１．２．２ 致病性檢測

分生孢子液接種：選取新鮮健康的苧麻葉片（華苧 ４ 號），放入鋪有吸水紙的盤中擺放整齊，吸水紙經(jīng)滅菌水滋潤。 在每個葉片上滴加分生孢子液，每片葉片接 １０ 處，每處接種 ６ μＬ （ １ ×１０６ 個／ ｍＬ），３ 個重復(fù)，以清水作為對照組，用保鮮膜封盤并置于 ２８ ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中 １２ ｈ 光暗交替培養(yǎng)，連續(xù)觀察 １０ ｄ，記錄葉片發(fā)病情況。

菌絲塊接種：葉片選取同以上分生孢子液接種。 ＰＤＡ 平板上活化好的菌落用打孔器（ ｄ ＝６ ｍｍ）打取菌絲塊。 將菌絲塊面朝下接種到葉片上，每片葉片接 ５ ～ ６ 個菌絲塊，３ 個重復(fù)，清水作為對照，培養(yǎng)條件和觀察方法同分生孢子液接種。 葉片發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌，比較再分離菌株與接種菌株的一致性，完成柯赫氏法則的驗(yàn)證。

１．２．３ 病原菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將菌絲塊接種到 ＰＤＡ 平板上，在 ２８ ℃培養(yǎng)箱里黑暗培養(yǎng)，３ ｄ 后觀察并記錄菌落特征，主要包括菌落顏色、形態(tài)和生長情況。 在顯微鏡下觀察分生孢子、附著胞及孢子梗的形態(tài)，用顯微鏡及標(biāo)尺測量分生孢子的大小，并計算分生孢子的長寬比例，查閱真菌分離鑒定工具書，初步判定病菌的種類。

分子生物學(xué)鑒定：采用 ＣＴＡＢ 法提取病原菌 ＤＮＡ，用真菌核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄序列 ＩＴＳ 通用引物ＩＴＳ１（５’－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３’）和 ＩＴＳ４（５’－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’）［１７］、β－微管蛋白基因（ β －ｔｕｂｕｌｉｎ，ＴＵＢ２） 的 ＰＣＲ 擴(kuò)增引物 Ｔ１ （ ５’－ＡＡＣＡＴＧＣＧＴＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＧＴ － ３’） 和βｔ２ｂ （５’－ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＣ－３’）［１８]對目的基因區(qū)域進(jìn)行 ＰＣＲ 擴(kuò)增。 將 ＰＣＲ 產(chǎn)物純化后進(jìn)行 Ｔ 載體的連接和大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，并對質(zhì)粒進(jìn)行測序。 將所測得的序列在 ＮＣＢＩ 網(wǎng)站（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）進(jìn)行同源性比較，以近緣菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

２ 結(jié)果和分析

２．１ 苧麻炭疽病的田間癥狀

根據(jù)苧麻炭疽病田間癥狀觀察，從我國 ３ 個省份（湖北、湖南、江西）主要苧麻產(chǎn)區(qū)采集具有苧麻炭疽病癥狀的葉片。 對田間癥狀和采集的葉片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)苧麻炭疽病主要癥狀包括：染病葉片呈現(xiàn)典型的圓形病斑，病斑直徑 １～３ ｍｍ，病斑邊緣黑色，中央褐色，可擴(kuò)展，嚴(yán)重的呈中間凹陷壞死癥狀（圖 １－Ａ～ Ｃ）；葉片上具有大量小圓斑癥狀，病斑直徑＜１ ｍｍ，病斑中央灰白色，邊沿深褐色，擴(kuò)展有限（圖 １－Ｄ）；葉片上具有大量小圓斑癥狀，病斑直徑＜１ ｍｍ，可擴(kuò)展成片（圖 １－Ｅ）；葉片上具有黑色大斑，直徑＞５ ｍｍ，病斑擴(kuò)展成片（圖 １－Ｆ）。

２．２ 苧麻炭疽病病原菌致病性測定結(jié)果

本試驗(yàn)共分離 ８９ 個菌株，選取形態(tài)有差異且能在 ＰＤＡ 培養(yǎng)基上直接產(chǎn)生或者切斷菌絲后能誘導(dǎo)產(chǎn)生橘紅色分生孢子的 ２３ 個菌株進(jìn)行致病性測定。 先采用分生孢子接種法對菌株的致病性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，菌株大致有強(qiáng)致病性、弱致病性和無致病性 ３ 類（圖 ２）。 ２３ 個菌株中有４個菌株可以引起“華苧 ４ 號”發(fā)病，其中，強(qiáng)致病性菌株占總測試菌株的 ６１％。 強(qiáng)致病性菌株接種葉片 ３ ｄ 后，葉片上接種點(diǎn)開始出現(xiàn)病斑，隨著培養(yǎng)時間的延長病斑變大，擴(kuò)大成片，最后整個葉片

退綠，腐爛（圖 ２－Ａ１～Ａ４）；第二類弱致病性菌株，接種葉片 ３ ｄ 后出現(xiàn)病斑，隨著培養(yǎng)時間的延長，壞死部位沒有繼續(xù)惡化，１０ ｄ 后葉片仍然完好（圖 ２－Ｂ１ ～ Ｂ４）；第三類菌株接種后葉片沒有受感

染，葉片表面未見任何病斑（圖 ２－Ｃ１～ Ｃ４ ）。

將致病性強(qiáng)的菌株用菌絲片法再次進(jìn)行致病性檢測。 結(jié)果顯示，接種 ３ ｄ 后接種處開始發(fā)病，初為褐色斑點(diǎn)（圖 ３－Ａ），接種 ７ ｄ 后病斑顏色加深并擴(kuò)展為圓形，有的病斑連成片導(dǎo)致葉片腐爛（圖 ３－Ｂ）。 從病組織再分離的病原菌與接種用的菌株形態(tài)上一致。

２．３ 苧麻炭疽病菌的形態(tài)特征及分類地位

２．３．１ 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

苧麻炭疽病菌在 ＰＤＡ 培養(yǎng)基上菌落呈圓形，菌落邊緣整齊。 菌絲匍匐狀，稀疏至茂密，大部分菌株菌絲最初為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長慢慢變?yōu)榈疑械氖呛稚?、墨綠色（圖 ４－Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１）。 分生孢子橘紅色，有的點(diǎn)狀分布，有的成片分布，分生孢子單胞，無色透明，卵圓形，有的內(nèi)含油球（圖 ４－Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｃ３、Ｄ２）。 有的菌株具黑色或者褐色剛毛，有分隔，頂端尖銳（圖 ４－Ｄ３）。 分生孢子梗簇生或單生，無色或淡褐色，直或彎曲，具分隔，基部略膨大。 菌絲有隔，直徑２．５５～３．８３ μｍ，平均 ３．０１ μｍ。 孢身大小及孢子長寬比例見表 １。 查閱真菌鑒定手冊，根據(jù)病菌形態(tài)特征，初步判定苧麻炭疽菌病原為膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ（膠孢炭疽菌剛毛少，分生孢子圓筒形，（１１～１８）μｍ×（４～６）μｍ）和希金斯炭疽菌 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ（希金斯炭疽菌分生孢子盤上有剛毛數(shù)根，分生孢子長橢圓或圓筒形，兩端鈍圓，無色，單胞，（１５～２１）μｍ×（３．０～５．５）μｍ）。

表１ 苧麻炭疽菌代表性菌株分生孢子大小測定

２．３．２ 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

選取具有正常致病力且經(jīng)過柯赫氏法則驗(yàn)證的 １４ 個菌株進(jìn)行 ＩＴＳ 基因克隆和測序，將分離菌株的測序結(jié)果在 ＧｅｎＢａｎｋ 中進(jìn)行 ＢＬＡＳＴ 比對。 比對結(jié)果顯示，菌株與膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉ?ｏｉｄｅｓ、果生炭疽菌 Ｃ． ｆｒｕｃｔｉｃｏｌ、暹羅炭疽菌 Ｃ． ｓｉａｍｅｎｓｅ 和希金斯炭疽菌 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ 的同源性達(dá)９７％ ～９９％（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＦＪ５１５００５、ＦＪ４５９９３０、ＨＭ０１６７９８、ＡＢ０４２３１７．１、ＧＵ９３５８７２．１）。 而且序列比對中發(fā)現(xiàn)，Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃ． ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｃ． ｓｉａｍｅｎｓｅ 和 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ 這 ４ 類植物炭疽菌病原的 ＩＴＳ 序列本身同源性高達(dá) ９９％，單通過 ＩＴＳ 基因無法將菌株鑒定到種。

進(jìn)一步對測試菌株進(jìn)行 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 基因的克隆。 表 ２ 中列舉了菌株的來源和 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 基因在ＮＣＢＩ 上的登錄號。 將分離菌株的 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 基因測序結(jié)果在 ＧｅｎＢａｎｋ 中進(jìn)行 ＢＬＡＳＴ 比對，查找相似物種的 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 序列，使用 ＭＥＧＡ ７．０ 最大似然法對相似性較高的菌株及同屬不同種菌株進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析（圖 ５）。 結(jié)果顯示，從湖南采集的菌株中鑒定出 ３ 個炭疽菌屬的病菌：Ｃ． ｆｒｕｃｔｉ?ｃｏｌａ、Ｃ． ｓｉａｍｅｎｓｅ 和 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ；湖北武漢的材料中包括種 Ｃ． ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ 和 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ；江西的菌株中，并未分離到 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ，分離的菌株為 Ｃ． ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ 和 Ｃ． ｓｉａｍｅｎｓｅ。 采自湖北咸寧的材料，通過 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 比對，與人參生刺盤孢 Ｃ． ｐａｎａｃｉｃｏｌａ 和希金斯炭疽菌 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ 的同源性都為 ９９％，而這兩個病原菌屬于 Ｃ． ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ 復(fù)合群，所以分子序列上同源性很高。 真菌鑒定手冊記載希金斯炭疽菌 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ 分生孢子盤上有剛毛數(shù)根，分生孢子圓筒形，（１５～２１）μｍ×（３．０～５．５）μｍ。 本試驗(yàn)中分離自咸寧的菌株其分子孢子特性（圖 ４－Ｄ１～ Ｄ３，表 １）與 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ 的描述一致，再結(jié)合分子檢測的結(jié)果，判定分離自咸寧的菌株屬于 Ｃ． ｈｉｇ?ｇｉｎｓｉａｎｕｍ。

表２ 基于 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析所用菌株信息

３ 討論與結(jié)論

苧麻炭疽病由植物炭疽菌屬（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｈｒｉｃｈｃｕｍ ｓｐｐ．）真菌引起。 該屬真菌是一類全球性分布的重要植物病原菌，被列為全球第八大植物病原真菌［１９］。 目前已報道約 １７６ 屬 １９０ 余種植物可被炭疽菌侵染［２０］。 炭疽菌類真菌命名方式和系統(tǒng)分類方法發(fā)生過數(shù)次重大的變更，存在種間性狀交叉和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不清的問題。 １８３１—１９５７ 年，其分類依據(jù)主要以寄主范圍為主，即只要從一種尚未報道的寄主上分離獲得該屬真菌，即被視為新種。 該時期至少 ７５０ 個新種被描述，導(dǎo)致許多物種同物異名。 Ｖｏｎ Ａｒｘ 發(fā)現(xiàn)該屬真菌分類混亂，依據(jù)分生孢子和產(chǎn)孢細(xì)胞等顯微形態(tài)特征，并結(jié)合純培養(yǎng)特征，將 ７５０ 多個種合并為 １１ 個種［２１］。 Ｓｕｔｔｏｎ 在 Ｖｏｎ Ａｒｘ 的分類基礎(chǔ)上，于 １９６２—１９９２ 年，以分生孢子和附著胞形態(tài)特征，結(jié)合純培養(yǎng)物特征和寄主范圍，把該屬擴(kuò)展到包含部分復(fù)合種的３９ 個種［２２］。 ２００９—２０１９ 年，Ｄａｍｍ 等［２３－２４］分別對存在爭議的種的混亂問題又進(jìn)行整理。 目前，炭疽菌屬共包括 １４ 個復(fù)合種，其中 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ 復(fù)合種包括 ３８ 個近似的物種［２５］，近年又?jǐn)U展至２２ 個復(fù)合種［２６］。

準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定病害的病原菌是制定病害有效防御策略的基礎(chǔ)。 對病原真菌的鑒定，常以純培養(yǎng)物上產(chǎn)生的分生孢子、附著胞、分生孢子梗和產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)和大小等特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定［２７］。 對于特征明顯的炭疽菌種采用形態(tài)學(xué)能夠容易被鑒定出來，但是某些近似炭疽菌種卻難以準(zhǔn)確區(qū)分，比如 Ｌｉｕ 等［２８]認(rèn)為膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、暹羅炭疽 Ｃ． ｓｉｍｅｎｓｅ 和果生炭疽菌Ｃ． ｆｒｕｔｉｃｏｌａ等一些近種，其菌落形態(tài)存在細(xì)微差異，單依據(jù)分生孢子形態(tài)和大小很難明顯區(qū)分，并且一些菌株形態(tài)學(xué)特征不夠穩(wěn)定，易受培養(yǎng)條件的影響。 真菌的分子鑒定是從基因水平上反映菌株間遺傳特性，ＤＮＡ 序列特征不會隨環(huán)境的改變而變化，特異性高，準(zhǔn)確可靠，借助分子手段進(jìn)行輔助鑒定可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足［２９］。 除病毒以外，所有生物都具有核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ＩＴＳ 序列）區(qū)段的基因，該序列種間高度保守，可作為研究生物系統(tǒng)進(jìn)化及分類的依據(jù)［３０］。 另外基于膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ 復(fù)合種的病原種類多，單選用 ＩＴＳ 序列可能無法對小種進(jìn)行有效的區(qū)分。 目前，基于多基因序列分析，將 ＩＴＳ 基因、肌動蛋白基因（Ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ，ＡＣＴ）［３０］和 β－微管蛋白基因（β－ｔｕｂｕｌｉｎ，ＴＵＢ２）［３１］、幾丁質(zhì)合成酶 Ａ 基因（ ｃｈｉｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ａ ｇｅｎｅ，ＣＨＳ１）等［３２]序列進(jìn)行聯(lián)合分析用于炭疽菌的分子鑒定，能較好地區(qū)分炭疽菌屬真菌的大部分種。

本研究對采集自我國苧麻主產(chǎn)區(qū)的苧麻炭疽病病株進(jìn)行病原菌的分離，首先通過形態(tài)學(xué)對分離的病菌進(jìn)行分析，初步判定引起苧麻炭疽病病原是刺盤孢菌屬中的膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉ?ｏｉｄｅｓ。 通過對 ＩＴＳ 序列的克隆發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、果生炭疽菌 Ｃ． ｆｒｕｃｔｉｃｏｌ、暹羅炭疽菌 Ｃ． ｓｉａｍｅｎｓｅ 和希金斯炭疽菌 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ ４ 類炭疽菌的 ＩＴＳ 序列本身有很高的同源，甚至同源性達(dá) ９９％，單通過 ＩＴＳ 基因無法將菌株進(jìn)行鑒定到種。 所以通過本研究可以推斷 ＩＴＳ 序列無法對引起苧麻炭疽病的病原菌鑒定到種。 進(jìn)一步通過微管蛋白 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 基因的克隆和肌動蛋白基因（Ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ，ＡＣＴ）（結(jié)果未顯示）的克隆多基因聯(lián)合分析，結(jié)果確定引起苧麻炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ［３３］、果生炭疽菌 Ｃ． ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、暹羅炭疽菌 Ｃ． ｓｉａｍｅｎｓｅ 和希金斯炭疽菌Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ［３４］。 微管蛋白 β－ｔｕｂｕｌｉｎ 基因的克隆和肌動蛋白基因（Ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ，ＡＣＴ）可以對苧麻炭疽菌進(jìn)行小種間的鑒定。 依據(jù)新的炭疽菌種的分類方法，膠孢炭疽菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、果生炭疽菌 Ｃ． ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、暹羅炭疽菌 Ｃ． ｓｉａｍｅｎｓｅ 隸屬于膠孢炭疽菌復(fù)合群 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ，希金斯炭疽菌 Ｃ． ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ 屬于毀滅炭疽菌 Ｃ． ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ 復(fù)合群。

本研究對我國苧麻主產(chǎn)區(qū)湖北省、湖南省和江西省的苧麻炭疽病病原菌進(jìn)行了分離和鑒定，為病菌生物學(xué)特性及其致病基因的研究奠定了基礎(chǔ)。 鑒定出的 ４ 類病原菌在苧麻上引起病害的發(fā)生規(guī)律以及各苧麻生長地區(qū)中優(yōu)勢種群和病菌的致病基因、致病力分化、遺傳多樣性等還需要進(jìn)一步研究和分析。 對病原菌進(jìn)行基因組測序，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行組學(xué)序列分析、基因功能注釋和比較基因組學(xué)分析，是研究植物病原菌間基因變異重組、突變以及插入／ 缺失、遺傳多樣性、致病力分化機(jī)制的有效方法［３５］。 全基因組分析已用于柑橘潰瘍病菌、水稻稻瘟病菌、芽孢桿菌、芒果炭疽菌等多種病原菌的基因組分析。 大量病原菌全基因組測序及比較基因組研究文獻(xiàn)和炭疽菌全基因組序列數(shù)據(jù)，將有助于苧麻炭疽菌基因組測序、組裝和功能基因的預(yù)測。

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文章摘自：王緒霞，湯滌洛，彭洪翠等.苧麻炭疽病病原菌的分離與鑒定[J].中國麻業(yè)科學(xué)，2023，45(02)：88-96.