yǎng)、快速降低血糖，而槲皮素是黃酮類化學(xué)物家族中具有重要價值的一種成分，其在羅布麻葉中含量尤其豐富，且槲皮素具有特殊的抗氧化、抗發(fā)炎、抗過敏、抗病毒、清除自由基和調(diào)節(jié)免疫活性的功效?，F(xiàn)有提取技術(shù)對羅布麻葉中總黃酮以及槲皮素的提取率低，存在很大的改進空間。
申請?zhí)枮?/font>201911283088.1、名稱為一種基于羅布麻組合藥物成分的提取方法的發(fā)明專利中，其黃酮總提取率最高為2.75％；申請?zhí)枮?00510123187.5、名稱為羅布麻屬植物羅布麻葉總黃酮提取物、其制備及應(yīng)用的發(fā)明專利中，其一個實施例中羅布麻葉總黃酮提取物A收得率為1.2％，其中槲皮素含量為2.07％，羅布麻葉總黃酮提取物B收得率為0.6％，其中槲皮素2.95％；另一實施例中羅布麻葉總黃酮提取物A收得率為1.7％，其中槲皮素含量為0.87％，羅布麻葉總黃酮提取物B收得率為0.4％，其中槲皮素1.5％；第三實施例中羅布麻葉總黃酮提取物A收得率為1.4％，其中槲皮素含量為2.6％，羅布麻葉總黃酮提取物B收得率為0.65％，其中槲皮素2.1％。相對于羅布麻葉中總黃酮含量和槲皮素含量，現(xiàn)有提取方法的收率低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種羅布麻提取物的制備方法，其總黃酮收率最高可達4.31％，其中槲皮素含量占羅布麻粗提物71.32％。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種羅布麻提取物的制備方法，包括：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過20～40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度50～70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2～3次，離心得濾液和濾渣；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50～70℃酶解2～3h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1～4％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3～6；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70～90％的堿性乙醇溶液在50～60℃下回流提取2～3次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物。
優(yōu)選的是，步驟一中所述預(yù)處理具體為：
第一步、將羅布麻葉低溫冷凍至脆化；
第二步、將脆化后的羅布麻葉干燥至含水率不超過15～25％；
第三步、將干燥過的羅布麻葉在0.01～0.1MPa的壓力條件下超低壓爆破，其中低溫冷凍的溫度范圍為 40℃～ 20℃。
優(yōu)選的是，步驟一中羅布麻葉經(jīng)粉末化后先用石油醚浸泡12～24h，干燥后過20～40目篩。
優(yōu)選的是，所述羅布麻提取物的制備方法還包括對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15～25％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
優(yōu)選的是，所述酸性乙醇溶液和堿性乙醇溶液中還加有氫鍵給體。
優(yōu)選的是，所述氫鍵給體為甘油。
優(yōu)選的是，步驟二所述酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為5～6的溶液。
優(yōu)選的是，步驟四中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8～10的溶液。
優(yōu)選的是，所述大孔樹脂的型號為D101、D130、AB8和NKA中的一種。
優(yōu)選的是，步驟二中羅布麻粉末和酸性乙醇溶液的料液比(w/v)為1：20～25；步驟四中堿性乙醇溶液的體積是步驟二中酸性乙醇溶液體積的2～3倍。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
其一、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法所得總黃酮收率最高可達4.31％，其中槲皮素含量占羅布麻粗提物71.32％；
其二、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法中首次提出酸性乙醇和堿性乙醇梯度提取法，極大地提高了羅布麻葉中總黃酮和槲皮素的提取率；
其三、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法中提出利用生物酶將蘆丁轉(zhuǎn)化成槲皮素，進而提高羅布麻葉提取物中槲皮素的含量；
其四、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法中通過添加可食用尼泊金酯鈉既可以達到提高提取率的作用，又可以滅掉在先步驟中添加的酶的活性，還可以延長羅布麻提取物的貯藏效期。
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。本發(fā)明的常溫為《中華人民共和國藥典》規(guī)定的10～30℃。
實施例1
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
實施例2
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；其中，所述預(yù)處理步驟為：
第一步、將羅布麻葉低溫冷凍至脆化；
第二步、將脆化后的羅布麻葉干燥至含水率不超過15％；
第三步、將干燥過的羅布麻葉在0.01MPa的壓力條件下超低壓爆破，其中低溫冷凍的溫度范圍為 40℃；
步驟二、用體積濃度70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
實施例3
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化后，用石油醚浸泡12h，干燥后過40目篩，得羅布麻粉末備用；其中，所述預(yù)處理步驟為：
第一步、將羅布麻葉低溫冷凍至脆化；
第二步、將脆化后的羅布麻葉干燥至含水率不超過15％；
第三步、將干燥過的羅布麻葉在0.01MPa的壓力條件下超低壓爆破，其中低溫冷凍的溫度范圍為 40℃；
步驟二、用體積濃度70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
實施例4
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化后，用石油醚浸泡12h，干燥后過40目篩，得羅布麻粉末備用；其中，所述預(yù)處理步驟為：
第一步、將羅布麻葉低溫冷凍至脆化；
第二步、將脆化后的羅布麻葉干燥至含水率不超過15％；
第三步、將干燥過的羅布麻葉在0.01MPa的壓力條件下超低壓爆破，其中低溫冷凍的溫度范圍為 40℃；
步驟二、用體積濃度70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液，且酸性乙醇溶液和還加有氫鍵給體甘油；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液，且堿性乙醇溶液和還加有氫鍵給體甘油；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
實施例5
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化后，用石油醚浸泡24h，干燥后過20目篩，得羅布麻粉末備用；其中，所述預(yù)處理步驟為：
第一步、將羅布麻葉低溫冷凍至脆化；
第二步、將脆化后的羅布麻葉干燥至含水率不超過25％；
第三步、將干燥過的羅布麻葉在0.1MPa的壓力條件下超低壓爆破，其中低溫冷凍的溫度范圍為 20℃；
步驟二、用體積濃度50％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末3次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為5的溶液，且酸性乙醇溶液和還加有氫鍵給體甘油；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在70℃酶解3h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的4％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：6；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為90％的堿性乙醇溶液在50℃下回流提取3次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為10的溶液，且堿性乙醇溶液和還加有氫鍵給體甘油；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的25％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
對比例1
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度70％的乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末4次，離心得濾液和濾渣；取濾液即為羅布麻粗提物；
步驟三、對步驟二所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
對比例2
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液；
步驟三、將步驟二所得濾渣用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟四、對步驟三所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
對比例3
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度70％乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70％的乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
對比例4
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液；
步驟三、將步驟二所得濾渣采用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液并合并；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟四、向步驟三所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟五、對對步驟三所得合并液和步驟四所得酶解液精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將對步驟三所得合并液和步驟四所得酶解液減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
對比例5
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、用體積濃度70％的堿性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟一所得羅布麻粉末2次，離心得濾液和濾渣；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟三、向步驟二所得濾渣中加入果膠酶、纖維素酶和沒過濾渣的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
步驟四、將步驟三酶解質(zhì)用體積濃度為70％的酸性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
對比例6
羅布麻提取物的制備方法如下：
步驟一、將羅布麻葉預(yù)處理后經(jīng)粉末化過40目篩，得羅布麻粉末備用；
步驟二、向羅布麻粉末中加入果膠酶、纖維素酶和沒過羅布麻粉末的蒸餾水在50℃酶解2h得酶解質(zhì)，其中果膠酶和纖維素酶的總量為羅布麻粉末質(zhì)量的1％，果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：3；
步驟三、用體積濃度70％的酸性乙醇溶液在常溫下回流提取步驟二所得酶解質(zhì)2次，離心得濾液和濾渣；其中酸性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加稀鹽酸至pH為6的溶液；
步驟四、將步驟三所得濾渣用體積濃度為70％的堿性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，離心取上層清液，即為羅布麻粗提物；其中堿性乙醇溶液是通過向乙醇溶液中加尼泊金酯鈉至pH為8的溶液；
步驟五、對步驟四所得羅布麻粗提物精制得羅布麻提取物的步驟，具體為：將步驟四所得羅布麻粗提物減壓濃縮至原體積的15％，再將濃縮液上大孔樹脂柱用水洗脫至洗脫液澄清，最后收集洗脫液，回收乙醇后干燥得羅布麻提取物。
計算實施例1～5和對比例1～3中總黃酮的收率和羅布麻提取物中槲皮素含量。其中槲皮素含量的測定方法如下：供試品溶液的制備：精確稱取實施例1～5和對比例1～3所得羅布麻提取物10mg于50mL量瓶中，加入80％的甲醇溶解定容，取10mL溶解液加入1mL鹽酸回流水解1h后，定容至20mL得供試液，備用。
色譜條件：固定相ODS柱(4.6mmI.D.╳150mm，5μm)；流動相：甲醇：0.4％磷酸(50：50)；流速：1mL/min；檢測波長360nm；進樣量：10～20μl，所得HPLC圖譜中保留時間(min)為10的為槲皮素。
總黃酮收率的測定方法如下：對照樣品溶液制備：精確稱取金絲桃苷對照品(120℃下減壓干燥至恒重)適量，用甲醇配置成1mL含0.06mg的溶液。
供試品溶液的制備：精確稱取實施例1～5和對比例1～3所得羅布麻提取物10mg于50mL量瓶中，加入80％的甲醇溶解定容，備用。
測定方法：取對照樣品溶液和供試品溶液，置于10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，經(jīng)AlCl3和乙酸鈉顯色后，按分光光度法，在400nm處測定吸光度，利用對照樣品繪制線性回歸曲線，從而計算供試品中溶液中總黃酮的含量，再進一步計算總黃酮的收率。所得結(jié)果如表1所示。
表1總黃酮的收率及槲皮素含量數(shù)據(jù)
相對于實施例1的制備方法，實施例2的制備方法中增加了冷凍和低壓爆破的預(yù)處理步驟，實施例3的制備方法相對與實施例2的制備方法又增加了對羅布麻粉末用石油醚浸泡的步驟，實施例4的制備方法相對于實施例3的制備方法又增加了在酸性乙醇溶液和堿性乙醇溶液中增加氫鍵給體甘油的步驟。對比例1的制備方法采用普通乙醇提取代替酸性乙醇和堿性乙醇梯度變化提取，同時缺少酶提取的步驟；對比例2缺少酶提取的步驟，對比例3采用普通乙醇提取代替酸性乙醇和堿性乙醇梯度變化提取。
如表1結(jié)果可以看出，總黃酮收率結(jié)果為實施例5的收率與實施例4的收率相當(dāng)，并遠遠大于實施例1～3，而實施例3的收率〉實施例2的收率〉實施例1的收率〉對比例2的收率〉對比例3的收率〉對比例1的收率。由此可以得出如下結(jié)論：
1、實施例1所得總黃酮收率遠遠大于與對比例3所得總黃酮收率，這是因為酸性乙醇和堿性乙醇梯度提取方法有利于黃酮類化合物的分離滲出，酸性乙醇和堿性乙醇使得溶劑的性質(zhì)產(chǎn)生了梯度的變化，使得黃酮類化合物在溶劑中的擴散度增加，從而使其分離滲出量更大；并且酸性乙醇和堿性乙醇對黃酮類化合物具有助溶作用，有利于黃酮類化合物的滲出。
2、實施例1所得總黃酮收率遠遠大于對比例2所得總黃酮收率，這是因為，一方面酶將羅布麻葉中不易分離的蘆丁轉(zhuǎn)換成了槲皮素，從而增加了總黃酮的得率，另一方面酶對羅布麻細胞內(nèi)的大分子的水解作用促進了有效成分的釋放。
3、實施例1所得總黃酮收率遠遠大于對比例1所得總黃酮收率，對比例1采用常規(guī)乙醇提取，黃酮類化合物的溶解度和擴散度低，不能有效分離滲出。
4、實施例2所得總黃酮收率大于實施例1所得總黃酮收率，這是因為實施例2增加了冷凍和低壓爆破的預(yù)處理步驟，使得植物的細胞膜預(yù)先被破壞，從而有利于有效成分的析出。
5、實施例3所得總黃酮收率大于實施例1所得總黃酮收率，這是因為實施例3預(yù)先去除了羅布麻中的脂肪成分，增加了羅布麻與溶劑之間的摩擦。
6、實施例4和實施例5所得總黃酮收率大于實施例1所得總黃酮收率，是因為氫鍵給體可以與羅布麻這兩個電負性大且半徑小的核形成氫鍵，通過氫鍵的作用使得有效成分以團狀被釋放。
如表1結(jié)果可以看出，實施例1～5槲皮素的含量有微小差別，但實施例1～5相對于對比例1～3而言，其槲皮素的含量有明顯優(yōu)勢。這證明酸堿梯度乙醇溶液結(jié)合酶有利于更多的槲皮素釋放。為驗證酸堿梯度乙醇溶液提取法和酶制劑提取法的順序?qū)﹂纹に睾康挠绊?，本申請進一步考察了酸堿梯度乙醇溶液提取法和酶制劑提取法不同提取順序所得總黃酮收率和槲皮素含量，計算實施例1和對比例4～6中所得羅布麻提取物中總黃酮的收率和槲皮素含量，所得結(jié)果如表2所示。
表2總黃酮的收率及槲皮素含量數(shù)據(jù)
由表2可知，實施例1所得總黃酮收率和槲皮素含量均高于對比例4～6，由此可見，酸堿梯度乙醇溶液提取法和酶制劑提取法的順序?qū)傸S酮收率和槲皮素含量均有影響，其優(yōu)先順序為本申請所公開的酸性乙醇回流提取 酶制劑提取 堿性乙醇回流提取。首先通過酸性乙醇的穿透能力強，率先將大部分的親水性黃酮類化合物釋放出來，再通過酶制劑將部分蘆丁轉(zhuǎn)換成槲皮素，獲得更多的槲皮素，最后通過堿性乙醇先滅酶，同時堿性乙醇具有更強的分散性，有利于黃酮類化合物的進一步擴散而釋放。
這里說明的設(shè)備數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明的。對本發(fā)明羅布麻提取物制備方法的應(yīng)用、修改和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明至少包括以下有益效果：
其一、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法所得總黃酮收率最高可達4.31％，其中槲皮素含量71.32％；
其二、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法中首次提出酸性乙醇和堿性乙醇梯度提取法，極大地提高了羅布麻葉中總黃酮和槲皮素的提取率；
其三、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法中提出利用生物酶將蘆丁轉(zhuǎn)化成槲皮素，進而提高羅布麻葉提取物中槲皮素的含量；
其四、本發(fā)明提供的羅布麻提取物的制備方法中通過添加可食用尼泊金酯鈉既可以達到提高提取率的作用，又可以滅掉在先步驟中添加的酶的活性，還可以延長羅布麻提取物的貯藏效期。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的具體實施例。
摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：張春穎，許波，楊旭錦，申請?zhí)?/font>：202310050031.7，申請日：2023.02.01
