摘 要：KH結(jié)構(gòu)域蛋白參與調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間、花器官形成、葉發(fā)育、miRNA產(chǎn)生和對(duì)生物非生物脅迫的響應(yīng)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AhKH1775可能參與調(diào)控劍麻株芽的發(fā)育，但是其調(diào)控機(jī)制仍不清楚。KH結(jié)構(gòu)域蛋白可以通過(guò)復(fù)合體的方式參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。為獲得與AhKH1775相互作用的蛋白，本研究克隆AhKH1775的完整編碼框，構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體，并檢測(cè)誘餌載體的毒性和自激活性?？寺～@得一個(gè)918bp的編碼框，成功構(gòu)建了誘餌載體，誘餌載體無(wú)毒性，但存在自激活性，25mmol/L的3-AT可以抑制誘餌載體的自激活性。結(jié)果為進(jìn)一步篩選與AhKH1775相互作用的蛋白和深入研究AhKH1775在劍麻中的功能提供依據(jù)基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：劍麻；KH結(jié)構(gòu)域；基因克隆；酵母雙雜交；誘餌載體
KH結(jié)構(gòu)域首次在人類(lèi)的核不均一性核糖核蛋白K(humanheterogeneousnuclearribonucleoproteinK，hnRNPK)蛋白中被鑒定(Siomietal.，1993)，該結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)高度保守 啊·VIGxxGxxI基序(Christopheretal.，1994)。TypeI型KH結(jié)構(gòu)域分成4個(gè)亞類(lèi)：vigilin類(lèi)，poly-nucleotidephosphorylase(PNPase)類(lèi)，poly(C)-bindingprotein(PCBP)類(lèi)和splicingfactor1(SF1)類(lèi)(Buckneretal.，2008)KH結(jié)構(gòu)域廣泛分布于細(xì)菌和真核生物的核糖體蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等蛋白中，擬南芥中發(fā)現(xiàn)26個(gè)KH結(jié)構(gòu)域的蛋白(Lorkovi?andBarta，2002)。含KH結(jié)構(gòu)域的蛋白參與了植物多個(gè)生理事件。調(diào)控植物發(fā)育，如HEN4(含一個(gè)KH結(jié)構(gòu)域)與HUA1相互作用(細(xì)胞核內(nèi)CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合蛋白)促進(jìn)AGAMOUS類(lèi)MADS基因的pre-mRNA加工，參與花形態(tài)建成(Chengetal.，2003)；FLC(KH結(jié)構(gòu)域蛋白)通過(guò)上調(diào)FLC(MADS-box家族基因)基因表達(dá)，影響開(kāi)花時(shí)間(Daietal.，2020)；PEP(含有三個(gè)KH結(jié)構(gòu)域)負(fù)調(diào)控FLC表達(dá)，抑制開(kāi)花(Ripolletal.，2009)。介導(dǎo)生物非生物脅迫，如KH結(jié)構(gòu)域蛋白FLK介導(dǎo)水楊酸和活性氧信號(hào)，調(diào)控植物對(duì)病原菌的防御(Fabianetal.，2021)；typII型KH結(jié)構(gòu)域蛋白、葉綠體核酸內(nèi)切酶UVI31響應(yīng)紫外光脅迫(Routetal.，2018)；RCF3(含有多個(gè)KH結(jié)構(gòu)域)與CPL1相互作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，響應(yīng)冷脅迫(Jeongetal.，2013)；免疫負(fù)調(diào)控蛋白StKH17(KH結(jié)構(gòu)域蛋白)與免疫正調(diào)控蛋白StPUB17(E3連接酶)結(jié)合，并被蛋白酶體降解(Mclellanetal.，2020)。調(diào)節(jié)植物miRNA的產(chǎn)生，如RCF3與CPL1和CPL2相互作用，調(diào)控HYL1活性(Karlssonetal.，2015)。劍麻是天門(mén)冬科單次開(kāi)花多年生植物，可進(jìn)行有性和無(wú)性繁殖，以應(yīng)對(duì)極端干旱和高溫的環(huán)境(Davisetal.，2019)。花脫落后發(fā)育的株芽是劍麻無(wú)性繁殖的主要形式，單株可形成幾百至上千顆株芽(Tookeetal.，2005)。株芽在母株上發(fā)育形成完整的根莖葉結(jié)構(gòu)，這種繁殖方式在自然界較少見(jiàn)，目前對(duì)株芽的發(fā)育機(jī)制了解的還不多。已有研究報(bào)道classI類(lèi)KNOX基因參與了劍麻株芽的發(fā)育，在株芽發(fā)育的起始階段AhKNOX2會(huì)上調(diào)表達(dá)(Abraham-Juárezetal.，2010)。所以我們用AhKNOX2為誘餌從劍麻酵母cDNA表達(dá)文庫(kù)中獲得一個(gè)含有KH結(jié)構(gòu)域的互作蛋白，命名為AhKH1775(Yang et al.，2020)。KH結(jié)構(gòu)域蛋白參與植物發(fā)育，推測(cè)AhKH1775可能參與了劍麻株芽的發(fā)育，但是其具體的調(diào)控機(jī)制還不清楚。鑒于已發(fā)現(xiàn)含有KH結(jié)構(gòu)域的蛋白能形成蛋白復(fù)合體發(fā)揮調(diào)控作用，本研究克隆了AhKH1775基因的完整編碼框，構(gòu)建了AhKH1775的酵母雙雜交誘餌載體，并檢測(cè)其毒性和自激活性。結(jié)果為下一步篩選與AhKH1775相互作用的蛋白提供研究基礎(chǔ)。
1結(jié)果與分析
1.1生物信息分析
生物信息學(xué)分析顯示，KH1775基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為918bp，編碼氨基酸280個(gè)，分子量為31.017kD、等電點(diǎn)為8.83。KH1775蛋白的親水性數(shù)值為負(fù)值，說(shuō)明KH1775蛋白為疏水性蛋白(表1)。通過(guò)在線網(wǎng)站NCBI中的Conserved Domains做保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，KH1775蛋白的132~232個(gè)氨基酸之間含有一個(gè)KH-I_SPIN1_like結(jié)構(gòu)域，表明它屬于KH-Ⅰ超家族(圖1)，通過(guò)protein BLAST進(jìn)行比對(duì)，在比對(duì)結(jié)果中選取相似性高且含有KH-Ⅰ結(jié)構(gòu)域的9個(gè)其他物種序列下載保存。使用DNAMAN軟件，對(duì)KH1775蛋白和9個(gè)其他物種的KH蛋白序列進(jìn)行同源性分析，顯示，KH1775蛋白與Asparagusofficinalis(XP_020241251.1)聚為一支(圖2A)，說(shuō)明劍麻中的KH1775蛋白在同源性上與蘆筍中的XP_020241251.1最為接近，通過(guò)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2B)，我們發(fā)現(xiàn)Asparagusofficinalis(XP_020241251.1)同樣與KH1775蛋白聚為一支，說(shuō)明他們?cè)谶M(jìn)化關(guān)系上最為相似。
表1 KH1775 基因理化性質(zhì)
圖1 KH1775蛋白保守結(jié)構(gòu)域
1.2AhKH1775編碼框擴(kuò)增及鑒定
通過(guò)分析基因組序列，發(fā)現(xiàn)AhKH1775完整編碼框長(zhǎng)度為918bp。通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期長(zhǎng)度一致的DNA片段(圖3A)。將測(cè)序序列與基因組序列比對(duì)，結(jié)果表明克隆序列與基因序列一致(圖4)。
1.3誘餌載體的構(gòu)建及鑒定
利用相同的限制性內(nèi)切酶處理目的片段和pGBKT7載體，并將片段連接至pGBKT7載體多克隆位點(diǎn)。EcoRⅠ和BamHⅠ的雙酶切顯示，酶切產(chǎn)物出現(xiàn)大的載體條帶和小的目標(biāo)序列條帶，目標(biāo)序列條帶和預(yù)期一致(圖3B)；測(cè)序序列與克隆序列一致。表明成功構(gòu)建了誘餌載體。
圖2 不同物種的KH蛋白的同源樹(shù)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
圖3 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)和重組質(zhì)粒PGBKT7-AhKH1775酶切鑒定
注:M:DL2000DNAMarker;M*:DL5000DNAMarker;1:PCR產(chǎn)物;2:重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物
圖4 基因KH1775序列
1.4誘餌載體毒性檢測(cè)
將攜帶誘餌載體的酵母菌和攜帶空載體PGBKT7的酵母菌分別涂布于SD/-Trp固體平板和接種液體SD/-Trp培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)，結(jié)果顯示，攜帶pGBKT7-AhKH1775重組載體的酵母菌與對(duì)照在SD/-Trp固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)大小無(wú)差異(圖5A)；攜帶pGBKT7-AhKH1775重組載體的酵母菌與對(duì)照在液體SD/-Trp培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致(圖5B)。結(jié)果說(shuō)明pGBKT7-AhKH1775對(duì)酵母菌沒(méi)有毒性。
圖5 pGBKT7-AhKH1775誘餌載體毒性檢測(cè)
注:A:酵母菌在SD/-Trp平板上的生長(zhǎng)情況;B:酵母菌的生長(zhǎng)曲線
1.5誘餌表達(dá)載體自激活檢測(cè)
為檢驗(yàn)誘餌載體的自激活活性，我們將攜帶pGBKT7-AhKH1775重組載體的酵母菌和三種對(duì)照(空載體對(duì)照,陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照)的酵母菌分別涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固體平板。結(jié)果表明，攜帶pGBKT7-AhKH1775重組載體的酵母菌可以在SD/-Trp和SD/-Trp/-His上生長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌載體有自激活性(圖6)。
圖6 pGBKT7-AhKH1775自激活檢驗(yàn)
1.63-AT抑制濃度篩選
為了篩選最佳3-AT抑制濃度，將攜帶pGBKT7-AhKH1775重組載體的酵母菌分別涂布于含0、5、10、25和50mmol/L3-AT的SD/-Trp/-His平板。結(jié)果顯示攜帶pGBKT7-AhKH1775重組載體的酵母菌可以在0、5和10mmol/L的SD/-Trp/-His平板上生長(zhǎng)，而在25和50mmol/L的SD/-Trp/-His平板不生長(zhǎng)(圖7)。說(shuō)明25mmol/L的3-AT就能抑制誘餌載體的自激活活性。
圖7 不同濃度3-AT下酵母菌生長(zhǎng)狀況
2討論
現(xiàn)有研究報(bào)道KH結(jié)構(gòu)域蛋白參與調(diào)控植物開(kāi)花、花器官的形成和葉發(fā)育等事件。在擬南芥中，HEN4蛋白可以促進(jìn)AGAMOUS類(lèi)MADS基因的pre-mRNA 加工，影響花器官發(fā)育(Cheng et al.,2003)；PEP蛋白能夠在調(diào)控營(yíng)養(yǎng)器官生長(zhǎng)以及雌蕊發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Ripoll et al.,2006)。研究發(fā)現(xiàn)，KH結(jié)構(gòu)域蛋白可以通過(guò)蛋白質(zhì)間相互作用來(lái)行使其功能。擬南芥和玉米的 SF1-like KH結(jié)構(gòu)域蛋白被命名為Roughsheath2-Interacting KH domain (RIK)蛋白，玉米RIK蛋白可以與Maize rough sheath 2(RS2)相互作用，而擬南芥RIK可以與asymmetric leaf1(AS1)相互作用。玉米RS2又與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)缺陷同源蛋白A(cell cycleregulation defective homolog A,HIRA)相互作用，形成RIK-RS2/AS1-HIRA染色質(zhì)重塑復(fù)合物，抑制莖尖分生組織外圍區(qū)域內(nèi)的KNOX基因，是葉片正常發(fā)育所必需的(Buckner et al.,2008)，表明KH結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)控KNOX基因表達(dá)。劍麻AhKNOX2參與株芽發(fā)育，在株芽發(fā)育起始和發(fā)育階段上調(diào)表達(dá)(Abraham-Juárezet al.,2010)。我們以AhKNOX2為誘餌載體從劍麻cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選獲得一個(gè)KH結(jié)構(gòu)域蛋白(Yang et al.,2020)，暗示KH結(jié)構(gòu)域蛋白可與AhKNOX2直接相互作用。盡管如此，KH結(jié)構(gòu)域蛋白在劍麻中的功能依然知之甚少。
3材料與方法
3.1試驗(yàn)材料
酵母培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化試劑購(gòu)自Clontech公司；BamHⅠ、EcoRⅠ、pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。實(shí)驗(yàn)用的化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生物公司。PCR試劑購(gòu)自莫納生物公司。引物的合成及測(cè)序，由廣州艾基生物技術(shù)有限公司完成。
3.2生物信息學(xué)分析
將前期研究所得的KH1775基因序列用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸翻譯，并在NCBI上用ProteinBLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)，用Conserved Domains做保守結(jié)構(gòu)域分析，下載同源序列用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析并制作同源樹(shù)與進(jìn)化樹(shù)。利用在線軟件Expasy中的Protparam工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子式、分子量、理論等電點(diǎn)和親水性等基礎(chǔ)信息。
3.3AhKH1775編碼框的擴(kuò)增
設(shè)計(jì)特異引物(表2)，以劍麻主栽品種H.11684的mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用新合成的特異引物來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增AhKH1775的編碼框，反應(yīng)體系如下：2×PCRBuffer20μL，cDNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，用無(wú)菌水補(bǔ)齊至40μL。PCR程序擴(kuò)增為：94℃反應(yīng)3min；98℃反應(yīng)30s，58℃反應(yīng)30s，72℃反應(yīng)1min，35個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)5min。用1%瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序。
表2 實(shí)驗(yàn)所需引物
3.4誘餌載體pGBKT7-AhKH1775的構(gòu)建與鑒定
用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)pMD19-T-AhKH1775重組質(zhì)粒和pGBKT7載體分別進(jìn)行雙酶切，之后用NDA凝膠回收試劑盒(中科瑞泰)進(jìn)行回收純化，用SolutionⅠ試劑在16℃過(guò)夜連接，隨后將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，將含有轉(zhuǎn)化子的菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基上(含有50μg/mL的Kan抗生素)，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)(12h)過(guò)夜后，從培養(yǎng)基上挑取單菌落至含Kan的液體LB培養(yǎng)基中，200r/min振蕩培養(yǎng)12h左右，對(duì)其進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性菌液擴(kuò)大抽提質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序，序列結(jié)果比對(duì)正確則表明誘餌載體構(gòu)建成功。
3.5誘餌載體轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌株
參考Clontech酵母轉(zhuǎn)化手冊(cè)，采用LiAC法將pGBKT7-AhKH1775以及空載pGBKT7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在SD/-Trp平板上，30℃，倒置培養(yǎng)3d。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
3.6誘餌載體的毒性檢測(cè)
如果KH1775蛋白在酵母中表達(dá)的過(guò)程中產(chǎn)生對(duì)酵母的毒害作用，將對(duì)后續(xù)互作蛋白篩選產(chǎn)生影響，并且有毒性的蛋白，會(huì)使其酵母菌液OD600通常不超過(guò)1.0。所以我們將攜帶誘餌載體的酵母菌和攜帶空載體pGBKT7的酵母菌分別涂布于SD/-Trp固體平板，恒溫培養(yǎng)箱30℃，倒置培養(yǎng)3d。觀察酵母菌大小。并且我們將攜帶誘餌載體的酵母菌和攜帶空載體pGBKT7的酵母菌分別接種于5mLSD/-Trp液體培養(yǎng)基，200r/min，30℃振蕩培養(yǎng)。每隔4個(gè)小時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液OD600吸光度。
3.7誘餌載體的自激活檢測(cè)及3-AT抑制濃度篩選
在酵母文庫(kù)篩選試驗(yàn)中，如果不在前期進(jìn)行自激活檢測(cè)，而直接進(jìn)行文庫(kù)篩選，極有可能得到眾多的假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，增加后續(xù)處理數(shù)據(jù)的難度，并且影響試驗(yàn)結(jié)果的可信度。因此我們將攜帶誘餌載體的酵母菌和攜帶空載體pGBKT7的酵母菌涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固體平板，30℃，恒溫培養(yǎng)3d，檢測(cè)自激活活性。3-AT是組氨酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠抑制HIS3的泄露表達(dá)以及輕微自激活現(xiàn)象。如果誘餌載體存在自激活性，將其酵母菌涂布于含0、5、10、25和50mmol/L3-AT的SD/-Trp/-His平板，30℃，恒溫培養(yǎng)3d，觀察酵母是否有生長(zhǎng)。
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文章摘自：汪詢,楊倩,柯智,周文釗,楊子平,呂玲玲.劍麻AhKH1775基因克隆及其酵母雙雜交誘餌載體構(gòu)建[J/OL].分子植物育種:1-13[2022-11-12].http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20221008.1830.020.html
