摘 要：本發(fā)明提供了一種具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法，包括以下步驟：A)采用黑曲霉孢子懸液對羅布紅麻進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵后的羅布紅麻；B)將發(fā)酵后的羅布紅麻依次進(jìn)行醇提以及分離純化，得到羅布紅麻提取物。本發(fā)明選用黑曲霉對羅布紅麻進(jìn)行發(fā)酵處理，黑曲霉在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生豐富的酶類物質(zhì)，一方面，這些酶類有利于壁內(nèi)有效成分的提取，可以提高有效成分的物質(zhì)含量，另一方面，相關(guān)的糖苷水解酶類可以水解相關(guān)的糖苷衍生物，獲得具有更高藥效活性的苷元類物質(zhì)。同時根據(jù)分子的極性大小，利用不同極性的有機(jī)溶劑可以提純某類生物活性物質(zhì)，比如多酚、黃酮類物質(zhì)，從而使各種藥理活性得到顯著提高。
權(quán)利要求書
1.一種具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
A)采用黑曲霉孢子懸液對羅布紅麻進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵后的羅布紅麻；
B)將發(fā)酵后的羅布紅麻依次進(jìn)行醇提以及分離純化，得到羅布紅麻提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟B)包括以下步驟：
B1)將所述發(fā)酵后的羅布紅麻干燥后研磨，得到干燥后的粉末；將所述干燥后的粉末進(jìn)行乙醇醇提，得到羅布紅麻醇提液；
B2)將所述羅布紅麻醇提液濃縮后依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分別得到石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分；將所述石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分濃縮干燥，得到羅布紅麻石油醚提取物、羅布紅麻乙酸乙酯提取物以及羅布紅麻水提物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述黑曲霉懸液按照如下方法進(jìn)行制備：將所述黑曲霉孢子粉溶于無菌水中，然后用脫脂棉進(jìn)行過濾，得到黑曲霉孢子懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述固態(tài)發(fā)酵的方法包括以下步驟：向滅菌后的羅布紅麻中加入無菌水，再接入黑曲霉孢子懸液，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；所述滅菌后的羅布紅麻、無菌水以及黑曲霉孢子懸液的質(zhì)量體積比為(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL；所述黑曲霉孢子懸液的濃度為1g：200～400mL；所述固態(tài)發(fā)酵的溫度為25～30℃，時間為3～7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述乙醇醇提的同時進(jìn)行超聲；
所述醇提所用的醇為乙醇溶液，乙醇溶液的體積濃度為60％～80％，所述干燥后的粉末與乙醇溶液的質(zhì)量體積比為1：10～1：20；
所述超聲的功率為450～500W，時間為1～2h；
所述乙醇醇提后進(jìn)行離心，收集上清液，然后將上清液進(jìn)行過濾，得到羅布紅麻醇提液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟B2)中，所述濃縮為去除乙醇；
每次進(jìn)行萃取時，所述羅布紅麻醇提液與萃取所用的有機(jī)溶劑的體積比為1：1～1：2；所述萃取的次數(shù)為三次或三次以上。
7.一種如權(quán)利要求1～6任意一項所述的制備方法制備得到的羅布紅麻提取物。
8.一種如權(quán)利要求7所述的羅布紅麻提取物在制備具有降三高功效的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求7所述的羅布紅麻提取物在制備胰脂肪酶抑制劑、α 葡萄糖苷酶抑制劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中的應(yīng)用。
10.一種如權(quán)利要求7所述的羅布紅麻提取物在制備具有抗氧化功效的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取和醫(yī)藥術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有降三高功能的羅布紅麻提取物及其制備方法以及應(yīng)用。
背景技術(shù)
羅布紅麻(Apocynum venetum L.)為捩花目夾竹桃科羅布紅麻屬直立半灌木，葉、根、莖、花、全草均可入藥，屬于多年生宿根草本植物，具有很強(qiáng)的抗逆性。從每年3月下旬開始，到4月中旬左右，羅布紅麻便開始萌芽生長，在5月下旬到6月中旬期間進(jìn)入開花初期，大約在8月下旬至9月中旬進(jìn)入開花末期，通常情況下花期持續(xù)周期長達(dá)90天，此時種子便進(jìn)入到成熟期，年生長周期大約有180天，作為藥用植物被收錄在《中國藥典(2015版)》一部。羅布紅麻因羅布泊而得名，在古代被稱為“澤漆”，主要分布于中國遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、陜西、山西等地區(qū)?！蛾兾髦胁菟帯份d：“(羅布紅麻葉)清涼瀉火，強(qiáng)心利尿，降血壓。治心臟病，高血壓，神經(jīng)衰弱，腎炎浮腫”。大量藥理實驗表明，羅布紅麻活性成分對預(yù)防和治療如高血壓、高血脂、冠心病等心血管疾病以及哮喘病、氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病有較好的療效。但是，目前羅布紅麻的提取方法得到的羅布紅麻提取物中有效成分含量較低，功效有限。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法，本發(fā)明提供的方法可以顯著提高羅布紅麻提取物中有效成分的物質(zhì)含量，從而使各種藥理活性得到顯著提高。
本發(fā)明提供了一種具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法，包括以下步驟：
A)采用黑曲霉孢子懸液對羅布紅麻進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵后的羅布紅麻；
B)將發(fā)酵后的羅布紅麻依次進(jìn)行醇提以及分離純化，得到羅布紅麻提取物。
優(yōu)選的，步驟B)包括以下步驟：
B1)將所述發(fā)酵后的羅布紅麻干燥后研磨，得到干燥后的粉末；
將所述干燥后的粉末進(jìn)行乙醇醇提，得到羅布紅麻醇提液；
B2)將所述羅布紅麻醇提液濃縮后依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分別得到石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分；
將所述石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分濃縮干燥，得到羅布紅麻石油醚提取物、羅布紅麻乙酸乙酯提取物以及羅布紅麻水提物。
優(yōu)選的，所述黑曲霉懸液按照如下方法進(jìn)行制備：
將所述黑曲霉孢子粉溶于無菌水中，然后用脫脂棉進(jìn)行過濾，得到黑曲霉孢子懸液。
優(yōu)選的，所述固態(tài)發(fā)酵的方法包括以下步驟：
向滅菌后的羅布紅麻中加入無菌水，再接入黑曲霉孢子懸液，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；
所述滅菌后的羅布紅麻、無菌水以及黑曲霉孢子懸液的質(zhì)量體積比為(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL；
所述黑曲霉孢子懸液的濃度為1g：200～400mL；
所述固態(tài)發(fā)酵的溫度為25～30℃，時間為3～7天。
優(yōu)選的，所述乙醇醇提的同時進(jìn)行超聲；
所述醇提所用的醇為乙醇溶液，乙醇溶液的體積濃度為60％～80％，所述干燥后的粉末與乙醇溶液的質(zhì)量體積比為1：10～1：20；
所述超聲的功率為450～500W，時間為1～2h；
所述乙醇醇提后進(jìn)行離心，收集上清液，然后將上清液進(jìn)行過濾，得到羅布紅麻醇提液。
優(yōu)選的，步驟B2)中，所述濃縮為去除乙醇；
每次進(jìn)行萃取時，所述羅布紅麻醇提液與萃取所用的有機(jī)溶劑的體積比為1：1～1：2；
所述萃取的次數(shù)為三次或三次以上。
本發(fā)明還提供了一種上述制備方法制備得到的羅布紅麻提取物。
本發(fā)明還提供了一種上述羅布紅麻提取物在制備具有降三高功效的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種上述羅布紅麻提取物在制備胰脂肪酶抑制劑、α 葡萄糖苷酶抑制劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種上述羅布紅麻提取物在制備具有抗氧化功效的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法，包括以下步驟：A)采用黑曲霉孢子懸液對羅布紅麻進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵后的羅布紅麻；B)將發(fā)酵后的羅布紅麻依次進(jìn)行醇提以及分離純化，得到羅布紅麻提取物。本發(fā)明選用黑曲霉對羅布紅麻進(jìn)行發(fā)酵處理，黑曲霉在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生豐富的酶類物質(zhì)，如纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶等，一方面，這些酶類有利于壁內(nèi)有效成分的提取，可以提高有效成分的物質(zhì)含量，另一方面，相關(guān)的糖苷水解酶類可以水解相關(guān)的糖苷衍生物，獲得具有更高藥效活性的苷元類物質(zhì)。同時根據(jù)分子的極性大小，利用不同極性的有機(jī)溶劑可以提純某類生物活性物質(zhì)，比如多酚、黃酮類物質(zhì)，從而使各種藥理活性得到顯著提高。
附圖說明
圖1為本發(fā)明提供的具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法的工藝流程圖；
圖2為黑曲霉發(fā)酵6天后羅布紅麻不同組分抗氧化能力比較；
圖3為黑曲霉發(fā)酵前后，羅布紅麻醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分對胰脂肪酶的抑制活性；
圖4為黑曲霉發(fā)酵6天后羅布紅麻不同組分抗氧化能力比較。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法，包括以下步驟：
A)采用黑曲霉孢子懸液對羅布紅麻進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵后的羅布紅麻；
B)將發(fā)酵后的羅布紅麻依次進(jìn)行醇提以及分離純化，得到羅布紅麻提取物。
本發(fā)明首先制備黑曲霉孢子懸液，所述黑曲霉懸液按照如下方法進(jìn)行制備：
將所述黑曲霉孢子粉溶于無菌水中，然后用脫脂棉進(jìn)行過濾，得到黑曲霉孢子懸液。
其中，所述黑曲霉孢子粉與無菌水的質(zhì)量體積比為1g：(200～400)mL，優(yōu)選為1g：200mL、1g：300mL、1g：400mL，或1g：(200～400)mL之間的任意值。
得到黑曲霉孢子懸液后，采用黑曲霉孢子懸液對羅布紅麻進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵后的羅布紅麻。
具體的，向滅菌后的羅布紅麻中加入無菌水，再接入黑曲霉孢子懸液，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；
其中，對所述羅布紅麻進(jìn)行滅菌的方法和條件并沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的滅菌方法和條件即可。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用121℃，20min的滅菌條件。
所述滅菌后的羅布紅麻、無菌水以及黑曲霉孢子懸液的質(zhì)量體積比為(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL，優(yōu)選為3g：5mL：2mL，或(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL之間的任意值；
所述黑曲霉孢子懸液的濃度為1g：200～400mL，優(yōu)選為1g：200mL、1g：300mL、1g：400mL，或1g：(200～400)mL之間的任意值；
所述固態(tài)發(fā)酵的溫度為25～30℃，優(yōu)選為25、26、27、28、29、30，或25～30℃之間的任意值，時間為3～7天，優(yōu)選為3、4、5、6、7，或3～7天之間的任意值。
接著，將發(fā)酵后的羅布紅麻依次進(jìn)行醇提以及分離純化，得到羅布紅麻提取物。
具體的，包括以下步驟：
B1)將所述發(fā)酵后的羅布紅麻干燥后研磨，得到干燥后的粉末；
將所述干燥后的粉末進(jìn)行乙醇醇提，得到羅布紅麻醇提液；
B2)將所述羅布紅麻醇提液濃縮后依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分別得到石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分；
將所述石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分濃縮干燥，得到羅布紅麻石油醚提取物、羅布紅麻乙酸乙酯提取物以及羅布紅麻水提物。
本發(fā)明先將發(fā)酵后的羅布紅麻干燥后研磨。其中，所述干燥優(yōu)選為冷凍干燥，干燥后研磨成粉末，再置于烘箱中烘干至恒重。
然后，將干燥后的粉末與乙醇溶液混合進(jìn)行醇提，在進(jìn)行醇提的同時進(jìn)行超聲。
其中，所述乙醇溶液的體積濃度為60％～80％，優(yōu)選為60％、65％、70％、75％、80％，或60％～80％之間的任意值，所述干燥后的粉末與乙醇溶液的質(zhì)量體積比為1：10～1：20，優(yōu)選為1：10、1：15、1：20，或1：10～1：20之間的任意值；
所述超聲的功率為450～500W，優(yōu)選為450、460、470、480、490、500，或450～500W之間的任意值，時間為1～2h；
所述乙醇醇提后進(jìn)行離心，收集上清液，然后將上清液進(jìn)行過濾，得到羅布紅麻醇提液。
然后，將所述羅布紅麻醇提液濃縮后依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分別得到石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分。
其中，將所述羅布紅麻醇提液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在50℃下將乙醇揮發(fā)掉，得到濃縮液。按照溶劑極性有小到大，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取濃縮液，每次萃取有機(jī)溶劑與樣品體積比例均為1：1～1：2，每個組分萃取重復(fù)三次或以上，依次得到石油醚組分(PE)、乙酸乙酯組分(EA)和水組分。
將所述石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分濃縮干燥，得到羅布紅麻石油醚提取物、羅布紅麻乙酸乙酯提取物以及羅布紅麻水提物。
本發(fā)明對所述濃縮干燥的方法并沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法即可。在本發(fā)明中，所述干燥優(yōu)選為冷凍干燥。
參見圖1，圖1為本發(fā)明提供的具有降三高功能的羅布紅麻提取物的制備方法的工藝流程圖。
本發(fā)明還提供了一種上述制備方法制備得到的羅布紅麻提取物。
本發(fā)明還提供了一種上述羅布紅麻提取物在制備具有降三高功效的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種上述羅布紅麻提取物在制備胰脂肪酶抑制劑、α 葡萄糖苷酶抑制劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種上述羅布紅麻提取物在制備具有抗氧化功效的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明選用黑曲霉對羅布紅麻進(jìn)行發(fā)酵處理，可以有效降低一些天然產(chǎn)物本身固有的毒性，在發(fā)酵過程也可以酶解藥材細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，更充分的釋放天然產(chǎn)物的有效成分，提高其利用率。微生物在發(fā)酵過程中，亦會產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，其中就包括多種生物酶，可以有效的把蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子分解為分子量較小的物質(zhì)，發(fā)酵后的發(fā)酵液可以提高有效成分的物質(zhì)含量，從而使各種藥理活性得到顯著提高。此外，本發(fā)明提供的方法還具有成本低、不易致敏。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具有降三高功能的羅布紅麻提取物及其制備方法以及應(yīng)用進(jìn)行說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受以下實施例的限制。
實施例
1.1菌種
食品級黑曲霉(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心CICC 2339)，米曲霉(中國普通微生物菌種保存中心，CGMCC 3.7202)和紅曲霉(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保存中心，ACCC30345)。
1.2菌株純化
將黑曲霉、米曲霉和紅曲霉孢子粉分別溶于無菌水中，400mL水中加菌種1g，然后用脫脂棉過濾，除去不溶的大顆粒孢子，制備均一的孢子懸液，用于后續(xù)的固態(tài)發(fā)酵。
1.3固態(tài)發(fā)酵
采用1.2中的孢子懸液對羅布紅麻(來源于新疆尉犁縣)進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵，稱取滅菌(121℃，20min)好的3g羅布紅麻置于一次性培養(yǎng)皿中，加入5mL無菌水，再接入2mL黑曲霉孢子懸液，30℃下發(fā)酵6d，其中未接入2mL孢子懸液作為對照組。
1.4.羅布紅麻醇提與粗分離純化
將1.3中的對照樣與發(fā)酵樣置于冷凍干燥機(jī)中，干燥1d，取出后用研缽磨成粉末，置于烘箱中50℃烘干至恒重。準(zhǔn)確稱取1g烘干后的樣品粉末于50mLEP管中，加入20mL70％的乙醇溶液浸沒樣品，將離心管置于超聲儀中，500W超聲1h，8000rpm離心10min，收集上清液。樣品提取液用0.45μm孔徑濾膜過濾，收集的濾液即為羅布紅麻醇提液。每個樣品提取工序重復(fù)3次。
1.5羅布紅麻醇提液的粗分離純化
將步驟1.4中的醇提液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在50℃下將乙醇揮發(fā)掉，得到濃縮液。按照溶劑極性有小到大，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取濃縮液，每次萃取有機(jī)溶劑與樣品比例均為1：1，每個組分萃取重復(fù)三次或以上，依次得到石油醚組分(PE)、乙酸乙酯組分(EA)和水組分。
1.6固體樣品制備
將步驟1.5中各組分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至相應(yīng)溶劑至1 2mL(其中除了水組分在60℃下旋蒸外，其余溫度均為50℃)。將剩余的濃縮液收集至10mLEP管中，其中粗提物和水組分于 80℃下預(yù)先凍存。將凍好的固體于冷凍干燥機(jī)中2 3d，得到相應(yīng)組分的凍干粉，后置于烘箱中烘干至恒重。而石油醚組分和乙酸乙酯組分與烘箱中揮發(fā)干凈至恒重即可。
1.7樣品復(fù)溶
用DMSO溶解1.6中各組分固體至濃度為10mg/mL，稀釋至一定濃度梯度用于后續(xù)功效的評價，其中濃度1mg/mL分別用于胰脂肪酶抑制、α 葡萄糖苷酶抑制和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制實驗。
1.8降三高實驗方案
1.8.1α 糖苷酶抑制率
(1)試劑準(zhǔn)備
0.1mol/LNa2CO3：稱量2.1198gNa2CO3固體溶于200mL蒸餾水中；
25mMpH＝6.9PBS：稱量4.477g十二水合磷酸氫二鈉和1.95g二水合磷酸二氫鈉分別溶于500mL蒸餾水中，混勻后將ph調(diào)節(jié)至6.9；
1×10 3mg/mLα glucosidase(sigma)：先稱量1mg/mL的酶，再逐步進(jìn)行稀釋；(低溫保存)
5mmol/Lp NPG溶液：稱量0.151g對硝基苯 α D 吡喃葡萄糖苷(索萊寶)溶于100mLPBS中，混勻。
對硝基苯 α D 吡喃葡萄糖苷：α 葡萄糖苷酶的底物；
(2)具體實驗過程
將0.2mL的樣品與1mL的1×10 3mg/mL的α 葡萄糖苷酶溶液于37℃水浴中混合反應(yīng)10min，再加入0.5mL5mmol/L的p NPG溶液于37℃水浴中混合反應(yīng)10min，后加入0.1mol/L的Na2CO3(1mL)溶液終止反應(yīng)，在405nm處的吸光度進(jìn)行測定。按下列公式計算α 葡萄糖苷酶抑制率。
陽性對照：阿卡波糖
其中，所用的樣品為采用黑曲霉發(fā)酵后的羅布紅麻醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分以及水組分，以及未進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵的羅布紅麻直接進(jìn)行醇提的醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分。
抑制率(％)＝[1 (A4 A3)/(A2 A1)]×100％
對照背景組A1：底物(p NPG)
對照組A2：酶和底物(p NPG)
實驗背景組A3：樣品+底物(p NPG)
實驗組A4：實驗組
總體系為2.7mL，不足的加入PBS配平。具體組成參見表1
表1
(3)實驗結(jié)果
參見圖2，圖2為黑曲霉發(fā)酵前后，羅布紅麻醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分對α 葡萄糖苷酶抑制活性。由圖2可知，在1mg/mL樣品濃度下，羅布紅麻醇提物的石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分的α 葡萄糖苷酶抑制活性分別為55.45％、97.48％和61.27％。經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，羅布紅麻醇提物的石油醚組分和水組分的抑制活性分別顯著提高了29.64％和16.00％。而與未發(fā)酵組相比，乙酸乙酯組分經(jīng)發(fā)酵后對α 葡萄糖苷酶的抑制作用沒有明顯變化。
1.8.2胰脂肪酶抑制率
(1)試劑準(zhǔn)備
4 硝基苯丁酸酯(p NPB)購自麥克林
豬胰脂肪酶購自索萊寶
十二水合磷酸氫二鈉購自湖南匯虹試劑有限公司
二水合磷酸二氫鈉購自湖南匯虹試劑有限公司
(2)試劑配制：
25mMpH＝7.4PBS：稱量4.477g十二水合磷酸氫二鈉和1.95g二水合磷酸二氫鈉分別溶于500mL蒸餾水中，混勻后將pH調(diào)節(jié)至7.4；
5mg/mL胰脂肪酶：稱取50mg的胰脂肪酶溶于50mL的無菌水中，然后8000r離心5min，棄沉淀取上清，酶置于冰盒中使用；
11.2mol/Lp NPB溶液的配制：用移液槍吸取0.11715gp NPB溶液溶于50mLPBS中，置于冰盒中備用
(3)實驗過程
將50μL樣品、50μL胰脂肪酶、50μLPBS混合，并置于37℃水浴鍋中孵育10min，再加入50μLp NPB溶液，輕輕震蕩混勻，置于37℃水浴鍋中孵育20min，于405nm波長測定吸光度并記錄數(shù)值。
其中，所用的樣品為采用黑曲霉發(fā)酵后的羅布紅麻醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分以及水組分，以及未經(jīng)黑曲霉發(fā)酵的羅布紅麻直接進(jìn)行醇提的醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分。
抑制率(％)＝[1 (A4 A3)/(A2 A1)]×100％
對照背景組A1：底物(p NPB)
對照組A2：酶和底物(p NPB)
實驗背景組A3：樣品+底物(p NPB)
實驗組A4：實驗組
總體系為200μL，不足的加入PBS配平。具體組成參見表2
表2
(4)實驗結(jié)果
參見圖3，圖3為黑曲霉發(fā)酵前后，羅布紅麻醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分對胰脂肪酶的抑制活性。由圖3可知，在1mg/mL樣品濃度下，羅布紅麻醇提物的石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分對胰腺脂肪酶抑制活性分別為4％、26％和2％。黑曲霉發(fā)酵可提高各組分對胰腺脂肪酶抑制活性。黑曲霉發(fā)酵6天后，羅布紅麻醇提物的乙酸乙酯組分的胰脂肪酶抑制活性增加了28％。
1.9抗氧化實驗
(1)實驗方法
一、羥自由基清除能力的測定
1.試劑
(1)FeSO4溶液：稱0.1668g綠礬用少量純水溶解，并定容在100mL容量瓶中，備用，最好避光保存。
(2)H2O2溶液：量取30％的H2O2溶液0.6mL，加水定容至1L。(注：30％表示質(zhì)量分?jǐn)?shù))
(3)稱0.0828g水楊酸用少量無水乙醇溶解，并定容到100mL容量瓶中，備用。
2.步驟
實驗組：
(1)向其中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵2mL，6mmol/L樣品2mL和6mmol/L的過氧化氫2mL；
(2)加入完成后震蕩搖勻，靜置10min；
(3)10min后加入6mmol/L的水楊酸溶液；
(4)加入后，振蕩搖勻，靜置30min。
其中，所用的樣品為采用黑曲霉發(fā)酵后的羅布紅麻醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分以及水組分，以及未經(jīng)黑曲霉發(fā)酵的羅布紅麻直接進(jìn)行醇提的醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分。
對照組：將實驗組第一步中加入的樣品溶液使用等量的蒸餾水替代，其他條件不改變.
3.測定
在510nm光度下測量吸光度，實驗組為AX，對照組為A0
4.羥自由基清除率＝1 AX/A0
二、總還原力
1.試劑
(1)pH＝6.60.2mol/L的PBS緩沖液：
A液：0.2mol/L，磷酸二氫鈉(NaH2PO)，稱取6.24g的二水磷酸二氫鈉(M＝156.01g/mol)溶解于200mL蒸餾水中；
B液：0.2mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，稱取14.32g磷酸氫二鈉(M＝358.14g/mol)溶解于200mL蒸餾水中。
取62.5mL的A液與37.5mL的B液混合即可。或者取2.685g十二水磷酸氫二鈉，1.95g二水磷酸二氫鈉，直接溶解在100mL純水中。
(注：PBS易變質(zhì)，應(yīng)滅菌，滅菌后應(yīng)該分瓶保存，開封后使用時間不應(yīng)超過一周可以滅菌，也可以不滅)
(2)1％的鐵氰化鉀溶液：1g鐵氰化鉀用純水溶解并定容至100mL。
(3)0.1％的三氯化鐵溶液：0.1g的三氯化鐵用純水溶解并定容至100mL。
(4)10％的三氯乙酸：稱10g三氯乙酸固體用純水溶解并定容至100mL。
2.過程
實驗組：
提前打開水浴鍋調(diào)至50℃?zhèn)溆?/span>
(1)移取1mL樣品于10mLEP管中；
(2)隨即快速加入2.5mL0.2mL/L的PBS溶液和2.5mL1％的鐵氰化鉀溶液；
(3)混勻后于50℃水浴鍋中保溫20min；
(4)取出后，加入2.5mL10％的三氯乙酸溶液；
(5)加入三氯乙酸后若產(chǎn)生沉淀，則室溫下3500r/min離心10min，吸取2.5mL的上清液，加入2.5mL蒸餾水；若加入三氯乙酸后無沉淀產(chǎn)生，吸取2.5mL溶液后加入2.5mL蒸餾水；
(6)加入0.5mL0.1％的三氯化鐵溶液，混勻后反應(yīng)10min。
其中，所用的樣品為采用黑曲霉發(fā)酵的醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分以及水組分，以及未經(jīng)黑曲霉發(fā)酵的羅布紅麻直接進(jìn)行醇提的醇提物、石油醚組分、乙酸乙酯組分和水組分。
3.處理
在700nm光度下測定吸光值，實驗組與對照組的吸光度大小與還原力成正比。
三、ABTS自由基清除能力
1.試劑：7.4mmol/LABTS：取ABTS3mg加蒸餾水0.735mL(M＝548.7g/mol)；2.6mmol/LK2S2O8，取K2S2O81mg，加蒸餾水1.43mL(M＝270.32g/mol)。
2.步驟
取7.4mmol/LABTS0.2mL與2.6mmol/LK2S2O80.2mL混合，在室溫條件黑暗處反應(yīng)12小時。反應(yīng)完成后用體積分?jǐn)?shù)95％的乙醇稀釋40～50倍，使得混合液在735nm光度下吸收值處于0.68 0.72間即可使用(工作液)。
實驗組：取0.8mL稀釋后的工作液于2mLEP管中，加入樣品溶液0.2mL，搖勻后靜置反應(yīng)6min.6min后在734nm波長下測定吸光值A(chǔ)。
對照組：取0.8mL稀釋后的工作液于2mLEP管中，加入95％乙醇0.2mL，搖勻后靜置反應(yīng)6min.6min后在734nm波長下測定吸光值A(chǔ)0。
3.處理
清除率＝1 A/A0
四、DPPH自由基的清除率
1、試劑
(1)0.2mmol/L的DPPH(1，1 二苯基 2 三硝基苯肼)，M＝394.32g/mol，取78.864mgDPPH用無水乙醇定容至100mL，得到2mmol/L的母液，后根據(jù)需要繼續(xù)用乙醇稀釋10倍。
2、步驟
(1)實驗組
在2mLEP管中加入1mL0.2mmol/L的DPPH+1mL樣品溶液，室溫下靜置30min后，在517nm波長下測定吸光度.得到吸光度Ai.
在2mLEP管中加入1mL0.2mmol/L的無水乙醇和1mL樣品溶液，室溫下靜置30min后，在517nm波長下測定吸光度.得到吸光度Aj.
(2)對照組
在2mLEP管中加入1mL0.2mmol/L的DPPH和1mL無水乙醇，室溫下靜置30min后，在517nm波長下測定吸光度.得到吸光度A0。
3、處理
DPPH清除率＝1 (Ai Aj)/A0
(2)實驗結(jié)果
實驗結(jié)果參見表2、表3和圖4。圖4為黑曲霉發(fā)酵6天后羅布紅麻不同組分抗氧化能力比較。
表2不同菌株發(fā)酵羅布紅麻后總多酚和總黃酮含量的變化情況
表3黑曲霉發(fā)酵羅布紅麻不同時期后總多酚和總黃酮含量的變化情況
選擇合適的微生物是羅布紅麻發(fā)酵的關(guān)鍵步驟。通過測定總多酚和總黃酮含量，研究了不同真菌對羅布紅麻發(fā)酵的影響。本研究采用米曲霉、黑曲霉和紅曲酶發(fā)酵羅布紅麻，發(fā)酵時間為6天。從表2可以看出，黑曲霉發(fā)酵后的總多酚(1.67mg/mL)和總黃酮(0.44mg/mL)均最高。因此，選擇了黑曲霉作為后續(xù)實驗的最佳發(fā)酵真菌。
為了確定黑曲霉發(fā)酵羅布紅麻最佳時間，對黑曲霉發(fā)酵羅布紅麻3、6、9和12天進(jìn)行了取樣測定總多酚和總黃酮含量。表3顯示，總多酚和總黃酮含量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸增加。第6天，黑曲霉處理的總多酚和總黃酮含量分別為1.47mg/mL和0.46mg/mL。超過6天后，總多酚和總黃酮含量略有下降。因此，最佳發(fā)酵時間為第6天。
本研究采用DPPH、ABTS+、羥基自由基清除活性和總還原能力，測定了發(fā)酵前和發(fā)酵后的羅布紅麻中醇提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物以及水提物的總抗氧化活性。
發(fā)酵前和發(fā)酵后羅布紅麻不同組分對ABTS自由基清除率如圖4A所示。在發(fā)酵前的羅布紅麻各組分中，乙酸乙酯提取物組分的ABTS+自由基清除活性最高(100μg/mL為87.81％)，其次是水提物組分(100μg/mL為24.44％)。石油醚提取物組分的ABTS+自由基清除活性最低(100μg/mL時為5.28％)。與天然羅布紅麻提取物相比，發(fā)酵后乙醇提取物的ABTS+自由基清除率顯著提高了24.53％。
如圖4B所示，發(fā)酵前的羅布紅麻各個提取物組分對DPPH自由基的清除活性為：乙酸乙酯提取物(92.67％)>水提物(37.88％)>石油醚提取物(17.89％)，用黑曲霉發(fā)酵也增加了這四種亞組分的DPPH自由基清除率。
如圖4C所示，發(fā)酵前的羅布紅麻中的水提物組分的羥自由基清除活性最高(樣品濃度為1mg/mL時為44.53％)，其次是乙酸乙酯提取物組分的前羥自由基清除活性(9.28％)。石油醚組分清除率最低(3.76％)。與天然的羅布紅麻相比，發(fā)酵后乙酸乙酯組分的羥自由基清除活性也提高了56.27％。
從圖4D可以看出，乙酸乙酯組分的總還原力最高(OD700value＝0.6501±0.012)，其次是水提物組分(OD700value＝0.6031±0.011)。此外，對于極性最低的石油醚提取物，它的鐵還原能力非常低(OD700value＝0.5412±0.018)。發(fā)酵降低了羅布紅麻乙醇提取物和石油醚組分的總還原力。然而，與發(fā)酵組相比，乙酸乙酯組分和水提物組分的總還原力沒有明顯變化。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：謝純良，彭源德，朱作華，龔文兵，周映君，嚴(yán)理，胡鎮(zhèn)修，申請?zhí)枺?/font>202310168142.8，申請日：2023.02.10
